Extracto
Antecedentes
XMRV (virus de la leucemia murina xenotropic relacionada con el virus) fue descubierta inicialmente en asociación con cáncer de próstata y más tarde con el síndrome de fatiga crónica (CFS). Su asociación con el síndrome de fatiga crónica es ahora ampliamente desacreditada, y los resultados actuales apoyan un origen laboratorio para XMRV sin evidencia reproducible para la infección de los seres humanos. Sin embargo, algunos resultados que indican la presencia de XMRV en el cáncer de próstata son difícil atribuir contaminación de la muestra. Aquí hemos buscado pruebas biológicas que podrían confirmar la presencia de XMRV en muestras de cáncer de próstata antes de haber dado positivo.
Métodos y Resultados
Hemos realizado pruebas para XMRV infecciosas y anticuerpos neutralizantes contra el XMRV en la sangre plasma de 29 sujetos con cáncer de próstata, y para XMRV infeccioso en las secreciones prostáticas de otros cinco sujetos con cáncer de próstata. Nueve de estos sujetos habían probado previamente positivos para XMRV por PCR o mediante un ensayo de virus. No se detectó XMRV o retrovirus relacionados en ninguna muestra, y las actividades de neutralización de las muestras de plasma eran todos muy bajo, un resultado incompatible con la infección por XMRV de los donantes de plasma.
Conclusiones
encontrar ninguna evidencia de infección por XMRV de cualquier sujeto humano probado, ya sea mediante el ensayo para el virus infeccioso o de anticuerpos neutralizantes. Nuestros resultados son consistentes con la mayoría de los estudios publicados sobre XMRV, que encuentran que XMRV no está presente en los seres humanos. La baja observada para la neutralización indetectable por XMRV plasma humano indica una falta de restricción innata de la replicación del XMRV por factores solubles en la sangre humana
Visto:. Mendoza R, Silverman RH, Klein EA, Miller AD (2012) No se Biológica La evidencia del XMRV en la sangre o de fluido prostático de pacientes con cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (5): e36073. doi: 10.1371 /journal.pone.0036073
Editor: Gilda Tachedjian, Burnet Institute, Australia |
Recibido: 9 Febrero 2012; Aceptado: March 25, 2012; Publicado: 16 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Mendoza et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de la formación de subvención T32 CA080416 del Instituto Nacional del cáncer (RM); por la financiación de proyectos piloto en el Centro de Núcleo de Excelencia en DK56465 subvención Hematología y por fondos del Hutchinson Centro de Investigación del Cáncer Fred (ADM); y por la Fundación Charlotte Geyer, y la Fundación Abbott Laboratories Maltz Familia (RHS y EAK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. EAK y RHS son inventores de patentes concedidas a los Laboratorios Abbott que se relacionan con métodos para la detección del XMRV. Sin embargo, los resultados presentados en el presente informe es probable que reduzca el valor de dicha tecnología, mitigando así los posibles conflictos de interés. Este interés no altera la adhesión de los autores a todos PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. RM y ADM han declarado que no tienen intereses en competencia.
Introducción
El retrovirus XMRV (virus de la leucemia murina xenotropic-relacionado con el virus) fue descubierta inicialmente en muestras de cáncer de próstata humano [1] y fue más tarde se encontró en la sangre de un alto porcentaje de pacientes con diagnóstico de síndrome de fatiga crónica (SFC) [2], que aumenta la preocupación de que el XMRV era un nuevo patógeno humano. Sin embargo, la mayoría de los estudios posteriores han sido incapaces de detectar XMRV en los seres humanos con o sin cáncer de próstata [3] o CFS [4]. Además, el XMRV aislados de los primeros estudios fueron casi idénticos a un virus producido por una línea celular de cáncer de próstata de uso común, 22Rv1 [5] - [7]. Tal vez el XMRV estaba presente en el cáncer de próstata a partir del cual se derivaron las células 22Rv1, pero la falta de diversidad de secuencias XMRV fue desconcertante dado la alta tasa de mutación de los retrovirus. Recientemente, se demostró que el XMRV presente en las células 22Rv1 haber surgido durante el paso de las células de cáncer de próstata 22Rv1 y sus ancestros en ratones desnudos, por un evento de recombinación rara entre dos retrovirus endógeno de ratón, y no se detectó en los primeros xenoinjertos de tumor de próstata [8]. La rareza se espera de este evento y la falta de diversidad de secuencias de los aislados XMRV "humanos" [7], [9] sugieren que las muestras humanas estaban contaminados con el XMRV 22Rv1 o clones de plásmidos de XMRV.
En la actualidad , un papel para el XMRV en el SFC es refutada en gran medida, y el documento original que se encontró esta asociación se ha retraído [10]. En particular, un gran estudio colaborativo encontró que dos de los grupos de laboratorio involucrados en la investigación original no podría detectar de forma fiable XMRV en muestras de pacientes, y que los laboratorios que podrían detectar de forma fiable el XMRV no detectó XMRV en pacientes con SFC o en los controles normales [11 ]. En el caso de la asociación de XMRV con el cáncer de próstata, todavía no está claro si algunas de las muestras originales de cáncer de próstata podría haber contenido XMRV derivado del paciente o de otros retrovirus relacionados.
Aquí hemos analizado el plasma sanguíneo y expresó las secreciones prostáticas (EPS) de pacientes con cáncer de próstata, algunos de los cuales previamente arrojaron resultados positivos para XMRV [1], [12] - [15], la presencia del XMRV y retrovirus relacionados mediante el uso de un ensayo para los retrovirus infecciosos. Además, hemos probado plasma de sangre para anticuerpos neutralizantes contra XMRV que podrían limitar nuestra capacidad para detectar XMRV en el plasma, y que indicaría una respuesta inmune contra XMRV en el donante de plasma. No hemos encontrado pruebas de XMRV o retrovirus relacionados, o una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra el XMRV, en ninguna de las muestras de los pacientes.
Resultados
Métodos de detección de XMRV
Para detectar infecciosa XMRV y retrovirus relacionados con el plasma del paciente y EPS muestras, se utilizó S
+ L
- ensayos y marcadores de rescate que han demostrado eficacia para detectar el XMRV [5]. El S
+ L
- ensayo se utilizó mide la capacidad de un retrovirus para infectar y causar la propagación del virus de Moloney murino sarcoma presente en 4 PG-células gato [16], lo que lleva a la producción de focos transformados en el capa de células. El ensayo de rescate de marcador se realizó utilizando
Mus dunni
fibroblastos de la cola (células dunni) transducidas con un vector retroviral (LAPSN) que produce la fosfatasa alcalina de placenta humana (AP). Las células dunni /LAPSN fueron expuestos a las muestras de ensayo, se hicieron pasar por un mes para permitir la propagación del virus, y se ensayaron para la producción del vector en las células LAPSN dunni ingenuos. células dunni fueron escogidos para este ensayo debido a su susceptibilidad a una amplia gama de virus de la leucemia murina [17], incluyendo XMRV, otros retrovirus xenotrópicos, y retrovirus politrópicos del tipo detectado previamente en los seres humanos [1], [2], [18 ]. Para detectar la neutralización de anticuerpos presentes en las muestras de plasma de pacientes, se utilizó el S
+ L
- ensayo para cuantificar XMRV competente para la replicación después de la incubación con las muestras, en comparación con XMRV se incubaron con medio de cultivo como un control. En algunos experimentos, se midió la capacidad del plasma para neutralizar el vector LAPSN empaquetado en viriones (XMRV XMRV-pseudotipo LAPSN vector) como un sustituto para la medición directa de la neutralización XMRV.
Para determinar la cinética de la propagación del virus y la sensibilidad del ensayo de rescate de marcador, el ensayo se lleva a cabo exponiendo las células dunni /LAPSN a 50, 25, 10, 5, 1, o 0 unidades de enfoque de formación (FFU) de XMRV, según lo determinado por S
+ L
- ensayo. Después las células se ensayaron para la producción semanal LAPSN durante el paso de las células durante un mes. la producción LAPSN se detectó a una semana después de la infección con 50 FFU del XMRV, a las 2 semanas después de la infección con 10 y 5 FFU, ya las 4 semanas para 1 de 2 placas infectadas con 1 FFU del XMRV. Estos resultados muestran que el ensayo de rescate de marcador es aproximadamente tan sensible como el S
+ L
- ensayo para la detección de XMRV. Sin embargo, este ensayo de rescate de marcador puede ser más sensible que el S
+ L
- ensayo para algunos retrovirus debido a la conocida sensibilidad de las células dunni a una amplia gama de los retrovirus murinos, mientras que un menor número de tipos de retrovirus murinos pueden infectar las células de gatos utilizados en el S
+ L
-.
ensayo
No hay evidencia de infección por XMRV de pacientes con cáncer de próstata
en primer lugar, si la prueba plasma sanguíneo de un conjunto de diez pacientes con cáncer de próstata, tres de los cuales previamente arrojaron resultados positivos para XMRV por RT-PCR, contenían XMRV competente para la replicación y /o anticuerpos neutralizantes contra el XMRV (Tabla 1). No se detectó XMRV o retrovirus relacionados en cualquier muestra de S
+ L
- ensayo. Para detectar anticuerpos neutralizantes, las muestras de plasma se incubaron a 1:10 y 1:100 diluciones con XMRV-pseudotype LAPSN vector durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el virus LAPSN restante se midió por AP
+ centrarse ensayo. Sólo una de las diez muestras de plasma mostraron actividad neutralizante débil (título neutralizante de 10). Esta actividad neutralizante fue eliminado por inactivación por calor del plasma, que inactiva el complemento, lo que demuestra que no hay anticuerpos estaban presentes que podría bloquear directamente la infección por virus.
Debido a la baja a indetectable nivel de anticuerpos neutralizantes en el set primera de las 10 muestras de pacientes, se realizaron ensayos de neutralización adicionales usando plasma sin diluir. Además, se midió la neutralización de virus XMRV en oposición a la LAPSN vector XMRV-pseudotype. No se detectó replicación competente XMRV o relacionados con los retrovirus, por S
+ L
- o ensayos de rescate de marcador, en el plasma de cualquiera de los 21 pacientes evaluados, incluyendo cuatro que previamente arrojaron resultados positivos para XMRV por PCR (véase Tabla 2 para el paciente y detalles de la muestra). Además, hemos encontrado poca o ninguna actividad neutralizadora de XMRV en las muestras de plasma sin diluir, incluso sin tratamiento térmico para inactivar el complemento (Fig. 1). Muestra VP950 mostró la mayor actividad de neutralización (75% de neutralización), pero la inactivación por calor de la muestra antes de la prueba, o diluyendo la muestra 10 veces antes de la prueba, abolió la actividad neutralizante (datos no presentados), lo que indica que esta actividad es muy débil y probable es dependiente de complemento. El hecho de que XMRV infecciosa puede persistir después de la incubación con las muestras de plasma sin diluir indica que XMRV infeccioso podría persistir en la sangre de estos pacientes de cáncer de próstata, y sería detectable en nuestros ensayos para el virus de replicación competente. La aparente falta de una respuesta inmune humoral contra el XMRV sugiere que estos pacientes no están infectadas por el XMRV, coherente con nuestra incapacidad para detectar virus en estas muestras de plasma.
El número de pacientes se enumeran en la parte inferior que indica con asteriscos los que habían probado previamente positivos para XMRV (véase la discusión para más detalles). El título de XMRV se determinó después de la incubación de una pequeña cantidad de XMRV con plasma sin diluir, o con medio de cultivo como un control, tal como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se muestran como la relación entre el título de XMRV después de la incubación con plasma para que después de la incubación con medio de cultivo, expresado como un porcentaje. Tenga en cuenta que algunos valores superan el 100%, lo que indica la mejora de la infección por XMRV por estas muestras de plasma.
A continuación se probó EPS líquidos obtenidos a partir de glándulas de la próstata extirpados [13] para la presencia del XMRV. Para probar los posibles efectos de la EPS en la infectividad de XMRV, hemos añadido una pequeña cantidad de XMRV a EPS diluidas de una próstata normal, o al medio de cultivo como control, y se midió el título de estas mezclas utilizando el S
+ L
- ensayo. Las muestras por duplicado para cada mezcla dieron resultados idénticos (título XMRV de 5 × 10
6 UFF /ml), que muestra que el XMRV puede sobrevivir y ser detectado en EPS fluido. Sin embargo, no se detectó virus de replicación competente de cualquiera de 5 EPS muestras de pacientes con cáncer de próstata por S
+ L
- o ensayos de rescate de marcador (ver Tabla 2 para identificadores de muestra y cantidades probado). Tres de estos pacientes habían probado previamente positivos para XMRV en la orina (Tabla 2) [15].
La activación de
M. dunni
retrovirus endógeno en algún marcador de rescate Ensayos
Hicimos una experiencia algunos resultados positivos falsos con el ensayo de rescate de marcador. En unos pocos casos se detectó la producción LAPSN después de la exposición de las células dunni /LAPSN de plasma, pero el análisis de la interferencia viral mostró que LAPSN transducción se bloqueó completamente en las células que expresa el dunni
M. dunni
retrovirus endógeno (MDEV) [19], [20], pero no se vio afectada en las células que expresan dunni XMRV (datos no mostrados). MDEV y XMRV utilizan diferentes receptores para la entrada en la célula, que están bloqueados por la infección con el retrovirus afines, pero no se ven afectados por la infección con el virus de la alternativa [17]. Para confirmar que los resultados positivos fueron de hecho un artefacto, se realizó un ensayo de rescate de marcador usando células /LAPSN DU145, y se encontró que todas las muestras aparentes falsos positivos de pacientes eran de hecho negativo para el XMRV competente para la replicación (datos no mostrados). Anteriormente, la producción de MDEV
M. se observó dunni
células después del tratamiento de las células con 5-yodo-2 'desoxiuridina o hidrocortisona [19], y parece que las sustancias en las muestras de los pacientes tienen una capacidad similar para activar el locus MDEV normalmente en silencio en células dunni .
Discusión
de las muestras de plasma de 29 y 5 EPS de pacientes con cáncer de próstata que hemos probado, ninguno tenía un nivel detectable de XMRV replicación competente o retrovirus relacionados. Incluidos fueron dos muestras de plasma (VP29 y VP35) de pacientes que dieron XMRV positivo al virus de microarrays de ADN de detección de análisis (Virochip) en el estudio original [1], una muestra de plasma (VP234) de un paciente que probó XMRV positivo por RT-PCR de RNA de tejido de próstata [12], una muestra de plasma (VP693) de un paciente que probó XMRV positivo por RT-PCR de ARN aislado de EPS [13], y una muestra de plasma (VP432) de un paciente que dio positivo por XMRV infeccioso en el plasma [14]. En particular, cabe destacar que el tejido de cáncer de próstata del paciente VP35 era la presunta fuente del primer clon de longitud completa del XMRV [1]. También se incluye en nuestro análisis eran tres EPS muestras (VP830, VP844 y VP881) y una muestra de plasma (VP663) a partir de pacientes que dieron positivo XMRV por RT-PCR de ARN aislado de la orina [15]. El S
+ L
- y ensayos de rescate de marcador basados en células dunni que hemos utilizado para detectar el virus son a la vez capaz de detectar xenotropic y retrovirus polytropic [5], [17] de los tipos informó anteriormente en el cáncer de próstata y los pacientes con SFC [1], [2], [18], así como los virus de la leucemia murina anfotrópicos. Además, el S
+ L
- ensayo puede detectar RD 114 retrovirus felino, felinos tipos de virus de la leucemia A, B y C, virus de la leucemia del mono gibón, y
Mus caroli
endógeno retrovirus (McERV) [16], [17], [21], por lo tanto, los ensayos que hemos utilizado podría haber detectado la presencia de una amplia gama de retrovirus gamma.
para determinar si el XMRV podría persistir en la sangre y para detectar posibles respuestas inmunes contra el XMRV, que ensayaron la capacidad del plasma sanguíneo para neutralizar la infectividad XMRV. Hemos detectado solamente neutralización mínima, incluso bajo la condición más estricta de la incubación de una pequeña cantidad de XMRV con plasma sin diluir, inactivado por calor no. A lo sumo, el 75% de la XMRV se neutralizó después de la incubación con plasma, lo que sugiere que XMRV arrojar en la sangre tendría un tiempo suficiente vida media para permitir la detección. En efecto, 7 de 21 muestras de plasma ensayadas de esta manera mostraron ≤10% de neutralización (Fig. 1), indicando que el plasma humano tiene poca actividad neutralizante innata contra XMRV. Este resultado es consistente con un estudio previo de neutralización XMRV por los sueros de CFS y sujetos normales, que mostró 0-80% de neutralización XMRV por sueros no inactivado por calor sin diluir, y no XMRV neutralización por sueros inactivados por calor [4], pero es incompatible con varios otros estudios que detectan relativamente alto de neutralización del XMRV por el plasma o suero humano, incluso en personas que resulten negativas para el XMRV por otros criterios [22] - [24]. Por ejemplo, el novio y col. [22] encontraron ejemplos de & gt; 50% de neutralización de virus que lleva proteínas XMRV Env de suero inactivado por calor a las 1:40 y 1:80 diluciones, y la mayoría de estos resultados positivos eran de sujetos de control sin cáncer de próstata o CFS. virus sin embargo, la mayoría de los sueros positivos también neutralizados que llevan otras proteínas Env, incluyendo la del virus de la estomatitis vesicular, que muestran la actividad neutralizante fue en general no específica. Zhou et al. [24] encontró ~ 30% de neutralización de virus que lleva XMRV Env por una dilución 1:80 de suero inactivado por calor, con tres sueros que muestra ~ 50% de neutralización. Todos los otros ensayos realizados indicaron que todos estos temas no infectadas por el XMRV
Hay varios factores que pueden explicar las diferencias en la neutralización de anticuerpos actividades: i.) La heparina presente en el suero o plasma a partir de sangre recogida en tubos heparinizados pueden inhibir de forma no específica la infectividad del virus, ii) la congelación y descongelación repetida de las muestras puede inactivar el complemento resulta en la reducción de la neutralización, iii) los componentes virales específicos del virus utilizado para estudios de neutralización pueden afectar los resultados (por ejemplo, el uso de las proteínas Gag del VIH u otros retrovirus murinos en combinación con XMRV Env [22] - [24]), y iv) factores celulares incorporados en viriones durante la producción del virus usado para la neutralización puede afectar el resultado [25] - [27]. En nuestro estudio y el estudio de Knox et al. [4], auténtico XMRV producido a partir de la línea celular de cáncer de próstata humano 22Rv1 se utilizó en los ensayos de neutralización, mientras que los estudios de Groom et al. [22] y Zhou et al. [24] Los virus utilizados hechos con proteínas de Moloney Gag-Pol y Env XMRV, y se produjeron mediante transfección de células 293T humanas. antígenos adicionales presentes en los últimos virus podría ser responsable de algunos de la neutralización no específica observada.
En resumen, no detectamos el XMRV competente para la replicación en el plasma o EPS fluido de pacientes con cáncer de próstata, ni tampoco detectamos significativa los niveles de anticuerpos neutralizantes en el plasma. Estos datos apoyan la conclusión de otros estudios que el XMRV no ha entrado en la población humana.
Materiales y Métodos
Sujetos Humanos
El plasma sanguíneo y expresaron líquido prostático (EPS) muestras utilizado en el presente estudio se obtuvieron en la Clínica de Cleveland tras la aprobación por la Junta de Revisión Institucional Cleveland Clinic Foundation. Todas las muestras se obtuvieron de pacientes con cáncer de próstata después se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Las muestras de plasma se prepararon a partir de sangre recogida en tubos de EDTA estándar, EPS fluido se obtuvo por el masaje de las glándulas prostáticas extirpadas después de la prostatectomía, y todas las muestras se almacenaron a -70 ° C. Muchas de las muestras de plasma se congelaron y descongelaron una vez para el análisis, mientras que otros fueron congelados y descongelados un número limitado de veces (Tabla 2).
Cell Cultura y
M. dunni
fibroblastos de la cola (células dunni) [28], las células 293 de riñón embrionario humano [29], las células de carcinoma de próstata 22Rv1 (ATCC CRL-2505), las células HTX (un subclón aproximadamente diploide de células de fibrosarcoma humano HT-1080) [ ,,,0],5] y DU145 células de cáncer de próstata [30] se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 4,5 g /l de glucosa y suero bovino fetal al 10% (FBS). células PG-4 felinos [16] fueron cultivadas en medio de McCoy con 15% de FBS. virus XMRV utilizado en este estudio fue cosechada de 22Rv1 células obtenidas directamente de la ATCC
S
+ L
-. XMRV y neutralización Ensayos
p>
5 por plato en el día 1. en el día 2, plasma y EPS se descongelaron las muestras y partes de cada muestra (o medio de cultivo como un control sin plasma) 6-cm se incubaron con un pequeño volumen de XMRV infeccioso (cosechado de 22Rv1 células) durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente, mientras que las otras porciones de las muestras de plasma y EPS se mantuvieron en hielo. Virus-claveteado y se añadieron las muestras sin tratar a las células PG-4 en presencia de 4 mg /ml de Polybrene. Las células se alimentan de día 3, y los focos se contaron en el día 4 ó 5. En algunos experimentos fue inactivado por calor el plasma a 56 ° C durante 30 min antes del ensayo de neutralización del virus.
Marcador Rescue Ensayo
células dunni y DU145 que contienen el vector retroviral LAPSN (dunni /LAPSN y DU145 /LAPSN células) se generaron mediante la exposición de las células a Ayudante free-vector LAPSN generada a partir de retrovirus PA317 embalaje células [31] y seleccionando las células en G418 durante 1 semana para asegurarse de la presencia del vector en todas las células en las poblaciones. El ensayo de rescate de marcador se realizó como sigue. células Dunni /LAPSN o DU145 /LAPSN se sembraron a 5 x 10
5 por 6 cm de plato en día 1 y se expusieron a las muestras de ensayo (plasma de sangre o EPS) en presencia de 4 mg /ml de Polybrene en día 2 ., las células se pasaron por un mes a alta densidad (para facilitar la propagación del virus) por tripsinización y resiembra las células a una dilución de 1:10 cada vez que las células se volvieron confluentes. entonces la producción LAPSN se midió por la alimentación de células confluentes, cosechando el medio al día siguiente, la eliminación de las células por filtración (0,2 micras de tamaño de poro filtros de acetato de celulosa libre de tensioactivo) o por centrifugación (4.000 xg durante 15 min), por medio de la adición de muestras con 4 mg /ml de polibreno a dunni o 293 células sembradas el día anterior en 5 × 10
4 por pocillo de placas de 12 pocillos, y mediante la tinción de las células para AP dos días más tarde.
Virus interferencia en el ensayo
virus detectado en el ensayo de rescate de marcador Replicación se sometió a análisis de interferencia utilizando células dunni con infección crónica con cualquiera XMRV a partir de células 22Rv1 o con el
M. dunni
retrovirus endógeno (MDEV) a partir de células dunni. En el día 1 las células dunni infectadas y no infectadas se sembraron en placas de 12 pocillos a 5 x 10
4 por pocillo. En el día 2, el medio se reemplazó con 1 ml de medio que contiene 4 g de Polybrene y 0,1 ml de medio recogido de las células de ensayo de rescate de marcador. En el día 4, las células se tiñeron para AP. Las células infectadas dunni MDEV son resistentes a MDEV pero permisiva para XMRV, mientras que las células infectadas con XMRV dunni son resistentes a XMRV pero permisiva para MDEV.
Reconocimientos
gracias Christina Gaughan (Cleveland) para la asistencia técnica de expertos.