Extracto
Una nueva generación de fármacos contra el cáncer dirigidos subyacente eventos conductor genéticas somáticas han dado lugar a alta agente único o las tasas de respuesta de la vía única en pacientes seleccionados, pero son pocos los pacientes a lograr respuestas completas y una fracción considerable de pacientes recaen dentro de un año. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para la identificación de combinaciones de agentes dirigidos que inducen respuestas más completas y prevenir la progresión de la enfermedad. Se describen los resultados de una pantalla de combinación de una escala sin precedentes en células de mamíferos realizados usando una colección de agentes dirigidos, clínicamente manejables a través de un gran panel de líneas celulares de melanoma. Nos encontramos con que incluso los pares de la droga más sinérgicos son eficaces sólo en un número discreto de líneas celulares, subyace una fuerte dependencia del contexto de sinergia, con fuertes sinergias generalizadas frecuencia correspondiente a efectos no específicos o fuera de objetivo de drogas tales como la proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 la inhibición del transportador (MDR1). Se identificaron los fármacos sensibilizantes líneas celulares que son BRAF mutante
V600E pero intrínsecamente resistentes a PLX4720 inhibidor de BRAF, incluyendo el endotelio receptor del factor de crecimiento /quinasa de dominio de inserción de receptor vascular (VEGFR /KDR) y plaquetas factor de crecimiento derivado del receptor (PDGFR) inhibidor de la familia cediranib. La combinación de cediranib y la apoptosis inducida por PLX4720
in vitro
y la regresión del tumor en modelos animales. Esta interacción sinérgica es probablemente debido al acoplamiento de múltiples receptores tirosina quinasas (RTK), lo que demuestra el potencial de las drogas en lugar de enfoques combinación de descubrimiento de genes específicos. Los pacientes con niveles elevados de expresión de KDR biopsia mostraron disminución de la supervivencia libre de progresión en los ensayos de mitógenos proteína quinasa activada por inhibidores de la vía (MAPK) quinasa. Por lo tanto, el cribado de alto rendimiento imparcial de combinaciones de fármacos dirigidos, con la selección de biblioteca adecuada y mecanicista de seguimiento, puede producir combinaciones de fármacos clínicamente recurribles
Visto:. Friedman AA, Amzallag A, Pruteanu-Malinici I, Baniya S, Cooper ZA, Piris A, et al. (2015) Paisaje de Targeted Anti-Cancer Drug sinergias en el melanoma Identifica una combinación Novel BRAF-VEGFR /PDGFR tratamiento. PLoS ONE 10 (10): e0140310. doi: 10.1371 /journal.pone.0140310
Editor: Suzie Chen, de la Universidad de Rutgers, Estados Unidos |
Recibido: 22 Agosto, 2015; Aceptado: September 24, 2015; Publicado: 13 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Friedman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por los Institutos nacionales de Salud (P01CA163222 y R21CA175907 a DEF; 1K08CA160692-01A1 y U54CA163125 a la mandíbula, 1U54HG006097-01 a CHB), la Fundación Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson Investigación médica (DEF), la Fundación médica Doris Duke (DEF), una beca de la Fundación Elsa U. Pardee (DEF), un Premio de Investigación y Educación Fred Lovejoy Residente (AAF), una Brigham Departamento y hospital de Mujeres de Dermatología NIH subsidio de estudios T32AR007098-38 (AAF), y subvenciones de la Wellcome Trust (086357 y 102696; CHB, DAH)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia .
Introducción
A pesar de que las tasas de respuesta dentro de las subpoblaciones genéticamente seleccionadas de pacientes con cáncer de tumores sólidos pueden ser altos, tales como el 60-80% de los
BRAF
V600E
pacientes con melanoma mutantes que recibieron el inhibidor de BRAF vemurafenib [1], algunos pacientes a lograr un solo agente respuestas completas. Por lo tanto, un número significativo de los pacientes tienen resistencia intrínseca a la inhibición vía MAPK. Incluso entre los pacientes que no responden, la mayoría desarrollarán resistencia adquirida dentro de un año, a menudo debido a mutaciones adicionales o vías de derivación [2, 3]. Recientemente, varios grupos han descubierto los mecanismos de resistencia adquirida a la terapia BRAF-dirigida, por lo general en líneas de células inicialmente sensibles como A375 [4-7], que apunta a la complejidad de la identificación de salvamento estrategia terapéutica y pocos estudios han abordado
de novo
resistencia a vemurafenib en el contexto BRAF
V600E [8]. Las combinaciones de fármacos tienen el potencial para hacer frente a
de novo y la resistencia adquirida, pero la predicción de la actividad de la combinación de fármacos de los agentes individuales aún no es factible en parte porque sólo existen relativamente pequeños conjuntos de datos de combinación. descubrimiento basado en Candidato de dianas de medicamentos de combinación tales como tumores de secuenciación para mutaciones adicionales somáticas controlador [8] o imparciales pantallas de RNAi o de ADNc pueden producir objetivos procesables. Sin embargo, estos enfoques pueden pasar por alto la posibilidad de interacciones de orden superior con inhibidores dirigidos múltiples proteínas y su relevancia clínica puede depender de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos largas alrededor de nuevos objetivos. Por otra parte, basado en una fuerte dependencia del contexto visto para la actividad de agente único, se espera que la actividad y la sinergia combinaciones serán también contexto específico. Sin embargo, todavía no está claro si las combinaciones de agentes dirigidos podrían ser eficaz en una amplia gama de subtipo de tumor, por lo que es aplicable a más pacientes que su único componente de agente o si la resistencia debe ser abordado por un gran número de combinaciones específicas de contexto abordar grupos más pequeños de pacientes que los agentes individuales que constituyen. Varios grupos han comenzado a identificar las interacciones fármaco-fármaco de una manera imparcial en las células del cáncer [9, 10], que se han producido importantes conocimientos. Hemos descrito previamente la detección de drogas como agente único a escala masiva, a través de un gran panel de líneas celulares de cáncer definidos genotípicamente-[11]. Para entender el panorama general y el potencial de interacción fármaco-fármaco escala de cribado a través de líneas celulares de cáncer como una fase inicial de una combinación del cáncer de células de línea (C
3) proyecto, que exhibió una gran colección de líneas celulares de melanoma a través de varios miles combinaciones de inhibidores específicos. El melanoma se ha seleccionado teniendo en cuenta la disponibilidad de un gran número de líneas celulares que albergan un oncogen mutado común (BRAF
V600E) y una terapia dirigida validado.
Resultados
combinación sistemática sinergia de drogas descubrimiento
Para conocer el paisaje de combinaciones sinérgicas clínicamente relevantes agentes dirigidos en el cáncer, se conformó una biblioteca de 108 compuestos. Ya que estaban interesados en la búsqueda de combinaciones de fármacos con potencial para la traducción clínica y para las que el mecanismo de acción sería manejable, se seleccionaron los medicamentos oncológicos bien caracterizados aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) o en ensayos clínicos finales de los años; dos tercios de estos agentes han estado en uso clínico (Fig 1A y en la Tabla S1). Se seleccionaron los inhibidores de transducción de señales más prometedores en el desarrollo clínico y los que proporcionan una gran diversidad de dianas moleculares para cubrir ampliamente la señalización de cáncer de las vías; esta categoría constituye la gran mayoría de nuestra biblioteca, en 67/108 drogas. Complementamos estos con drogas dirigidas a los reguladores del ciclo celular, moduladores epigenéticos, los receptores nucleares de hormonas y otros mecanismos novedosos bajo investigación preclínica intensa. Por último, se incluyeron un número limitado de fármacos representativos de los principales quimioterapias citotóxicas tradicionales. Este panel de drogas se expande sustancialmente más allá de una pantalla de combinación informó recientemente en el melanoma utilizando 40 drogas [10]. Se seleccionó un grupo de 36 líneas de células de melanoma que representa las principales clases genotípicas (S2 Tabla) e incluyó seis cultivos novedosos derivados del paciente a corto plazo de melanoma (& lt; 10 pasajes de la biopsia). De las 30 líneas celulares establecidas previamente 19 se han caracterizado a nivel genómico con más detalle (S2 Tabla). En general, esta pantalla se dirige a un número mucho mayor de combinaciones de fármacos y líneas celulares que se informó anteriormente [9, 10, 12]. Teniendo en cuenta las limitaciones prácticas de cribado de un gran número de combinaciones a través de matrices de dosis completa de combinaciones, se seleccionaron dos combinaciones de dosis de razón fija. Se realizó una pantalla de ejecución en el otro lado de diez líneas celulares para elegir las dosis que dieron lugar a & gt; 70% de viabilidad para capturar eventos letales sintéticos (datos no mostrados). Luego construyó una biblioteca de todas las 5.778 combinaciones correspondientes a todas las posibles combinaciones de dos medicamentos a través de los 108 medicamentos y fármacos individuales. Hemos examinado en formato de ultra-alto rendimiento de 1.536 pocillos usando de alto contenido y lectura basada en el análisis de imágenes automatizado de recuento de células mediante tinción nuclear (Figura 1B). Además de recuento de células por tinción nuclear, también mapeado sistemáticamente los efectos de combinación de fármacos sobre la muerte celular mediante el uso de anticuerpos contra simultáneamente PARP escindida y normalizando a recuento nuclear total para obtener una puntuación muerte celular. En total, para todas las combinaciones de fármacos a dos concentraciones en todas las líneas celulares y medir tanto el recuento de células y la muerte celular, hemos generado un paisaje de & gt; 800.000 puntos de datos de drogas combinatorias (S3 tabla). Dada nuestra limitada cobertura de la matriz de la dosis del fármaco-fármaco, se utilizó la independencia métrica de dicha sinergia para representar los efectos inesperados de combinación [13-15].
(A) Resumen de la etapa de desarrollo clínico de 108 medicamentos incluidos en el panel de la combinación de fármacos. (B) Ejemplo de UHTS primas generan los datos, lo que demuestra el recuento de células la información recogida de los canales y la apoptosis de datos DAPI de inmunofluorescencia PARP escindida; control positivo de HSP90 inhibidor se muestra el tratamiento 17-AAG. (C) matriz Resumen de los datos de drogas combinatoria, con cada punto que representa el efecto de uno de 5.778 combinaciones a la concentración de fármaco estándar, como el efecto medio de la combinación de fármacos a través de todas las líneas celulares 36 melanoma en el recuento de células relativo (izquierda) y la puntuación de la dicha sinergia calculado para esa combinación (a la derecha). (D) Histograma del número de líneas celulares de una combinación de fármacos dada mostró sinergia. Número máximo de sinergias fueron vistos en una línea celular, lo que indica muchas sinergias son privadas. (E) Como en (C), que muestra la mediana del efecto de la combinación de fármacos (a una concentración estándar) en la proporción relativa positiva CPARP (izquierda) y la sinergia dicha calculado para ese nivel CPARP (derecha). (F) Representación gráfica de combinaciones de medicamentos (fármacos en par conectados por una arista) que mostró una significativa inesperadamente alta CPARP más de un nivel previsto en el recuento de células dado. tamaño de los ganglios indica el número de pares de drogas que aparece el fármaco se administra con otros fármacos en la lista de "inesperadamente apoptosis". color del borde indica la concentración de drogas par (estándar o baja), donde se encontró el CPARP elevado; patrón de borde indica si el CPARP elevada se encontró en el entorno de bajo recuento o recuento de células normales (& gt; el control del 80%)., con CPARP elevada en la configuración de la viabilidad normales que representan potencialmente "lento" cinética de muerte para esa combinación
el análisis inicial de los valores de sinergia mostró que un gran número de combinaciones demostró & gt; 40% de la independencia de Bliss en más de una línea de células, incluyendo varios fármacos con amplia letalidad y la sinergia cuando se combina con cualquier otro fármaco a través de la colección de la línea celular (Figura 1C). Sin embargo, sólo el 0,3% de combinaciones sinérgicas demostró verdadera letalidad sintética, donde los fármacos individuales tenían ningún efecto (& gt; 80% de viabilidad) pero fuerte viabilidad sinérgico & lt; 50%. Por lo tanto, la mayoría de los fármacos con interacciones sinérgicas muestran algún efecto medible de al menos un agente único. Hemos observado que algunos fármacos células a muchos otros fármacos sensibilizados; éstos incluyen el bortezomib inhibidor del proteasoma, el pro-apoptótica linfoma de células B ABT263 inhibidor 2 (BCL2) miembro de la familia, y la vincristina inhibidor de microtúbulos (Figura 1C). Curiosamente, la mayoría de las combinaciones de fármacos que muestran sinergia mostró tal sinergia en tres o menos líneas (56%; Fig 1D). Por lo tanto, la mayoría de los efectos de la combinación de drogas dependen en gran medida del contexto celular. Incluso combinaciones que muestran sinergias profundas en un subconjunto de líneas celulares no son sinérgicos o eficaz en otras líneas celulares. Curiosamente, esto es cierto incluso para las combinaciones que se espera que sean muy ampliamente sinérgico porque se dirigen a dos procesos celulares mecánicamente complementarias. Por ejemplo, la combinación de gemcitabina, un agente deteriorante del ADN, junto con el daño en el ADN vía de reparación del inhibidor de la quinasa CHK1 AZD-7762, es fuertemente sinérgica en sólo un subconjunto (6/36) de las líneas celulares. Si bien esto podría ser debido a diferencias en la tasa de daño en el ADN a través de líneas de células, se observó varios otros casos de fuertes sinergias que se ven sólo en unas pocas líneas.
Una serie de fármacos inducidos aumento de muerte celular, medida por CPARP , incluyendo ABT263 y la amplia midostaurina inhibidor de quinasa (Fig 1E). Menos drogas muestra amplia sinergia en la inducción CPARP en comparación con el recuento de células; una excepción fue la nilutamida, un antagonista del receptor de andrógenos. En general, las combinaciones fármaco-fármaco Reducción del número de células después de 72 horas también mostraron un aumento en el porcentaje de células positivas para la tinción CPARP (cinética "rápidos"). Sin embargo, un subconjunto de combinaciones aumentó CPARP sin afectar el recuento de células (S1A y S1B Fig). Nuestra hipótesis es que este subconjunto probablemente representa la cinética de combinaciones con "lento" de la inducción de la muerte celular. Hemos desarrollado un modelo de regresión para esta relación para identificar estas combinaciones de valores atípicos que inducen apoptosis en cada línea celular. En general, un 4% de las combinaciones mostraron un aumento de CPARP exceso con relación al recuento de células. fármacos específicos inducen la apoptosis de forma inesperada con más frecuencia en este conjunto de combinaciones (Figura 1F). No es de extrañar, ABT263 indujo alta CPARP ampliamente en relación con el recuento de células y se enriqueció en ambos "lentas" patrones cinéticos combinaciones "rápidas" y. Curiosamente, fingolimod, un agonista parcial de SP1R, un receptor se cree que participan en el reconocimiento de las células apoptóticas por células inmunes en lugar de en la celda regulación autónoma de la apoptosis y bortezomib mostró un patrón "rápida" de inducción de muerte. Por el contrario, FK866, un inhibidor de la nicotinamida fosforribosiltransferasa mostró un patrón de "lento" de la inducción de la apoptosis.
sinergia de Drogas y fuera de objetivo efectos
Para priorizar las combinaciones sinérgicas para su posterior disección mecanicista, primero analizaron interacciones fármaco-fármaco con los puntajes más fuertes de independencia de Bliss en todo el mayor número de líneas celulares. Varias de estas interacciones se han descrito previamente en la literatura, la validación de la pantalla en la identificación de
de buena fe
interacciones sinérgicas. Entre éstos se incluye MK1775, un inhibidor de WEE-1, y AZD7762, un CHK1 /2 inhibidor (S2A Fig); inhibición dual de ambas quinasas de punto de control del ciclo celular se han descrito previamente en múltiples tipos de tumores en cultivo celular y
in vivo
[16]. interacción sinérgica entre los inhibidores selectivos y la inhibición miembro de la familia BCL2 se ha descrito anteriormente [17, 18] y que también se observó una interacción entre tales dosis altas de CHIR265, un inhibidor de pan-Raf, y ABT263 (S2B Fig). ABT263 también sensibiliza un gran número de líneas de células (& gt; 10) en la pantalla principal para bortezomib y el fitoquímico indol-3-carbinol. Un particularmente fuerte interacción sinérgica se observó entre BI78D3, un inhibidor de JNK y TZDZ8, un inhibidor de GSK3 (S2C figura). Sin embargo, no hemos podido observar una sinergia de RNAi desmontables de cualquiera clase de destino, junto con el tratamiento farmacológico (S2D la figura) o entre una colección ampliada de otros compuestos de la herramienta de JNK y GSK3 (S2E la figura); Además, esta sinergia se observó en una variedad de otras células transformadas y no transformadas (S2F FIG), lo que sugiere que era un transformadas no amplio, idiosincrásica, y fuera del objetivo citotóxico interacción sinérgica poco probable que sea clínicamente útil debido a su actividad contra las células.
Hemos seleccionado una de estas fuertes interacciones sinérgicas para una mayor investigación mecanicista. Se observó una fuerte interacción entre lapatinib, un inhibidor de la familia EGFR, y vincristina, un inhibidor de microtúbulos (Fig 2A). La vincristina es raramente utilizado en melanoma regímenes terapéuticos y miembros de la familia EGFR no se sabe que tienen un papel conductor en melanomas, excepto en la resistencia de adaptación a los inhibidores de BRAF [7]. Se confirmó fuerte sensibilización ~ 10 veces de algunas, pero no todas, las células de melanoma a la vincristina con lapatinib, con un valor de Bliss & gt; 50% y el índice de combinación (IC) de 0,37 [19] (Fig 2B y S3A y S3B Fig), y varios otros inhibidores de miembro de la familia EGFR, incluyendo erlotinib (S3C Fig). Sin embargo, no fuimos capaces de sensibilizar a las células A375 a la vincristina después de caída de una o combinatoria de los objetivos de lapatinib EGFR y HER2 (Fig S3D). Además, el análisis del ciclo celular demostró detención sinérgico en G
2 /M con la combinación de vincristina-lapatinib, como sería de esperar con el aumento de dosis de vincristina (Fig 2C). Lapatinib y otros inhibidores de la tirosina derivado de 4-anilinoquinazolina quinasa han sido descritos como inhibidores de la familia P-gp de resistencia a múltiples fármacos (MDR) los transportistas [20, 21]. Verapamilo, un inhibidor MDR1 canónica, resultó en una interacción sinérgica similar con vincristina (S3E Fig). Dada la fuerte sinergia entre vincristina y lapatinib en A375, pero no las células WM451Lu, se investigó si la expresión diferencial de la familia MDR puede ser la base de la especificidad de la línea celular interacción sinérgica. En general, se observó una tendencia general hacia una mayor sinergia entre la vincristina y lapatinib en líneas celulares con mayor expresión de MDR1 ARNm. (S3F figura). Debido contexto célula individual puede influir en la solidez de la tendencia general, se comparó específicamente un sensible a una línea de células insensibles. Observamos & gt; 8 veces la expresión de MDR1 mRNA en células A375 vs células WM451Lu (Fig 2D). Además, lapatinib aumentó la retención de un colorante sustrato MDR de manera similar a verapamil (Fig 2E). Desmontables de MDR1 por RNAi en células A375 sensibiliza las células a la inhibición del crecimiento celular vincristina (Figura 2F y S3G FIG). La sobreexpresión de MDR1 en células WM451Lu resistencia a vincristina inducidos de manera lapatinib dependiente (Figura 2G y S3H FIG). Por lo tanto, a pesar del carácter "selectivo" de algunos inhibidores de la quinasa, su actividad contra miembros de la familia MDR puede producir un efecto sinérgico no guardan relación con sus objetivos primarios. En consonancia con esto, se observó sinergia entre vincristina y lapatinib en una serie de otras células que proliferan rápidamente (S3I FIG). Hallazgos similares de interacciones sinérgicas promiscuos a través de biodisponibilidad se han encontrado en la levadura anti-hongos pantallas de combinación de drogas [22]. Un gran número de compuestos a través de una serie de clases estructurales puede mostrar la inhibición MDR, el apoyo a nuestra observación de que la vincristina se sensibilizó por un gran número de otras drogas (figura 1D).
(A) Revisión resultados que muestran los efectos a escala tanto las concentraciones de vincristina y lapatinib, de forma individual, y como una combinación, que muestra una fuerte sinergia en la mayoría de las líneas celulares de melanoma, como se indica por las puntuaciones de sinergia alta de la dicha. (B) Confirmación del efecto sinérgico de la combinación de lapatinib (5μM) en A375 (
n
= 19), pero no WM451Lu (
n = 14)
células. Las barras de error representan S. D. de la medición se replica. (C) Representante flujo citometría de datos que muestran lapatinib potencia G
desplazamiento de la población de células A375 en consonancia con el aumento de efecto vincristina 2 /M. (D) Iniciar
2 expresión relativa del transportador de la resistencia a múltiples fármacos dada en células A375 frente WM451Lu, que muestra una mayor expresión del MDR1 en células A375. Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 9). (E) calceína tinte experimentos de flujo que muestran el aumento de la intensidad de fluorescencia (indicando disminuyó MDR flujo) en presencia de lapatinib o control MDR verapamil inhibidor (tanto en 5μM); la cuantificación de los valores de gris de células muestra a la izquierda. Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n = 4
, & gt; 200 células por recipiente en paralelo). (F) MDR1 desmontables de siRNA provoca un efecto sinérgico sobre la viabilidad celular en presencia de 5 nM vincristina. Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 7). (G) La sobreexpresión de MDR1 (comparado con el control GFP) en WM451Lu disminuye la sensibilidad a la vincristina, un efecto reversible con 5μM lapatinib. Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 4)
antagonistas de VEGFR /PDGFR sinergia con inhibidores de BRAF
Para identificar las combinaciones sinérgicas más específicos, nos centramos en las combinaciones que podrían frente a la resistencia intrínseca a la vemurafenib inhibidor de BRAF. Se identificaron varios
líneas celulares V600E BRAF, incluyendo ISTMel1 y RPMI7951, que muestra resistencia a PLX4720 incluso en dosis altas (& gt; 5μM, inhibición del crecimiento & lt; 50%), en comparación con las líneas sensibles como UACC62 y SkMel28 (IC
50 & lt; 500 nM) (Fig 3A). Muchos de los otros 107 medicamentos en nuestra biblioteca mostraron interacciones sinérgicas con PLX4720 en contextos específicos de células (Fig S4A). Se utilizó el análisis estadístico de enfoque (SAM) de microarrays [23] para identificar combinaciones con PLX4720 que eran específicamente sinérgico en las líneas celulares resistentes a PLX4720 (S4B FIG). Entre éstos se incluye el vorinostat inhibidor de HDAC, encontrado recientemente para crear sinergias con los inhibidores de BRAF en algunas líneas celulares de melanoma [24]. Hemos observado sinergia significativa entre el cediranib inhibidor de RTK y PLX4720 en estas líneas celulares resistentes (Figura 3B), con un IC de 0,35 (S5A Fig), pero no en líneas sensibles, incluso a dosis bajas de PLX4720. La sinergia también se observó entre cediranib con el selumetinib inhibidor de MEK (AZD6244), y con la combinación triple de cediranib, PLX4720, y selumetinib, lo que sugiere una interacción general entre cediranib y la inhibición de la señalización de MAPK BRAF guiado (S5B y S5C Fig). ensayos de crecimiento a largo plazo confirmaron una fuerte interacción sinérgica (Figura 3C). La combinación de cediranib y PLX4720 apoptosis inducida rápidamente en las células resistentes, como se muestra por tinción con Anexina V y CPARP Western Blot (figura 3D). Mientras que un solo agente de tratamiento PLX4720 causó la detención del ciclo celular en las líneas celulares sensibles, no hubo un efecto significativo de la combinación de fármacos en el ciclo celular (Fig S5D). En contraste con los resultados con lapatinib, no encontramos la sensibilización de las líneas resistentes a PLX4720 con el verapamilo inhibidor de la MDR (S5E figura).
(A) Efecto de PLX4720 (PLX4720) a través de las células del melanoma en la pantalla principal, demostrando algunos
BRAF
melanomas mutantes muestran resistencia intrínseca a la inhibición de BRAF. Resistencia (definido como & gt; 50% de viabilidad a & gt; 5μM PLX4720) en estas líneas fue confirmada en ensayos secundarios (abajo). (B) cediranib muestra efectos sinérgicos con PLX4720 en varias líneas intrínsecamente resistentes en la pantalla principal; estos efectos se verificaron en los ensayos de crecimiento estándar en las pantallas secundarias (abajo, con 2 micras cediranib). líneas inhibidores de BRAF UACC62 sensible y SkMel28 no mostraron sinergia en cualquier dosis PLX4720, mientras que las líneas resistentes ISTMel1 y RPMI7051 mostraron una fuerte sinergia con cediranib (dicha de & gt; 30%). Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 3-4). (C) los ensayos de crecimiento a largo plazo de cristal violeta-manchado de colonias confirmadas sinergia sostenida entre PLX4720 (PLX) y cediranib (CED) en las líneas resistentes ISTMel1 y RPMI7951 pero las líneas no PLX4720 sensibles UACC62 y SkMel28. (D) los ensayos de anexina V mostraron que la apoptosis inducida por cediranib cuando se combina con PLX4720 en células ISTMel1 resistentes, en comparación con UACC62 sensible, y tal como se confirma mediante transferencia Western de PARP escindida (abajo). Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 3). (E) de Western blot confirmó la expresión de objetivos cediranib PDGFRß, y de forma variable, KDR y PDGFR en células ISTMel1 y RPMI7951 PLX4720 insensible, con la expresión más débil o ausente en UACC62 sensibles PLX4720 y células SkMel28. tratamiento de veinticuatro horas con PLX4720 suprimida moderadamente KDR y la expresión inducida PDGFRß, un patrón también se observa
in vivo gratis (S9A la figura). (F) de Western blot confirmó la supresión en la diana de la fosforilación PDGFR y PDGFR (este último después de la inmunoprecipitación y transferencia de fosfo-tirosina dados de baja abundancia). KDR fosforilación era demasiado débil para ser observado por Western rutinariamente en la cultura, pero se vio
in vivo gratis (ver Fig S9A). RNAi mediada desmontables (G) de KDR (izquierda) con piscinas o siRNAs individuales mostró sinergia para ~ 30%; sinergia fue proporcional a la caída de KDR (ver Fig S7A). Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 6). A la derecha, los valores promedio de la dicha a través de múltiples repeticiones mostraron aumento de la sinergia con la caída simultánea de múltiples objetivos cediranib KDR y PDGFR, y, más débilmente, PDGFRa. Las barras de error representan S. D. de repeticiones de medida (
n
= 5-8).
cediranib es un inhibidor potente y selectivo de la PDGFR y VEGFR familia de receptores de tirosina quinasas en ensayos clínicos, utilizados principalmente como un agente anti-angiogénesis [25]. Mientras que el PDGFRa y la sobreexpresión β ha sido previamente vinculado a la resistencia adquirida vemurafenib [6, 7, 26], esta familia no ha sido implicado en la resistencia vemurafenib primaria de células autónomas. Para comprender mejor el mecanismo de la combinación de fármacos, hemos probado una lista ampliada de los inhibidores de RTK actualmente en uso clínico o desarrollo. Algunos, pero no todos, los inhibidores similares mostraron sinergias con PLX4720, y en algunos, pero no todos las líneas resistentes (S6A figura). Curiosamente, sólo cediranib y tivozanib, no el inhibidores axitinib más específico (VEGFR) o crenolanib (PDGFR), mostraron una actividad sinérgica consistente y potente con PLX4720 través de una amplia gama de dosis, lo que sugiere una actividad inhibidora específica de estos compuestos en un subconjunto de los objetivos . bases de datos de expresión de líneas celulares mostraron una expresión de objetivos cediranib en líneas celulares resistentes (Fig S6B), lo que nos confirma mediante Western Blot (Figura 3E). En general, también se encontró que líneas celulares de melanoma expresan niveles más altos de KDR que cualquier otro linaje en una gran colección de líneas celulares de cáncer (S6C FIG), lo que sugiere un papel autónomo de la célula específico para KDR en el desarrollo del melanoma. Detectamos supresión en-blanco por cediranib de la fosforilación de ambos PDGFRa y PDGFRß (Fig 3F). A continuación, se intentó recapitular sinergia entre PLX4720 y cediranib por desmontables de sus objetivos principales. siRNA desmontables de KDR mostró una disminución del número de células sinérgico cuando se combina con el tratamiento PLX4720 proporcional a la eficiencia desmontables; Por otra parte, la precipitación simultánea de múltiples objetivos cediranib incluyendo PDGFRa y PDGFRß aumentó la sinergia con la inhibición de BRAF (figura 3G y S7A y S7B figura). Aunque no podemos excluir la posibilidad de que parte de la actividad sinérgica es debido a la inhibición de otras dianas RTK no incluidos en nuestro análisis, estos resultados sugieren que el particularmente fuerte actividad sinérgica de cediranib en combinación con PLX4720 es debido a la inhibición de KDR y RTK relacionados incluyendo PDGFRa y PDGFRß.
activación o reactivación de las principales vías de aguas abajo de las RTK como mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) y fosfatidilinositol-3-OH quinasa (PI (3) K) vías -AKT anteriormente ha sido implicado en la resistencia a las terapias dirigidas incluyendo vemurafenib tanto en
in vitro
y los estudios clínicos [8, 27-32]. A diferencia de la mayoría de los estudios de líneas celulares resistentes, PLX4720 suprimió por completo la activación de ERK en las líneas intrínsecamente resistentes; Por otra parte, la inhibición dual de la vía MAPK con PLX4720 y selumetinib no mostró interacción sinérgica (S8A y S8B la figura), y cediranib siguió mostrando la sinergia en la combinación triple con dos PLX4720 y selumetinib (S5C figura). Estos resultados sugieren vías adicionales más allá de MAPK están relacionados con la actividad de cediranib. Cediranib suprimió la fosforilación S6K, tanto en las líneas resistentes (ISTMel1) sensible (UACC62) y, y la activación suprimido combinación de líneas resistentes de la mayoría de los componentes de la vía Akt por las matrices de fosfo-anticuerpos (vía S8C FIG). Para determinar si esto era simplemente un marcador de inhibición y /o sinergia RTK, o el mecanismo de la sinergia observada, hemos probado si los inhibidores de la vía PI3K /Akt podrían sinergizar con PLX4720. Curiosamente, la inhibición de Akt mostró sólo sinergia variable y moderado con PLX4720 pesar de la fuerte supresión de la vía (S8D y S8E figura). Estos resultados sugieren que la supresión de MAPK o PI3K de señalización corriente abajo de KDR /PDGFR RTK contribuye sólo parcialmente a la sinergia entre cediranib y PLX4720 y mecanismos de resistencia intrínsecas terapéuticamente tratables extenderse más allá de estas dos vías. Entre potencial vía aguas abajo afectado por la PI3K Akt supresión /vía observado por la combinación de fármacos, β-catenina es un sustrato conocido de GSK3, cuya activación puede seguir la disminución de la fosforilación Ser9 observada con la combinación. Aunque varios moduladores de la vía β-catenina no mostraron antagonismo o sinergia con PLX4720 en nuestra pantalla principal (S9A la figura), y GSK3 tiene una serie de sustratos conocidos [33], esta vía puede ser uno de los efectores potenciales de la combinación de fármacos.
a continuación, probamos si la inhibición sinérgica del crecimiento de células de melanoma por cediranib y PLX4720 podría ser recapitulado
in vivo
. En dos modelos de xenoinjerto con las líneas resistentes ISTMel1 y RPMI7951, se observó una fuerte interacción entre los inhibidores de la progresión del tumor (Fig 4A y S9A-S9C FIG). ISTMel1 mostró sensibilidad inicial moderada a PLX4720, pero cediranib suprimida más adelante crecimiento de los tumores mientras que el PLX4720; Por el contrario, en RPMI7951, la combinación de cediranib y vemurafenib disminución del crecimiento inicial del tumor más allá del efecto de cada fármaco por separado.
(A) xenoinjertos ISTMel1 se generaron en ratones inmunodeficientes (
n = 8
por grupo), que fueron tratados con PLX4720 o Chow control y dado cediranib o agua por sonda oral. xenoinjertos ISTMel1 mostraron una respuesta inicial al tratamiento PLX4720 solo después de aproximadamente dos semanas, con alguna respuesta adicional, pero no significativa al tratamiento cediranib. Los valores se muestran como media +/- S.E.M. gamas, con diferencias significativas en el tamaño medio del tumor tanto en los ratones tratados con cediranib en comparación con el tratamiento control por ANOVA PLX4720 y PLX4720 y. Sin embargo, la combinación retrasa significativamente la progresión (definido como & gt; 500 mm
3 tamaño) más allá de esta respuesta inicial (derecha,
p Hotel & lt; 0,002 entre PLX4720 y los brazos PLX4720 + cediranib mediante la prueba de log-rank) . (B) En contraste con xenoinjertos ISTMel1, xenoinjertos RPMI7951 mostró una diferencia significativa mediante la prueba de ANOVA en respuesta inicial al PLX4720 frente PLX4720 y tratamiento cediranib después de tres semanas, y, a la derecha, mostró un retraso prolongado de progresión (definido como tumores & gt; 250 mm
3) de los tumores completamente resistente PLX4720 (
p Hotel & lt; 0,0001 entre PLX4720 y PLX4720 y los brazos cediranib mediante la prueba de log-rank).