Extracto
Nuestros estudios previos han demostrado que PMS1077, factor activador de plaquetas antagonista (PAF), podría inducir la apoptosis de células Raji. Sin embargo, el mecanismo de acción aún no ha sido determinada. El factor-kappa transcripción nuclear B (NF-kB) vía de señalización juega un papel crítico en la supervivencia celular tumoral, la proliferación, invasión, metástasis y la angiogénesis, por lo que determina los efectos de PMS1077 y sus análogos estructurales de factor de necrosis tumoral-α ( TNF-α) inducida por la activación de la señalización de NF-kB. En este estudio, se encontró que PMS1077 inhibe la expresión inducida por TNF-α del gen informador regulado NF-kappa B de una manera dependiente de la dosis. ensayo de transferencia Western indicó que PMS1077 suprimió el inhibidor inducida por TNF-α de kappa B-α (I? B-α) la fosforilación, la degradación de I? B-α, y la fosforilación de p65. PMS1077 bloqueado consistentemente TNF-α inducida por la translocación nuclear de p65 como se demuestra en el ensayo de inmunofluorescencia utilizado. estudios de acoplamiento por modelado molecular predijeron que PMS1077 podría interactuar directamente con la quinasa-β I? B (IKK-β) subunidad. Estos resultados sugieren que PMS1077 podría suprimir la activación de NF-kB por la orientación IKK-β que participan en la vía de señalización de NF-kB. Por último, hemos demostrado que PMS1077 células a la apoptosis inducida por TNF-α sensibilizado por la supresión de la expresión de NF-kB genes anti-apoptóticos regulados. Nuestros resultados revelan una nueva función de PMS1077 en el NF-kB vía de señalización e implican que PMS1077 se puede considerar como un compuesto de plomo anti-tumor
Visto:. Shi J, Chen J, Serradji N, Xu X, Zhou H, Ma Y, et al. (2013) PMS1077 sensibiliza TNF-α inducida por apoptosis en células de cáncer de próstata humano mediante el bloqueo de NF-kB vía de señalización. PLoS ONE 8 (4): e61132. doi: 10.1371 /journal.pone.0061132
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 17 de octubre de 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 9 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los proyectos Chun Hui (número Z2009-1-62001, http://www.moe.edu.cn) del Ministerio de Educación de china y en parte por la Ciencia y Tecnología de Proyectos de Apoyo de la provincia de Gansu (número 1104FKCA123, http://www.gsstc.gov.cn), china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años, se han sintetizado una serie de derivados de piperazina que mostraba actividades anti-HIV-1 potente de doble anti-FAP y [1], [2], [3], [4]. Al tiempo que mejora aún más estas propiedades y teniendo en cuenta la flexibilidad de estos compuestos, también se dedicaban a estudiar los posibles efectos de estos compuestos en otras condiciones patológicas, como la inflamación y la génesis tumoral. Nuestro trabajo previo ha demostrado que PMS1077 podría inducir la apoptosis de las células Raji, pero el mecanismo de acción no está claro [5].
Debido al papel crítico de los productos del gen regulado NF-kB en la proliferación celular, la supervivencia, la invasión, metástasis y angiogénesis [6], [7], [8], que razonó que PMS1077 podría mediar la apoptosis de las células cancerosas mediante la modulación de la cascada de señalización NF-kB. La familia NF-kappa B se compone esencialmente de cinco proteínas, incluyendo Rel-A (p65), Rel-B, C-Rel, p50, y p52 [9]. La típica de los mamíferos NF-B consiste en un heterodímero p50 /p65. En las células no estimuladas, NF-kB se une a proteínas inhibidoras de la kappa B y es secuestrado en el citoplasma como un complejo inactivo. Tras la estimulación, por ejemplo, por el TNF-α, la cascada de señalización conduce a la activación del complejo de quinasa I? B, lo que resulta en la fosforilación, ubiquitinación y degradación de I? B por el proteasoma 26S [9], [10]. A continuación, el liberado heterodímero NF-kappa B se transloca rápidamente en el núcleo, donde se une al sitio kappa B e induce la transcripción de una amplia variedad de genes diana implicados en el desarrollo y progresión del cáncer [8], [11].
En el presente estudio, la hipótesis de que PMS1077 puede modular la vía de activación de NF-kB. Para probar esta hipótesis, se determinó los efectos de PMS1077 y sus análogos estructurales sobre la activación de NF-kB TNF-α inducida. Nuestros resultados demostraron que PMS1077 puede inhibir el TNF-α inducida por la degradación de I? B-α, la fosforilación de I? B-α, la fosforilación p65, y p65 translocación nuclear. estudios de acoplamiento de modelado molecular predijeron que PMS1077 podría suprimir la activación de NF-kappa B interactuando directamente con IKK-β. Además, también se encontró PMS1077 para suprimir la expresión inducida por TNF-α de NF-kB reguladas genes anti-apoptóticos, lo que lleva a la sensibilización de TNF-α apoptosis inducida en células tumorales. De esta manera, los datos de este estudio avanzaron nuestra comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la actividad anticancerígena de PMS1077, y nos pueden ayudar a optimizar aún más sus propiedades para el desarrollo potencial de la droga.
Materiales y Métodos
cultivo de células y reactivos
HEK293T (riñón embrionario humano), las células DU145 (cáncer de próstata humano) y PC3 (cáncer de próstata humano) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se cultivaron en DMEM (Dulbecco medio de Eagle modificado) suplementado con 10% FBS (suero bovino fetal), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y se incubaron a 37 ° C en un CO 5%
2 incubadora . PMS1077 y sus análogos estructurales se sintetizaron como [4] se informó anteriormente. Aquellos análogos se disolvieron en DMSO para producir una /L solución de 50 mmol para los experimentos in vitro. TPCA-1 (un inhibidor específico de NF-kappa B) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, U.S). Los anticuerpos contra la P-p65, p65, P-I? B-α, α-I? B, Bcl-xL, Bcl-2, survivina y PARP se adquirieron de Cell Signaling Technology. TNF-α fue adquirido de Pepro Tech. GenEscort reactivo de transfección ™ fue adquirido de Wisegen Biotechnology Corporation (Nanjing, China).
Transfección y ensayo informador de luciferasa
DU145 y PC3 células fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de 60 mm, respectivamente. NF-KB dependiente de plásmido informador de luciferasa de luciérnaga (4 × kappa B-pGL4.20) se transfectó en las células sembradas utilizando reactivo de transfección GenEscort ™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, las células fueron seleccionadas y proliferaron en el medio suplementado con 5 mg /ml de puromicina hasta que aparecieron clones resistentes. Los dos clones validados fueron nombrados DU145-NF-kB-Luc y PC3-NF-kB-Luc. cribado de alto rendimiento para los compuestos indicados se llevó a cabo en estas líneas celulares usando UNO-Glo Luciferase sistema de ensayo (Promega).
Para estudiar la activación de NF-kB en las células HEK293 por el TNF-α, NF-KB dependiente luciérnaga indicador de luciferasa (4 × kappa B-pGL4.20) era transitoriamente co-transfectadas junto con la luciferasa de Renilla plásmido (pGL4.74) en células HEK-293T línea usando un reactivo de transfección GenEscort ™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento, las células se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega), y se determinó la actividad de luciferasa usando un sistema de doble ensayo de luciferasa Reporter (Promega) con una Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesely, MA, U.S.). la actividad de luciferasa relativa se expresa como una proporción de la actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla actividad. Los datos representan tres experimentos independientes realizados por triplicado.
3- (4, 5-cimethylthiazol-2-il) -2, se determinó 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) ensayo de
La viabilidad celular usando el ensayo de MTT. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo), se trató con diversos compuestos a diversas concentraciones, y luego mantenidas en cultivo durante otros 12 o 24 h. Al final de ese período, se añadieron 20 l de MTT (5 mg /ml) al medio de cultivo y se incuba a 37 ° C durante 2 h. Entonces se retiró el medio. Los cristales de formazán insolubles en agua se disolvieron en DMSO (100 l /pocillo). La densidad óptica de cada pocillo se midió con un Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, U.S) a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm. Para cada concentración ensayada, los pocillos que contienen todos los reactivos, excepto para las células sirvieron como controles. La supervivencia celular se describe aquí como porcentaje relativo de absorbancia (A) tal como se define en (A
drogas /A
de control x 100) (Ye et al., 2004).
Western Blot análisis
transferencia de Western de las proteínas se realizó como se describe en uno de nuestros estudios anteriores [12]. Brevemente, se recogieron las células tratadas en tampón de lisis RIPA que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0.5% DOC, 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, NaF 20 mM , sodio 2 mM ortovanadato y inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche). Después de la lisis, los lisados se centrifugaron durante 10 min a 13.000 g a 4 ° C. muestras de proteína total (30-60 g) se transfirieron a una membrana de PVDF después de la separación electroforética en gel de poliacrilamida SDS 12%. Después de bloquear con leche no grasa al 5% en TBST (0,1%) durante 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario a 4 ° C y se lavaron cinco veces en TBST, a continuación, se incubaron con la peroxidasa de rábano picante conjugado secundario anticuerpos a temperatura ambiente durante 2 h. Las membranas se lavaron cinco veces en TBST, y luego incubadas con un sistema mejorado de quimioluminiscencia Western detección (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE.UU.) y se expusieron a película de rayos X.
NF-KB /p65 translocación nuclear ensayo
el análisis inmunocitoquímico de NF-kB /p65 translocación nuclear en las células PC-3 se realizó usando un celular NF-kappa B translocación Kit (Beyotime Biotech) según las instrucciones del fabricante, tal como se describe anteriormente [13 ], [14]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 4000 células /pocillo. 24 horas después, las células fueron pretratadas con PMS1077 (50 M) durante 2 h, seguido de tratamiento con 20 TNF-α ml /ng por 30 minutos. Las células pretratadas con 0,2% de DMSO y 2 M TPCA-1 se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Después del tratamiento, las células se fijaron y se incubaron con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h para suprimir la unión no específica. A continuación, las células se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario p65 NF-kB a 4 ° C, seguido de incubación con un anticuerpo conjugado con Cy3 secundario a temperatura ambiente durante 1 h, a continuación, con DAPI durante 5 min antes de la observación. La proteína p65 apareció rojo bajo microscopía de fluorescencia y los núcleos apareció azul. Las imágenes rojas y azules se fusionaron utilizando el software Image J para producir fluorescencia púrpura en áreas de co-localización.
translocación nuclear de NF-kB /p65 también se detectó en las células DU145 por análisis de transferencia Western de la presencia de p65 en el citoplasma y el núcleo. Después del tratamiento, se prepararon las células citoplasmáticas y nucleares fracciones usando el método como se describe en uno de nuestros estudios previamente [12]. A continuación, las muestras de proteínas se analizaron por transferencia Western.
RT-PCR ensayo
ARN total de las células tratadas se preparó usando el Kit de células pura RNAprep (Tiangen, Bei Jing, China) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. 5 g de ARN total de cada muestra se sometieron a transcripción inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega). Se utilizaron los siguientes cebadores: GAPDH-forward, GTCAACGGATTTGGTCGTATT y GAPDH- inversa, AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT; Bcl-XL-forward, CTGAATCGGAGATGG AGACC y Bcl-XL-inverso, TGGGATGTCAGGTCACTGAA; Bcl-2-forward, TGCACCTGACGCCCT TCAC y AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG y Bcl-2-inverso, AGACAGCCAGGAGA AATCAAACAG; survivina-forward, CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG y survivina-inverso, GTG AATTTTTGAAACTGGACAG. PCR se llevó a cabo a 94 ° C durante 30 s, a 56 ° C durante 30 s y 1 min a 70 ° C durante 30 ciclos. Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.
Apoptosis ensayo
La detección de células apoptóticas se realizó utilizando FITC-conjugado de Anexina-V y yoduro de propidio (PI) . células DU145 se trataron con 0, 40 y 80 mM PMS-1077 durante 24 h y luego a continuación se sedimentaron por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS frío, y se centrifugaron a 1.000 rpm para recoger las células. Las células se resuspendieron en 200 l de tampón de unión y, a continuación 10 l de anexina-V-FITC, se añadieron 5 l de PI. Las células se incubaron en oscuridad durante 30 min y se analizaron por citometría de flujo. FACS se realizó utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y filtros de paso de banda de 515-545 nm (para la detección de Anexina-V-FITC) y 563-607 nm (para la detección PI). El análisis de datos se realizó utilizando el programa Cell Quest.
Estudio de acoplamiento molecular
El dominio quinasa IKK-β (residuos 16-310) fue extraído de la estructura cristalina de IKK-β en el complejo con una inhibidor (AP ID: 3RZF) [15]. Los compuestos PMS1077 y PMS601 fueron construidos usando Avogadro, con MMFF94 campo de fuerza minimización de la energía incluyendo 5000 pasos de descenso más agudo y 2000 pasos de gradientes conjugados [16]. Todas las estructuras de soporte se prepararon utilizando autodocktools [17]. Se añadieron Gasteiger carga y combinación de hidrógenos no polares.
acoplamiento molecular se realizó mediante Autodock Viña [18]. Los compuestos se fijan como estructuras flexibles y los conformadores de unión se realizaron búsquedas utilizando la búsqueda local iterativa optimizador global. confórmeros de unión finales se eligen en función de la mejor puntuación AutoDock Viña, la combinación de la basada en el conocimiento y el enfoque empírico Ec. 1. (1)
A continuación,
? G
es la energía de enlace total;
? G
gauss
es dos funciones gaussianas que contienen atractiva término de la dispersión;
? G
repulsión
es el cuadrado de
d gratis (distancia de la superficie) cuando
d & lt; 0
;
? G
hidrófobo
y
? G
hbond ¿Cuáles son las interacciones hidrofóbicas y los enlaces de hidrógeno, respectivamente; y
? G
res
se bonos rotativo compuestos.
La afinidad de unión también se evaluó usando AutoDock dolor 4.1 (Ec. 2) y NNScore 2.0 [19]. (2)
A continuación,
W
VDW
,
W
hbond
,
W
elec
, y
W
sol ¿Cuáles son las constantes de ponderación de las interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, y la energía de desolvatación, respectivamente;
W
tor
es el peso de los compuestos de torsión.
NNScore 2.2 tarda mucho más características de receptor-ligando para contribuir a la afinidad de unión, incluyendo los términos de AutoDock Vina y 12 características de unión de distintas Binana [20]. En el presente estudio, Binana y LIGPLOT + [21] fueron introducidos para analizar la interacción de PMS1077 e IKK-β.
Estadísticas y análisis de datos
Todos los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces y el los datos se presentan como media ± desviación estándar a menos que se indique lo contrario. La significación estadística entre los grupos tratados y los grupos tratados se determinó usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) y la prueba de la t. P & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
PMS1077 suprimido el TNF-α inducida por la expresión de NF-KB-gen informador regulado
En este estudio, para dilucidar el mecanismo implicado. en las actividades antitumorales de PMS1077 (Fig. 1), que establece las líneas celulares DU145-NF-kB-Luc y PC3-NF-kB-Luc que expresan de forma estable un promotor 4 × kappa B conducción indicador de luciferasa y determinó los efectos de PMS1077 en el TNF-α inducida por la activación de NF-kappa B en estas líneas celulares. En este ensayo de gen reportero, se observó PMS1077 para inhibir la actividad inducida por NF-kB TNF-α en más de un 50% en las células DU145 y células PC3. Sólo los datos en las células DU145 se muestran en la Fig. 2A.
(A) DU145-NF-kappa B-luciferasa células fueron tratadas con PMS1077 y sus análogos estructurales a una concentración final de 50 mM. TPCA-1 (2 mM) es un inhibidor específico de NF-KB para el control positivo y DMSO como vehículo. Luego, las células se dejaron sin tratar o expuestos a TNF-α (20 ng /ml) durante 12 h. La actividad de luciferasa se midió utilizando ONE-Glo sistema de ensayo de luciferasa (Promega). (B) las células DU145 se trataron con PMS601, PMS1077, PMS1120 y PMS1144 a las concentraciones indicadas durante 12 h. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. Los valores son la media ± S.D.. para tres réplicas independientes. *
P
. & Lt; 0,05 frente a TNF-α grupo estimulado
Con el fin de encontrar compuestos más potentes, una serie de análogos (Fig. 1), estructuralmente muy cerca de PMS1077 , se sometieron al mismo ensayo. PMS1120, un isómero de posición de PMS1077 observar las actividades comparativas como PMS1077 en ambas líneas celulares, mientras que PMS1141 era tan activo como PMS1077 solamente en la línea celular PC3. Otros análogos eran menos activos que PMS1077 tanto en las líneas celulares y PMS601 fue uno de los compuestos más inactivos en esta serie. En cuanto a PMS1077, sólo los datos en las células DU145 se muestran en la Fig. 2A.
Para excluir los efectos de citotoxicidad, que determina los efectos de estos compuestos sobre la viabilidad celular. ensayo de MTT indicó que PMS601, PMS1077, PMS1120 y PMS1141 sólo mostró citotoxicidad moderada (& lt; 30%) en las células DU145 a concentraciones tan altas como 80 mM (Fig 2B.). Por último, se seleccionaron PMS1077 como el mejor compuesto y PMS601 como control para los experimentos posteriores.
A fin de validar estos resultados en el sistema de ensayo de luciferasa dual más preciso, las células HEK293T fueron transitoriamente co-transfectadas con NF-kB -regulated plásmido indicador de luciferasa (4 × kappa B-MinIP /PGL4.20) y el plásmido de control interno (PGL4.74). Como se muestra en la Fig. 3A, la actividad de luciferasa relativa NF-kB fue inducida por TNF-α de una manera dependiente de la dosis, y esta actividad fue suprimida por un conocido inhibidor de IKK-β TPCA-1 (Fig. 3B). Cuando las células se trataron con PMS1077, encontramos que el TNF-α inducida por NF-kB actividad del gen indicador de luciferasa relativa fue suprimido de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). Sin embargo, PMS601, un control negativo, no mostró ningún efecto significativo sobre esta actividad (Fig. 3D).
células HEK293T fueron transitoriamente co-transfectadas con luciferasa NF-kappa B-Firefly y TK-luciferasa de Renilla vectores indicadores para NF ensayo de actividad -κB. (A) NF-KB dependiente de expresión del gen informador inducida por TNF-α. Las células transfectadas se trataron con vehículo o TNF-α (1, 5, 10, 20 y 50 ng /ml) durante 12 h; (B) TPCA-1 inhibe la expresión del TNF-α inducida por NF-kappa B gen indicador dependiente. Las células transfectadas se trataron con vehículo o TPCA-1 (1, 2, 3, y 4 M), después se incubaron con TNF (20 ng /ml) durante 12 h; (C) PMS1077 inhibida inducida por TNF-α, NF-kB expresión del gen indicador dependiente. Las células transfectadas se trataron con vehículo o PMS1077 (20, 40, 60 y 80 mM), después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 12 h; (D) PMS601 no mostró ningún efecto sobre el TNF-α inducida por NF-KB dependiente de la expresión de genes reportero. Las células transfectadas se trataron con vehículo o PMS601 (20, 40, 60 y 80 mM), después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 12 h. Después del tratamiento, la actividad de luciferasa en (A), (B), (C) y (D) se midieron usando un sistema de ensayo dual de luciferasa (Promega). Los datos mostrados representan la actividad relativa de luciferasa se normalizó contra la actividad de luciferasa de Renilla. Los valores son la media ± S.D.. para tres réplicas independientes. *
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo estimulado TNF-α; NS, no significativo.
PMS1077 inhibe TNF-α dependiente de I? B-α fosforilación y la degradación
La fosforilación y la degradación de ubiquitina proteasoma mediada de la proteína de I? B-α juega un papel crítico en la activación de la vía de señalización de NF-kB. Mientras que la detección de la fosforilación y degradación de I? B-α en HEK293T, hemos encontrado que la degradación de TNF-α inducida I? B-α alcanza el máximo en 0,5 h a 1 h y que la resíntesis de I? B-α se produjo 2 h a 4 h después del tratamiento de TNF-α (Fig. 4A). Para determinar si la inhibición de TNF-α inducida por la activación de NF-kappa B es causado por la supresión de la degradación de I? B-α, pretratados células HEK293T con PMS1077 y luego expuesto a TNF-α por 0.5 h. En particular, se encontró PMS1077 para inhibir la degradación de I? B-α de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4B). En contraste, se observó ningún efecto evidente sobre la degradación de I? B-α en PMS601 (80 M) células pretratadas (Fig. 4B). Estos datos indicaron que PMS1077 puede suprimir TNF-α inducida por la degradación de I? B-α, que conduce a la supresión de la activación de NF-kB.
(A) TNF-α degradación inducida de I? B-α, α-I? B fosforilación. células HEK293T fueron tratados con TNF-α (20 ng /ml) durante los períodos de tiempo indicados; (B) PMS1077 inhibe el TNF-α inducida por la degradación de I? B-α. células HEK293T fueron tratados con vehículo o PMS1077 (20, 40, 60 y 80 mM) o PMS601 (80 M) y TPCA-1 (1 M), después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 0,5 h; (C) PMS1077 inhibida inducida por TNF-α fosforilación de I? B-α. células HEK293T fueron tratados con vehículo o PMS1077 o PMS601 o TPCA-1 como en (B), después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 2 h; (D) las células DU145 se trataron con vehículo o PMS1077 (40 y 80 mM) y TPCA-1 (1 M), a continuación, las células se dejaron sin tratar o se expone a TNF-α (20 ng /ml) durante 12 h. Después del tratamiento, se prepararon y analizaron por Western Blot con anticuerpos para I? B-α, la fosforilación-I? B-α (Ser-32), la fosforilación de los lisados de células enteras en (A), (B), (C) y (D) -p65 (Ser-536) y GAPDH. Todos los datos que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.
Para determinar si la inhibición de la degradación inducida por el TNF-α de I? B-α fue causada por la inhibición de la fosforilación de I? B-α, se estudiaron los efectos de PMS1077 en TNF-α inducida por la fosforilación de I? B-α en células HEK293T. Como se muestra en la Fig. 4A, la resíntesis de I? B-α alcanzó un nivel similar a la del control 2-4 h después del tratamiento y la fosforilación de I? B-α alcanzaron un nivel moderado a 1-2 h después de tratamiento con TNF-α, por lo que se realizó un análisis de transferencia Western de I? B fosforilación -α 2 h después de la estimulación TNF-α. Los resultados de este análisis mostraron que el pretratamiento de PMS1077 inhibió fuertemente TNF-α inducida por la fosforilación de I? B-α de una manera dependiente de la dosis, pero PMS601 mostraron ningún efecto sobre esta fosforilación (Fig. 4C).
En conjunto, estos resultados indicaron que PMS1077 inhibe la activación inducida por TNF-α de NF-kappa B a través de la supresión de la fosforilación y degradación de I? B-α. Sin embargo, la PMS601 análogo estructural no mostró ningún efecto significativo en la fosforilación y degradación de I? B-α.
PMS1077 inhibe la fosforilación constitutiva y TNF-α inducida por p65
Ha sido bien demostrado que la fosforilación de la serina 536 de p65 desempeña un papel importante en la regulación de la actividad de NF-kB y puede ser inducida por una variedad de estímulos pro-inflamatorios, incluyendo TNF-α [22], [23], [24], [25]. Por esta razón, también se investigó los efectos de PMS1077 sobre inducida por TNF-α fosforilación de p65. El análisis de transferencia Western mostró que la fosforilación de p65 se produjo en células DU145 tratadas TNF-a y esta fosforilación de p65 se inhibió de una manera dependiente de la dosis en las células pretratadas con PMS1077 (40 y 80 mM) (Fig. 4D, derecha).
células DU145 y PC3 tener constitutivamente activa NF-kB [26], [27]. Para determinar si PMS1077 también afecta a la expresión constitutiva de NF-kappa B en estas células, se trataron con DU145cells PMS1077 (40 y 80 mM) sin TNF-α. Como se muestra en la figura. 4D (izquierda), PMS1077 suprimió completamente la fosforilación constitutiva de p65 en las células DU145 de una manera dependiente de la dosis. Además, PMS601 se encontró que tenía un efecto significativo tanto en la fosforilación inducible y constitutivo de p65 (Fig. S1). Por lo tanto, estos datos indicaron que PMS1077 puede suprimir tanto la activación de NF-kappa B inducible y constitutivo.
PMS1077 bloqueado TNF-α inducida por NF-kB /p65 translocación nuclear
Debido a la degradación de I? B-α es necesaria para la translocación nuclear de p65, hemos tratado de determinar si PMS1077 también podría suprimir el TNF-α inducida por la translocación nuclear de p65. El análisis de transferencia Western mostró que la translocación nuclear de p65 se produjo en DU145 después de tratamiento con TNF-α. Sin embargo, cuando las células fueron pretratadas con PMS1077 (50 M) o TPCA-1, TNF-α no inducir la translocación nuclear de p65 (Fig. 5A). Para confirmar estos resultados, se realizó inmunocitoquímica para observar p65 en células PC3 y DU145. Los resultados indicaron que en las células tratadas previamente no tratados, así como PMS1077 (50 M) o TPCA-1, p65 se localiza en el citoplasma, mientras que en las células tratadas con TNF-α por sí sola, p65 se transloca al núcleo (Fig. 5B y Fig.S2). Sin embargo, PMS601 no mostró ningún efecto en esta translocación de p65 (Fig. S2). Estos datos confirmaron que PMS1077 bloqueó el TNF-α inducida por la translocación nuclear de p65.
(A) las células DU145 se pretrataron con PMS1077 (50 M) o TPCA-1 (2 mM) durante 6 h y seguidas por TNF -α (/ml 20 ng) la estimulación de 0,5 h. extractos citoplasmáticos y nucleares representan números iguales de células se analizaron por transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. (B) células PC-3 fueron pretratados con PMS1077 (50 mM) durante 6 h y seguidas por TNF-α (20 ng /ml) la estimulación de 0,5 h. TPCA-1 (2 M) y DMSO se usaron como positivo inhibidor de NF-kappa B y el control negativo, respectivamente. Después del tratamiento, las células se tiñeron con anticuerpo anti-p65 primaria y Cy3 conjugado con fluoresceína anticuerpo secundario (rojo) y, a continuación el núcleo se contratiñeron con DAPI (azul) y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia. Las imágenes fueron adquiridas para cada canal de fluorescencia, utilizando filtros adecuados con un 40 × objetivo. Las imágenes rojas y azules se fusionaron utilizando el software Image J. Todos los datos que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.
Estudio de acoplamiento mediante modelado molecular de las interacciones entre PMS1077 o PMS601 e IKK-β
Una variedad de agentes, incluyendo el TNF-α, interleucina-1 beta (beta), acetato de forbol miristato (PMA), y ácido okadaico (OA) se ha informado para activar NF-kappa B, y PMA puede inducir la activación de NF-kappa B a través de la IKK complejo [28], [29] . En el presente estudio, PMS1077 puede inhibir tanto TNF-α e inducida actividad PMA NF-kappa B (Fig. 2A y Fig. S3). La fosforilación inducida por TNF-α de I? B-α es catalizada por IKK. Basado en el hecho de que PMS1077 puede inhibir la fosforilación de I? B-α, pero PMS601 no mostraron efectos en esta fosforilación (Fig. 4C), se especuló si PMS1077 podría objetivo IKK. Con el fin de explorar esta posibilidad, se comparó la afinidad de unión de estos dos compuestos y IKK-β utilizando métodos computacionales. PMS1077 y PMS601 se acopló con el dominio quinasa de IKK-β, y la afinidad de unión se estimó utilizando tres diferentes funciones de puntuación que eran AutoDock puntuación vina, AutoDock anotar 4.1 y 2.0 NNScore (ver Materiales y métodos). De AutoDock puntuación vina, la puntuación de PMS1077 es inferior a la PMS601, y el calculado K
d de PMS1077 era aproximativamente 15 veces menor que la de PMS601. Esto fue confirmado por otro sistema de dos puntuación (Tabla 1). Marcador Ambos AutoDock 4,1 y 2,0 NNScore mostró que el calculado K
d de PMS1077 era más de dos cientos inferior a la de PMS601. Este cálculo está de acuerdo con los resultados dados anteriormente (Fig. 4B), que no mostró cambio obvio en la fosforilación de I? B-α en concentraciones PMS601 de hasta 80 mM. Los detalles de las interacciones entre PMS1077 y IKK-β se muestran en la Fig. Se encontraron 6. Las interacciones hidrófobas para contribuir más en la afinidad de unión, tales como residuos de LUE21, VAL29, TYR98, y ILE165. Dos puentes de hidrógeno formados entre THR23 y PMS1077.
(A) El modelo 3D de PMS1077 (estilo de la bola y el palo) la interacción con dominio quinasa IKK-β (residuos muestran en modelo de palo), enlaces de hidrógeno se muestran en trazos línea. (B) El diagrama 2D de las interacciones entre PMS1077 e IKK-β.
De este modo, estos cálculos revelaron que PMS1077 podría inhibir la activación de NF-kappa B uniéndose directamente a IKK-β y diferente afinidad de unión de IKK-β que resulta en diferentes actividades de PMS1077 y PMS601.
PMS1077 sensibilizado células de cáncer de próstata a la apoptosis inducida por TNF-α a través de la supresión de la transcripción inducida por TNF-α de los genes anti-apoptóticos
Nuestro trabajo previo ha demostrado que PMS1077 podría inducir la apoptosis de las células Raji [5]. En este trabajo, se encontró que PMS1077 también indujo apoptosis en DU145 y sensibilizado significativamente la apoptosis inducida por TNF-α, como se evidencia por el ensayo MTT (Fig. 7A) y por microscopía de contraste de interferencia diferencial (Fig. 7B). Esto se confirmó por citometría de flujo a través de la tinción de yoduro de propidio (PI) de la PMS1077 anexina-V-FITC y se trató DU145 células como se muestra en la Fig. 7C.
células DU145 (A) se trataron con vehículo, o PMS1077 PMS601 como la concentración indicada (0-80 mM) y después se incubaron con o sin TNF-α (20 ng /ml) durante 24 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. (B) las células DU145 se trataron con vehículo o PMS1077 (40 y 80 mM), y después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 24 h. Las células tratadas se observaron por microscopio de contraste de interferencia diferencial. células DU145 (C) se trataron como (B) y el análisis de la apoptosis se realizó por citometría de flujo a través de anexina-V-FITC y yoduro de propidio (PI) tinción de las células tratadas. (D) las células DU145 se trataron con vehículo o PMS1077 (40 y 80 mM), después se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 12 h. Después del tratamiento, los extractos celulares totales se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con anticuerpos como se indica. (E) células DU145 se incubaron con TNF-α (20 ng /ml) durante 1 h, con vehículo o pretratamiento PMS1077 durante 6 h. El nivel de ARNm de NF-kappa B genes diana fueron examinados mediante RT-PCR. (F) células DU145 se trataron como (D) y se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western con anticuerpos para la PARP y GAPDH lisados de células enteras. Todos los datos que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.
Ha sido bien establecido que la inhibición de la vía de señalización NF-kB sensibiliza TNF-α inducida por la muerte celular y TNF-α se utiliza a menudo para provocar la apoptosis celular [30], [31], [32]. la señalización de NF-kappa B antagoniza TNF-α y agentes quimioterapéuticos apoptosis inducida mediante la promoción de la transcripción de genes anti-apoptóticos, tales como c-FLIP, la CIAP-1, CIAP-2, XIAP, survivin, Bcl-xL y Bcl-2. De esta manera, el bloqueo de la señalización de NF-KB puede potenciar TNF-α apoptosis inducida por [31], [32], [33], [34]. a continuación, se determinó si PMS1077 puede modular la expresión inducida de TNF-α de los genes anti-apoptosis Bcl-xL, Bcl-2 y survivina en las células DU145. En particular, después del tratamiento de TNF-α, la expresión de estos genes se ha mejorado, pero el tratamiento previo de las células con PMS1077 el regulado la expresión de estos genes de una manera dependiente de la dosis tanto en la proteína y el nivel de mRNA (Fig. 7D y 7E). También se encontró que la escisión inducida por TNF-α de PARP se incrementó significativamente por PMS1077 (Fig. 7F).