Extracto
Con la finalización de la secuencia del genoma humano, las ciencias biomédicas han entrado en el "ómicas" era, principalmente debido a las técnicas de genómica de alto rendimiento y la reciente aplicación de la espectrometría de masas para la proteómica análisis. Sin embargo, todavía hay un desfase entre estos avances tecnológicos y su aplicación en el ámbito clínico. Nuestro trabajo está diseñado para construir puentes entre la proteómica de alto rendimiento y la rutina clínica. Los extractos de proteína se obtuvieron de pulmón normal fresco congelado y no pequeñas muestras de cáncer de pulmón de células. Se aplicó un enriquecimiento fosfopéptido seguido por LC-MS /MS. Se realizaron análisis de cuantificación y bioinformática libre de etiquetas subsiguientes. Se evaluaron los patrones de proteínas en estas muestras, mostrando docenas de marcadores diferenciales entre el tejido normal y tumoral. la ontología de genes y vías de señalización interactoma análisis identifiquen alteraciones en el tejido tumoral. Hemos identificado dos proteínas, PTRF /Cavin-1 y el FOMIN, que se expresan diferencialmente entre normal del pulmón y el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Estos biomarcadores potenciales fueron validados mediante Western blot e inmunohistoquímica. La aplicación de la proteómica basada en el descubrimiento de los análisis en muestras clínicas nos ha permitido identificar nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas potenciales en el cáncer de pulmón de células no pequeñas
Visto:. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Calvo E, Agulló-MT Ortuño, López-Vacas R, Díaz E, et al. (2012) PTRF /Cavin-1 y MIF Las proteínas son identificadas como células no pequeñas de cáncer de pulmón Biomarcadores Proteómica por Label-libres. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10.1371 /journal.pone.0033752
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |
Recibido: 1 de diciembre de 2011; Aceptado: 16 de febrero de 2012; Publicado: 26 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Gámez-Pozo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas FIS CP05 /00248, PS09 /01597, Red Temática de investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC, RD06-0020-1022) del Instituto Carlos III de Salud (Ministerio de Ciencia e Innovación español, España) y becas de investigación por parte de la Fundación Mutua Madrileña. ISN es apoyado por la Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario La Paz. ED es apoyado por el subsidio CA10 /01447 del Instituto Carlos III de Salud. Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares español es apoyado por el Ministerio español de Ciencia e Innovación y la Fundación ProCNIC. El Biobanco IdiPAZ es apoyado por Carlos III Instituto de Salud, Ministerio de Salud español (RETIC RD09 /0076/00073) y Farmaindustria, a través del Programa de Cooperación en Investigación Clínica y Traslacional de la Comunidad de Madrid. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo. La tasa de supervivencia global a los 5 años es del 15% y no se ha mejorado durante décadas. Dos tercios de los pacientes son diagnosticados con la enfermedad avanzada que las opciones terapéuticas son paliativos, y hasta un 55% de los pacientes con enfermedad limitada con el tiempo sufren una recaída después de la cirugía radical [1].
perfiles de expresión génica ha conducido a la identificación de los grupos de los pacientes con diferentes resultados, lo que refleja la heterogeneidad de esta enfermedad [2]. Sin embargo, el gen a nivel de análisis no detectar cambios sutiles producidos por modificaciones posteriores a la traducción de proteínas [3]. Una profunda comprensión de los procesos de la carcinogénesis, la progresión tumoral y la metástasis requiere el análisis de tanto el genoma y el proteoma [4]. tecnologías proteómicas basadas en la espectrometría de masas (MS) se han convertido en componentes preferidos de una estrategia para descubrir biomarcadores de proteínas diagnósticas, pronósticas y terapéuticas [5]. Continuando con los avances en este campo dan a esta estrategia un enorme potencial para este tipo de investigaciones [6], [7].
Los ensayos clínicos recientes que demuestran una buena respuesta a los nuevos medicamentos en subgrupos específicos de pacientes subrayan la necesidad de pruebas moleculares que complementan procedimientos histopatológicos clásicos [8]. En este contexto, perfiles proteómicos puede proporcionar herramientas de biomarcadores valiosos para la estratificación del paciente eficiente y selección de la terapia.
A pesar de que es posible analizar las proteínas de los tejidos mediante espectrometría de masas [3], [9], la complejidad de la clínica muestra y la cantidad de proteína disponible son factores limitantes. Por lo tanto, se requiere el enriquecimiento de la muestra en analitos biológicamente relevantes [5]. La mayoría de los procesos celulares eucariotas están reguladas por la fosforilación de proteínas, y la desregulación de esta clave de modificación posterior a la traducción es común en el cáncer y otras enfermedades. Esto explica por qué las proteínas quinasas se han convertido en la principal clase de nuevos objetivos de medicamentos en oncología y otros campos [10]. En este trabajo se ha aplicado el enriquecimiento fosfopéptido junto con técnicas MS sin etiqueta para identificar ya conocidos y nuevos biomarcadores potenciales en los tejidos clínicos sobre el cáncer de pulmón de células no pequeñas y validarlos mediante Western blot e inmunohistoquímica.
Materiales y Métodos se obtuvo
Ética declaración
Institucional la aprobación de nuestro comité de ética para el desarrollo del estudio (comité ético de Investigación Clínica, hospital Universitario la Paz). Los datos fueron analizados de forma anónima. Los pacientes dieron su consentimiento por escrito para que sus muestras y datos clínicos podrían ser utilizados con fines de investigación.
Selección de la muestra
Las muestras congeladas de los pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón se recuperaron del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario La Paz (Madrid, España): adenocarcinoma de pulmón 5 (CA), 5 de pulmón carcinoma de células escamosas (SC) y 5 muestras normales de pulmón (NL). Las características histopatológicas de cada muestra fueron examinadas por un patólogo experimentado pulmonar para confirmar el diagnóstico y el contenido del tumor. Al menos el 50% de una muestra tuvo que ser formado por células tumorales para que sea elegible. Las muestras de pacientes fueron amablemente proporcionados por el Biobanco IdiPAZ (RD09 /0076/00073) integrado en el Hospital de Biobancos Red Española (RetBioH; www.redbiobancos.es). Las muestras fueron registradas y procesadas siguiendo los procedimientos actuales y se fijaron /congelados inmediatamente después de su recepción.
La extracción total de la proteína, la solubilización y la digestión
Las muestras se cortaron en un criostato Leica CM3050S, obteniendo 10 secciones de 10 micras de espesor de cada uno. El tejido se procesa con el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los análisis de MS, los pellets de proteína se resuspendieron en clorhidrato de guanidina 6 M y 10 minutos se calentó a 95 ° C con agitación. Posteriormente, se añadieron 950 l de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 7-9) por muestra. concentración de la muestra de proteína se midió por MicroBCA kit de ensayo de proteínas (Pierce-Thermo Scientific). Se añadió tripsina MS Grado Oro (Promega) a cada muestra a una relación 1:50. La digestión se llevó a cabo durante la noche a 37 ° C. La muestra digerida se dividió en dos alícuotas.
Paralelo IMAC (PIMAC)
enriquecimiento fosfopéptidos se llevó a cabo como se describe anteriormente [11]. Brevemente, Fe (III) a base de IMAC se realizó en una alícuota de la proteína digerida con el Select PHOS-hierro Affinity Gel (Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ga (III) a base de IMAC se realizó en otra alícuota de proteína digerida usando el kit de aislamiento de fosfopéptidos (Pierce-Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluidos se mezclan, y se almacena a -20 ° C para su posterior análisis por MS seca al vacío.
análisis LC-MS /MS
mezclas de péptidos se sometieron a cromatografía líquida acoplada nano-EM para la identificación de proteínas. Los péptidos se inyectan en un C-18 de fase inversa (RP) nano-columna (100 micras de identidad y 12 cm, Mediterranea mar, Teknokroma) y se analizaron en un gradiente de acetonitrilo continua que consiste en 0-40% de B en 90 min, 50 a 90 % de B en 20 min (B = 95% de acetonitrilo, ácido acético 0,5%). Al final del gradiente, la columna se lavó con 90% de B y se equilibró con 5% de B durante 20 min. Una velocidad de flujo de 300 nl /min para eluir los péptidos de la nano-RP columna a una aguja de nanopulverización emisor para la ionización en tiempo real y la fragmentación del péptido en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Thermo-Fisher). Un espectro de FT-resolución mejorada (resolución = 60.000) seguido de la MS /MS Los espectros de los cinco iones primarios más intensos se analizaron a lo largo de la serie cromatográfica (130 min). dinámica de exclusión se fijó en 1 min. Para proteínas espectros de fragmentación de identificación se realizaron búsquedas en contra de la base de datos MSDB (versión 091.509) utilizando el programa de la mascota 2,1 (Matrixscience). Se permitió dos divisiones perdidas, y un error de 10 ppm o 0,8 Da se fijó para la plena EM o búsquedas espectros MS /MS, respectivamente. Todas las identificaciones se realizaron mediante el software del Proteoma descubridor 1.0 (Thermo-Fisher). Búsqueda señuelo base de datos para el análisis falso descubrimiento tasa se fijó en 0,05 mediante la aplicación de filtros correspondientes. archivos de datos brutos fueron procesados y comparados con la versión 1.2 tamiz (Thermo-Fisher). la identificación de proteínas se validaron utilizando la herramienta BLAST de la suite BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Para una configuración detallada de huellas dactilares péptido masa y de identificación de proteínas, véase la Tabla S4.
inmunoblotting ensayos
Para los ensayos de inmunoblotting, gránulos de proteína se resuspendieron en 2% SDS y 10 minutos se calienta a 95 ° C con agitación . concentración de la muestra de proteína se midió por MicroBCA kit de ensayo de proteínas (Pierce-Thermo Scientific) borrones .western se realizaron utilizando el sistema de WesternDot (Invitrogen) de diámetro interno en un SNAP dispositivo (Millipore). Se utilizaron anticuerpos y dilución 1:125 PTRF (BD Biosciences); anticuerpos MIF 1: 250 dilución (R & D Systems amplificador). análisis de densitometría se realizaron utilizando software ImageJ 1.38e (http://rsb.info.nih.gov/ij/) para medir la intensidad de las bandas. Para la normalización de transferencia Western, la carga total de proteínas se midió usando el kit de Novex reversible de la membrana de la mancha (Invitrogen).
La inmunohistoquímica
, bloques de tejido incluido en parafina y fijado en formalina representante de pulmón normal y no -pequeña diagnóstico de cáncer de pulmón de células, se recuperaron después de una evaluación histopatológica de rutina. Las secciones fueron procesadas utilizando un sistema universal de tinción Dako Autostainer (Dako). Para este estudio, 3,5-micras secciones se inmunotiñeron con anticuerpos anti-MIF 1:2000 (R & amp; D Systems) o anti-PTRF 1:100 (BD Biosciences). Las imágenes se obtuvieron en un microscopio con un aumento de Leyca × 40. Se obtuvo el porcentaje de tejido de colores y la intensidad de tinción (0, +, ++ o +++) para cada muestra y marcador evaluado. tinción IHC se consideró positiva cuando al menos el 50% del tejido (normal o tumoral) se tiñó con al menos ++.
Análisis estadísticos
Los valores de expresiones entre grupos de la muestra se compararon mediante una prueba de Kruskal -Wallis prueba (aproximación de Gauss). Para evaluar las diferencias entre pares de grupos se utilizó el test de comparación múltiple de Dunn. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo. Los valores de densitometría colador y se compararon mediante el coeficiente de correlación de Pearson
Bioinformática
listas de proteínas se procesan utilizando la base de datos para anotación, y Visualización Integrada y Descubrimiento (DAVID) versión 2.0 (http:. //David. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. Para identificar las categorías funcionales sub y sobre-representadas Se utilizó el análisis de proteínas a través Relaciones Evolutivas (Panther) de base de datos v 6.1 (www.pantherdb.org) [14]. lista de proteínas tumorales se compara con la lista pulmonar normal mediante la prueba binomial [15] para cada función molecular, proceso biológico o término vía en PANTHER. interacciones proteína-proteína se obtuvieron de la herramienta de búsqueda para la recuperación de los genes que interactúan /Proteínas (CADENA) v9.0 base de datos con conocidos y previstos interacciones proteína-proteína físicas y funcionales [16]. Se utilizó STRING en el modo de proteínas, y sólo las interacciones basa en la interacción proteína-proteína experimental y comisariada databases- con los niveles de confianza más 0.5- fueron mantenidos.
Resultados
En este estudio, se evaluaron las diferencias a nivel de proteínas entre el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y el tejido normal de pulmón utilizando una estrategia de enriquecimiento fosfopéptido y un enfoque sin etiqueta. Las muestras fueron analizadas en un LTQ-Orbitrap XL después de ser sometido a cromatografía líquida. Puesto que se sabe que las diferentes técnicas de aislar segmentos distintos y solapados de la phosphoproteome [17], incluyendo Fe (III) y Ga (III) IMAC [18], se mezclaron el Fe (III) y Ga (III) fracciones IMAC de cada de la muestra y los analizó juntos.
Se evaluó el número de péptidos únicos y sus proteínas correspondientes, así como fosfopéptidos y fosfoproteínas sus correspondientes, identificadas en el adenocarcinoma de pulmón (AC), carcinoma de células escamosas de pulmón (SC) y normal pulmonar (NL) muestras que solicitan una búsqueda señuelo base de datos a una tasa de falso descubrimiento & lt; 0,05. El extenso análisis realizado en las muestras de NSCLC y NL mediante LC-MS /MS nos ha permitido identificar una media de 381 péptidos únicos por ejemplo, de las cuales una media de 56 fueron fosfopéptidos. Estos péptidos corresponden a una media de 138 proteínas únicas identificadas por muestra, de los cuales se fosforilaron una media de 39. La fracción de fosfopéptidos identificados (número de péptidos fosforilados * 100 /número de péptidos identificados) fue del 19,9%. Se llevaron a cabo
análisis de ontología de genes utilizando todas las proteínas identificadas. La lista proteína tumoral se compara con la lista de proteína pulmonar normal para cada función molecular (Figura S1), proceso biológico (Figura S2), o vía (Figura 1) utilizando términos PANTHER. Este enfoque mostró diferencias significativas entre las muestras de pulmón y tumores normales (análisis completos se proporcionan en la Tabla S1). Las diferencias en las funciones moleculares están principalmente relacionadas con la interacción con ácidos nucleicos y la regulación de la síntesis de proteínas y la actividad. Procesos que controlan la exocitosis, respuesta inmune, respuesta al estímulo, respuesta al estrés y el transporte fueron significativamente subrepresentados en los tumores, mientras que las categorías relacionadas con la adhesión o la respuesta a la toxina célula-matriz se sobre-representados. Por otra parte, las categorías de homeostasis están insuficientemente representadas, mientras que las categorías relacionadas con la producción de energía y la proliferación celular se sobre-representados en los tumores. diferencias notables en la vía de análisis aparecieron en categorías relacionadas con el control de transducción de señales. Si bien la regulación del citoesqueleto de Rho GTPasa, la inflamación mediada por quimioquinas y citoquinas vía de señalización, la integrina vía de señalización de Wnt vía de señalización están insuficientemente representadas en las muestras tumorales, receptor de EGF vía de señalización, glucólisis, ruta de p53 y la vía de la cinasa PI3 fueron excesivamente representados.
Comparación de la cantidad de proteínas asignados a cada categoría GO vía. Normales categorías de muestras de tejido se representan como factor de cambio en relación con esta categoría. La significación estadística se prueba mediante la prueba binomial. se muestran
análisis de la expresión diferencial entre NSCLC vs. pulmonar normal se realizó utilizando el software tamiz de 1.2; únicas categorías significativas (P & lt 0,05).. Se encontró un total de 296 picos m /z expresados diferencialmente, 115 de los cuales tenían disponibles espectros MS2, lo que lleva a la identificación de proteínas expresadas diferencialmente entre las muestras de pulmón normal y CPNM (Tabla 1). Todos los datos obtenidos de los análisis de tamiz, incluidos los valores relativos de expresión, se proporcionan en la Tabla S2.
PTRF /Cavin-1 y MIF Outstand entre los biomarcadores expresados diferencialmente entre NSCLC y las muestras de pulmón normal en la etiqueta libre análisis como la más regulada hacia abajo y hasta regulado, respectivamente (Figura 2). PTRF /Cavin-1 mostró pérdida de la expresión tanto en muestras adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Por otro lado, MIF mostró un incremento en la expresión en estas muestras. Con el fin de evitar identificaciones falsas positivas, más de veinte espectros MS2 para cada MIF y PTRF /Cavin-1 péptidos se evaluaron de forma manual (figuras S3 y S4 y S3 cuadro). Los cambios en PTRF /Cavin-1 y la expresión MIF en muestras de NSCLC se validaron mediante inmunohistoquímica (IHC) y el análisis de Western blot. Las mismas muestras utilizadas para MS /MS análisis y nueve muestras adicionales de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y el pulmón normal fueron evaluados para MIF y PTRF mediante Western blot. Se evaluaron cinco muestras adicionales de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y el pulmón normal para MIF y PTRF usando IHC. Todos los tumores muestran una tinción positiva para el MIF y tinción negativa para PTRF, mientras que todos los tejidos normales fueron negativas para MIF y positivo para la tinción PTRF. MIF se confirmó la sobreexpresión en tejidos tumorales tanto por IHC y transferencia de western (Figuras 3 y 4). Por otra parte, las muestras de tumor confirmaron la pérdida de PTRF /expresión cavin-1 en comparación con el pulmón normal (Figuras 3 y 4) el uso de ambas técnicas. de correlación de Pearson entre el tamiz-etiqueta libre expresión de los valores y la cuantificación de western blot fue de r = 0,723 yr = 0,754 (p & lt; 0,005) para el FOMIN y PTRF /Cavin-1, respectivamente percentil
Boxplots representan la media y el 25-75. ; bigotes representan mínimo y máximo. Las mediciones se obtienen a partir de cinco muestras diferentes en cada condición. se muestran los valores de p de la prueba de Kruskall-Wallis. AC: El adenocarcinoma; Carolina del Sur: el carcinoma de células escamosas; NL:. Pulmonares normales
a) transferencia de Western de la proteína total extraído de muestras indicadas, utilizando anti-MIF y anti-PTRF /Cavin-1 anticuerpos primarios. b) Análisis densitométrico de western blot. software ImageJ 1.38e fue empleado para medir la intensidad de las bandas. Todos los valores en unidades arbitrarias. c) La inmunohistoquímica de muestras indicadas, utilizando anti-MIF y anti-PTRF /Cavin-1 anticuerpos primarios. AC: El adenocarcinoma; Carolina del Sur: el carcinoma de células escamosas; NL:. Pulmonares normales
gráficos Box-Plot que muestran PTRF y MIF cuantificación Western blot utilizando el software ImageJ 1.38e. Todos los valores en unidades arbitrarias. Cada caja incluye los valores de nueve muestras diferentes. Las diferencias entre las muestras normales y tumorales fueron p. & Lt; 0,005 en ambos casos (Kruskall-Wallis test) guía empresas
Se realizaron búsquedas en la base de datos STRING para conexiones interactomic de MIF y PTRF. Con el fin de minimizar la tasa de falsos positivos, eliminamos socios utilizando criterios estrictos, y las interacciones experimentales única proteína-proteína y las vías de bases de datos curados fueron tomadas en cuenta. PTRF está incluido en la vía de la transcripción de ARN, e interactúa físicamente con TTF1. Otras interacciones PTRF comprenden proteínas implicadas en la regulación de la transcripción y EGFR (Figura 5). MIF está relacionado con la vía de metabolismo de la fenilalanina, e interactúa con p53 y proteínas del complejo signalosome COP9, un complejo implicado en diversos procesos celulares y de desarrollo, incluyendo la degradación mediada por la fosforilación de p53 [19]. Otras interacciones comprenden proteínas relacionadas con la regulación de la muerte celular y el proceso inflamatorio (Figura 6).
Se muestra
Un gráfico de la red PTRF construye a partir de v9.0 cadena. Los diferentes colores de las líneas representan los tipos de pruebas para la asociación:. Rosa para experimentos y azul para las bases de datos
Un gráfico de la red MIF construye a partir de v9.0 se muestra STRING. Los diferentes colores de las líneas representan los tipos de pruebas para la asociación:. Rosa para experimentos y azul para las bases de datos
Discusión
Proteómica en general y, en particular, fosfoproteómica se están convirtiendo en los métodos preferidos de proteínas Los análisis basados en el descubrimiento. El uso de enfoques libre de marca, basados en el descubrimiento puede ayudar a descubrir las conexiones biológicas inesperadas debido a la ausencia de sesgo conocimientos previos. herramientas bioinformáticas, tales como la ontología de genes y interactoma análisis, aplicados en muestras clínicas tienen un gran potencial para identificar las vías y moléculas con implicación a nivel terapéutico y pueden ofrecer pistas sobre la génesis de las enfermedades y sus alteraciones moleculares subyacentes. Sin embargo, tanto la propia tecnología y herramientas de análisis de datos deben ser refinado antes de su entrada en la clínica.
fosfopéptidos enriquecimiento de las muestras antes del análisis mediante MS PIMAC funcionó razonablemente bien, ya que el 20% de los péptidos fueron medidos fosforilada. Estudios anteriores han demostrado un enriquecimiento de fosfopéptidos de aproximadamente el 50% utilizando un protocolo similar al nuestro IMAC en digesto tríptico de una mezcla de varias proteínas de referencia [20]. Teniendo en cuenta que las muestras eran muy complejos y que no utilizan ninguna etapa de fraccionamiento, el enriquecimiento fosfopéptido fue un éxito y comparable con la obtenida en trabajos anteriores [21], [22]. Sin embargo, la mayoría de los espectros mostrando una pérdida de fosfato presentó una pobre fragmentación, y no se generó ninguna identificación de péptidos. El uso de las nuevas técnicas de fragmentación, como una mayor energía de disociación de colisión, mejorar la calidad de los espectros de fragmentación [23], lo que permite realizar el análisis de phosphoproteome a gran escala.
Gene ontología análisis de los procesos biológicos y las vías mostró un aumento de la categorías relacionadas con la producción de energía en las células, tales como la glucólisis y la generación de metabolitos precursores y la energía. Estas diferencias en el metabolismo de la energía entre las células normales y tumorales se conocen como efecto Warburg [24]. De las vías de señalización insuficientemente representadas en los tejidos de NSCLC, la inflamación y chemokine- mediada por citoquinas ha sido previamente demostrado ser insuficientemente representadas en NSCLC [25]. Es notable la sobrerrepresentación de las proteínas que pertenecen a la vía de señalización del EGFR, en un contexto en el uso clínico de los inhibidores de EGFR se ha convertido en el paradigma de la terapia personalizada para el NSCLC [26], [27], [28].
Más de 10% de los péptidos detectados mostró una expresión diferencial entre las muestras normales y tumorales. El porcentaje de péptidos diferenciales fue inferior al 2% al comparar muestras de carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma de pulmón, pero aún había diferencias sustanciales entre estos dos subtipos histológicos de NSCLC, como hemos demostrado anteriormente [11].
No hemos capaz de validar NSCLC posibles marcadores biológicos identificados en la proteómica escopeta y los análisis con el IHC western blot. MIF (macrófagos, factor inhibidor de la migración) discrimina entre pulmonar normal y muestras de NSCLC. Este factor bien conocido es una citoquina proinflamatoria capaz de actuar como factor de crecimiento soluble, expresada y secretada en respuesta a mitógenos y señales de integrina mediada. proteína MIF está implicado en muchos tumores malignos, ya que promueve la transformación celular, inhibe la respuesta inmune citolítica contra las células tumorales y promueve la neovascularización [29]. análisis interactoma revelaron una estrecha relación entre la regulación de la muerte celular y MIF, y no es sorprendente que MIF fue descrito sobre-expresión en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer colorrectal, de mama, de próstata, de piel y cáncer de pulmón [30], [31], que tiene un papel importante en el desarrollo de tumores en el sistema nervioso central [32]. Tumores co-expresión de MIF y su receptor de membrana (proteína CD74) han aumentado la vascularización [33]. Aunque hay varias moléculas que inhiben la actividad enzimática de MIF, su alto IC50 ha limitado su uso clínico hasta la fecha [34], pero las nuevas moléculas están actualmente en desarrollo [35]. Nuestros resultados muestran un incremento en la expresión de MIF en muestras de NSCLC mediante proteómica libre de etiquetas, confirmada tanto por western blot e inmunohistoquímica.
PTRF (Polimerasa I y transcripción Factor de liberación), también conocido como Cavin-1, es una proteína esencial para la transcripción del RNA [36] y la formación de caveolae [37]. Estas invaginaciones de la superficie celular se asocian con procesos de transporte vesicular, la homeostasis del colesterol, de transducción de señales [38] y el control de la lipólisis [39]. Por lo tanto, no es sorprendente que las mutaciones PTRF /cavin-1 están asociados con lipodistrofia congénita generalizada, tipo 4 en los seres humanos [40]. PTRF /Cavin-1 colocaliza con caveolina 1 (CAV1) dentro de caveolae [41], y modula positivamente su expresión [42]. análisis interactoma sugieren que PTRF alberga funciones desconocidas más allá de algunos descrito recientemente [43], [44], [45]. La pérdida de PTRF /cavin-1 expresión en el cáncer de próstata se ha relacionado con la progresión de [46], y se ha demostrado que su expresión disminuye la migración de PTRF /Cavin-1 deficiente en células de cáncer de próstata [47]. La pérdida de PTRF /expresión cavin-1 en células HBE tumorigénicas en comparación con las células epiteliales bronquiales humanas normales se ha demostrado recientemente [48]. Bai y sus colegas han informado recientemente que la proteína PTRF se había reducido regulado en líneas celulares de cáncer de mama y el tejido del tumor de mama, y que la baja regulación de PTRF en células de cáncer de mama se asoció con el promotor metilación [49]. PTRF /cavin-1 especies fosforiladas se han descrito en las células que sobre expresan EGFR, lo que sugiere una función en esta vía de señalización [50]. Nuestros resultados proteómica libre de etiquetas indican que la expresión PTRF se pierde en las muestras de NSCLC. Estos resultados se confirmaron usando tanto de transferencia de Western y tinción inmunohistoquímica. Este es el primer estudio que muestra PTRF /cavin-1 pérdida de la expresión en el tejido tumoral NSCLC a nivel de proteínas. Esta pérdida de expresión, junto con la interacción PTRF-EGFR y EGFR vía desregulación en muestras de NSCLC, sugiere un papel en el desarrollo de PTRF NSCLC.
Nuestro trabajo demuestra que es posible identificar biomarcadores potenciales utilizando una etiqueta libre estrategia proteómica diferencial en muestras clínicas reales. Se identificaron varios marcadores diferenciales, dos de los cuales fueron validados por métodos proteómicos clásicos alternativos. Por otra parte, nos muestran que la ontología de genes y la interacción análisis puede identificar vías y procesos alterados en el tejido tumoral, que puede proporcionar pistas sobre la génesis de la enfermedad y sus alteraciones moleculares subyacentes, y que podrían ser susceptibles a la intervención terapéutica. En este sentido, este trabajo indica que el papel PTRF en CPNM y su relación con la vía del EGFR merece una mayor exploración.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Análisis de las diferencias en la función GO molecular entre NSCLC y pulmonar normal. La comparación de varias proteínas asignados a cada categoría GO vía. Normales categorías de muestras de tejido se representan como factor de cambio en relación con esta categoría. La significación estadística se prueba mediante la prueba binomial. se muestran
doi; únicas categorías significativas (0,05 p & lt): 10.1371 /journal.pone.0033752.s001 gratis (TIF)
figura S2..
Análisis de las diferencias en GO proceso biológico entre el NSCLC y pulmonar normal. La comparación de varias proteínas asignados a cada categoría GO vía. Normales categorías de muestras de tejido se representan como factor de cambio en relación con esta categoría. La significación estadística se prueba mediante la prueba binomial. se muestran
doi; únicas categorías significativas (0,05 p & lt): 10.1371 /journal.pone.0033752.s002 gratis (TIF)
Figura S3.. La fragmentación
espectros de péptido tríptico PTRF SLKESEALPEK. El diagrama muestra los fragmentos de iones correspondientes a la serie principal de la fragmentación (b-amino-e y carboxi). * Indica la pérdida de agua; 2+, doblemente cargado fragmento. ión parental está marcado con una flecha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s003 gratis (TIF)
figura S4. La fragmentación
espectros de MIF PMFIVNTNVPR péptido tríptico. El diagrama muestra los fragmentos de iones correspondientes a la serie principal de la fragmentación (b-amino-e y carboxi). * Indica la pérdida de agua. ión parental está marcado con una flecha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s004 gratis (TIF)
Tabla S1. Los análisis de ontología de genes
realiza con PANTHER. proteína lista pulmonar normal se utilizó como referencia la lista
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s005 gratis (PDF) sobre Table S2.
tamiz etiqueta libre de la cuantificación. Los datos obtenidos de los análisis de tamiz, incluidos los valores relativos de expresión
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s006 gratis (PDF) sobre Table S3.
PTRF y espectros MS2 MIF.
doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s007 gratis (PDF) sobre Table S4.
péptido masa de huellas dactilares y la configuración de la identificación de proteínas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s008 gratis (DOC)
Reconocimientos
Queremos reconocer especialmente los pacientes de este estudio por su participación y el Biobanco IdiPAZ integrado en el hospital de Biobancos Red española (RetBioH; www.redbiobancos.es), por las generosas donaciones de muestras clínicas utilizadas en este trabajo
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