Extracto
Recientemente, se demostró que el virus vaccinia oncolítico GLV-1h68 tiene un potencial terapéutico significativo en el tratamiento de metástasis en los ganglios linfáticos de carcinoma de próstata PC-3 humana en xenoinjertos tumorales. En este estudio, se analizaron los mecanismos subyacentes de la reducción de las metástasis mediada por virus. La inmunohistoquímica demostró que el virus de tratamiento dio como resultado una disminución drástica de los vasos sanguíneos y linfáticos, lo que representa rutas esenciales para la migración de células PC-3, en ambos tumores y metástasis. Por lo tanto, GLV-1h68 reduce drásticamente rutas esenciales para la propagación metastásica de las células PC-3. Además, el análisis de la distribución viral en GLV-1h68 a inyectar ratones portadores de tumores por ensayos de placa, reveló significativamente más altos títulos de virus en las metástasis en comparación con los tumores sólidos. Para dilucidar las condiciones potencialmente median la colonización vírica preferencial y la erradicación de las metástasis, los componentes del microentorno de los tumores y metástasis no infectadas se compararon mediante estudios microscópicos. Estos análisis revelaron que las metástasis de ganglios PC-3 ganglios mostraron un aumento de la permeabilidad vascular, más alto estado de proliferación de células tumorales como se determina por BrdU y Ki-67 ensayos y menor necrosis de las células PC-3 que los tumores sólidos. Se observó Por otra parte, un mayor número de células inmunes (MHCII
+ /CD68
+ macrófagos, MHCII
+ /CD19
+ linfocitos B), combinada con una expresión en marcha regulada de citoquinas pro-inflamatorias en metástasis en comparación con PC-3 tumores primarios. Proponemos que estos componentes microambientales mediados del tropismo metastásico de GLV-1h68. Por lo tanto, virotherapy oncolítico basado en virus vaccinia podría ofrecer un nuevo tratamiento de los carcinomas de próstata metastásico en los seres humanos
Visto:. Donat U, S Weibel, Hess M, Stritzker J, Härtl B, Sturm JB, et al. (2012) Preferencial La colonización de las metástasis por oncolítico virus vaccinia Strain GLV-1h68 en un modelo humano PC-3 del cáncer de próstata en ratones desnudos. PLoS ONE 7 (9): e45942. doi: 10.1371 /journal.pone.0045942
Editor: Maciej S. Lesniak, La Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: 23 Agosto 2012; De publicación: septiembre 25 de, 2012
Copyright: © Donat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Dres. Jochen Stritzker, Nanhai G. Chen, Ivaylo Gentschev y Aladar A. Szalay son empleados de la Corporación Genelux y tienen intereses financieros en Genelux Corporation. Dr. Barbara Härtl es un empleado de Genelux GmbH. Genelux Corporación también proporcionó una subvención al Servicio de la Universidad de Würzburg. El Dr. Ulrike Donat y el Dr. Stephanie Weibel son beneficiarios de una beca postdoctoral. El Dr. Julia Sturm y el Sr. Michael Hess son beneficiarios de una beca de postgrado de la Universidad de Würzburg. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No hay patentes o productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Según los estudios actuales, más de 90 % de pacientes con cáncer mueren debido a los efectos directos o indirectos de las metástasis. por lo tanto, el pronóstico del paciente está conectado inmediatamente a la etapa metastásica del carcinoma [1]. las células tumorales metastásicas se infiltran en los tejidos sanos y las barreras de acceso a los vasos transversales linfática o la circulación sanguínea. La tendencia de una célula tumoral para entrar en vasos linfáticos o sanguíneos depende de la capacidad de adherirse a las estructuras específicas, tales como fibras reticulares en el seno subcapsular de un ganglio linfático de drenaje o de las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos [2].
El cáncer de próstata se conoce a la metástasis a los huesos, los pulmones y ganglios linfáticos [3], [4]. Representa la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres. Dado que el cáncer de próstata procede de forma asintomática, el diagnóstico se hace a menudo cuando las metástasis ya se han formado. las estrategias de tratamiento actuales para las metástasis son similares a los utilizados para los tumores primarios [1]. El tratamiento del carcinoma de próstata avanzado se realiza a través de la quimioterapia convencional y radioterapia. Desafortunadamente, estos tratamientos a menudo resultan en el desarrollo de tumores resistentes y metástasis [5], [6]. Además, se ha demostrado que el mantenimiento del crecimiento del tumor sólido a raya puede promover en lugar de suprimir la formación de metástasis [7]. La lucha contra tanto la formación y el crecimiento de las metástasis, por tanto, es la clave del éxito en el tratamiento del cáncer
De acuerdo con ello, virotherapy oncolítico es una de las nuevas estrategias más prometedoras en la lucha contra ambos:. Tumores sólidos y metástasis. Virus oncolíticos son capaces de replicarse selectivamente en las células cancerosas, lo que resulta en la destrucción del tejido tumoral, pero dejando los tejidos sanos ileso [8]. En 2007, Zhang
et
col. Describió por primera vez el virus vaccinia recombinante atenuado GLV-1h68 [9], [10]. El efecto oncolítico de este virus ha sido mostrado en la mama, páncreas y próstata xenoinjertos tumorales [10] - [12]. Por otra parte, Gentschev
et al.
Demostrado, en principio, el gran potencial terapéutico de GLV-1h68 en el tratamiento de metástasis en los ganglios linfáticos procedentes de la línea celular de carcinoma de próstata PC-3 [11].
en este estudio, se caracterizaron los mecanismos subyacentes de la reducción mediada por virus de metástasis. Para un análisis detallado, que primero visualizamos la diseminación metastásica de células PC-3 en el sistema linfático de ratones desnudos mediante la inserción de la
mRFP1
-Gene que codifica la proteína fluorescente de color rojo bajo el control del promotor de CMV en el genoma de células tumorales . Tras la inyección viral en ratones portadores de tumores PC-3-RFP, hemos demostrado que el tratamiento virus disminuyó drásticamente la cantidad de vasos sanguíneos y linfáticos, que son rutas esenciales para la diseminación metastásica de las células tumorales, en los tumores, así como en las metástasis [13] , [14]. Además, se detectó significativamente más altos títulos de virus en las metástasis PC-3 de ganglios linfáticos que en tumores sólidos y se demostró que las metástasis de ganglios linfáticos renal fueron colonizados en un grado aún más alto que los lumbares. Para nuestro conocimiento, este tropismo viral a metástasis, hasta el momento, no se ha descrito en la literatura. Por lo tanto, nos propusimos analizar mecanismos que conducen a la colonización vírica preferencial. En este contexto, se analizaron varios aspectos microambientales, tales como la vasculatura del tumor y las metástasis y la perfusión, el estado de proliferación y el grado de necrosis-3 PC de células, la carga de las células inmunes, así como la expresión de citoquinas en los tumores primarios y metástasis en los ganglios linfáticos.
Materiales y Métodos
Líneas celulares
La línea celular de carcinoma de próstata humano PC-3 (DSMZ ACC465) se cultivó en medio RPMI 1640 (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania). las células PC-3-RFP se cultivaron en las mismas condiciones excepto por la adición de 10 mg /ml de blasticidina. La línea de riñón de mono verde africano celular de fibroblastos CV-1, obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC CCL-70), se cultivó en DMEM de alta glucosa (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) suplementado con 10% de FCS y 1% penicilina solución de estreptomicina. células de riñón epiteliales humanas (293FT) fueron amablemente proporcionados por P. Hill (Universidad de Nottingham, obtenida originalmente de Invitrogen) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 2 mM L-glutamina (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania).
de las células PC-3-RFP
la secuencia de ADNc de la proteína fluorescente roja (
mRFP1
) fue insertado en el genoma de la célula PC-3 usando Vira Power ™ Lentiviral Expresión Kit (Invitrogen GmbH, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema. El
mRFP1
-encoding plásmido pCR-TK-SEL-mRFP fue proporcionada por Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) y se utiliza para generar el
mRFP1-
que contiene los vectores lentivirales tal como se describe anteriormente [15]. Incompetente para la replicación
mRFP1
-encoding lentivirus fueron producidos en células 293FT por un co-transfección de los plásmidos pLP1, PLP2, el PLP /VSVG que suministran proteínas estructurales y de replicación de lentivirus y la expresión pLenti6 /V5-DEST-mRFP plásmido utilizando Lipofectamine
TM2000. Después de la transducción de las células PC-3 con lentivirus mRFP-codificación y blasticidina (10 mg /ml) de selección, se seleccionó una estable RFP que expresan PC-3 clon y RFP-expresión en & gt; 98% de todas las células fue confirmado por citometría de flujo .
cepa del virus
La cepa atenuada del virus vaccinia GLV-1h68 se construyó como se describe anteriormente por Zhang
et al.
[10]. Tres cajas de expresión que codifican para
Renilla
proteína de fusión luciferasa-GFP, β-galactosidasa, o β-glucuronidasa se recombinan en el
F14.5L
,
J2R
y
A56R
loci, respectivamente, del genoma del virus parental LIVP. GLV-1h68 se propagó en células CV-1 y se purificó a través de gradientes de sacarosa.
implantación del tumor y el virus de Administración
Los tumores se generaron mediante la implantación de 2 × 10
6 PC-3 o PC células -3-RFP en 100 l de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho del abdomen de 6-8 semanas de edad desnudos atímicos
Foxn1
nu
ratones (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Alemania). Una sola dosis de 1 × 10
7 unidades formadoras de placa (pfu) GLV-1h68 en 100 l de PBS se inyectó por vía intravenosa (i.v.). Para el estudio de la colonización vírica de las metástasis PC-3-RFP, GLV-1h68 se administró después de metástasis en los ganglios linfáticos abdominales eran palpables; generalmente 45-60 días después de la implantación de células PC-3-RFP, para imitar la etapa avanzada de cáncer de próstata. Desde la etapa avanzada de la enfermedad está asociada con la pérdida de peso independiente de la infección viral, el peso se midió dos veces por semana y los ratones se sacrificaron antes de que se superaron las tasas estándar. Los períodos de tratamiento analizados no superaban los 14 días. Después de la inyección del virus del estado de salud de los ratones no cambió.
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el gobierno de Baja Franconia, Alemania (número de protocolo AZ 55.2-2531.01-17 /08) y /o el Cuidado de Animales Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de Explora Biolabs, ubicadas en San Diego Science Center (San Diego, EE.UU.) (números de protocolo: EB08-003; EB11-25).
Detección de PC-3 células humanas en los ganglios Los nodos a través de RT-PCR
La presencia de PC-3 células humanas en lumbar ampliada y los ganglios linfáticos renales se analizó por RT-PCR usando cebadores para la β-actina humana como se describe anteriormente [11]. Un ganglio linfático se definió que ser ampliada cuando el diámetro máximo superior al 2 mm.
Fluorescencia de Imagen de tumores y metástasis de ganglios linfáticos
Imágenes de GLV-1h68 o PBS tratada del tumor PC-3-RFP llevando los ratones fueron tomadas ya sea con el Sistema Maestro EX Imaging (Calibre, Hopkinton, MA, EE.UU.) o con un MZ16 FA estéreo-microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania). Para obtención de imágenes de los ratones con el sistema de imágenes de Maestro EX, los animales fueron anestesiados usando 2-3% de isoflurano. Las imágenes digitales fueron procesadas con Photoshop 7.0 (Adobe Systems, de San Francisco, EE.UU.).
Análisis de Viral Los títulos de tumores y metástasis
La cantidad de partículas de virus en lisados tumorales y la metástasis se determinó por ensayos de placa estándar. Por lo tanto, PC-3 tumores y metástasis fueron extirpados 3, 7 y 14 días después de la inyección-1h68 GLV, picada y 2 volúmenes de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl con EDTA 2 mM, pH 7,4) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM y se añadieron cóctel inhibidor de proteinasa (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania). Las muestras se homogeneizaron utilizando un Fastprep Shredder (Thermo Scientific, Karslruhe). Después de 3 ciclos de congelación y descongelación, seguido de diluciones en serie de sonicación se titularon en células confluentes CV-1 en placas de 24 pocillos. Todas las muestras se midieron por duplicado.
Inmunohistoquímica
Para la histología, los tumores y las metástasis se extirparon y se fijaron durante 16 h en paraformaldehído al 4% /PBS, pH 7,4. Preparación de 100 micras secciones y procedimientos de etiquetado se realizaron como se describe anteriormente [16] utilizando el Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Suiza). Después del marcaje, las secciones de tejido se montaron en Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Las muestras de tejido se seccionaron (espesor de 10 micras) con el criostato 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Alemania). Después de la deshidratación en 10% y 30% de sacarosa (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) especímenes fueron embebidos en Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek Europa BV, Alphen aan den Rijn, Países Bajos). Criosecciones se almacenaron a -80 ° C y se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h. Después de lavar con PBS, las secciones se tiñeron durante 1 h con anticuerpos secundarios y, finalmente, montados en Mowiol 4-88.
Anticuerpos y Reactivos
vasos sanguíneos endoteliales se tiñeron con un hámster monoclonal anti-CD31 anticuerpos (Chemicon International, Temecula, EE.UU.; MAB1398Z) y los vasos linfáticos endoteliales con un anticuerpo policlonal de conejo anti-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab14917). No específica rata-IgG (Jackson Immunoresearch, Pennsylvania, EE.UU., 01200003) se utilizó para analizar la permeabilidad de los vasos sanguíneos en los tumores PC-3-RFP y metástasis. Por lo tanto, se inyectaron 10 mg /kg rata-IgG por vía intravenosa (i.v.) a ratones portadores de tumor PC-3-RFP. Seis horas después de la inyección de los ratones se sacrificaron y se prepararon 100 micras secciones de tumores y metástasis. Etiquetado de las células presentadoras de antígenos se realizó con una rata monoclonal anti-MHC de clase II de anticuerpos (I-A /I-E) (eBioscience, San Diego, EE.UU.; 14-5321). Las células B se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de rata anti-CD19 (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab25232), macrófagos con un anticuerpo anti-CD68 monoclonal de rata (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab53444). El marcador de proliferación Ki-67 se marcó con un anticuerpo anti-Ki-67 policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab15580). Para el análisis de la incorporación de BrdU en el ADN de las células PC-3-RFP en tumores y metástasis, 120 mg /kg de BrdU se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.). Tres horas más tarde, los tumores y las metástasis se escindieron y se prepararon 10 micras secciones. Etiquetado se realizó con anticuerpo monoclonal de rata anti-BrdU (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab6326) después de 30 min de incubación con HCl 2 M y lavado en PBS. Los núcleos se Hoechst 33342 marcado con (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania). DyLight488-, DyLight549- y DyLight anticuerpos secundarios conjugados 649 (burro) se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch (Pensilvania, EE.UU.). Todos los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en PBS 1:100 en el caso de 10 micras secciones o en PBS /0,3% Triton-X-100 en el caso de 100 micras secciones.
microscopía de fluorescencia
se utilizaron estudios microscópicos de comparar la vasculatura del tumor, el estado de proliferación de las células y las poblaciones de células inmunes específicas de tumores, así como de las metástasis. Para examinar las secciones de tumor y metástasis marcados con fluorescencia, se utilizaron los siguientes microscopios: Un microscopio de fluorescencia estéreo MZ16 FA (Leica) equipado con una cámara CCD digital y el software Leica IM1000 4.0 (1300 × 1030 imágenes de píxeles RGB-color), un microscopio TCS SP2 AOBS láser confocal (Leica) equipado con el software LCS 2.16 (1024 × 1024 imágenes de píxeles RGB-color) y un microscopio Axiovert 200 M (Zeiss) con software Axiovision 4.5 (1388 × 1040 imágenes de píxeles en escala de grises). Las imágenes digitales fueron procesadas con Photoshop 7.0 (Adobe Systems, EE.UU.) y se combinan para producir imágenes de color seudo.
Los análisis de fluorescencia de imágenes digitales
Para los análisis de imágenes digitales de tumor, LN y RN secciones, es importante tener en cuenta que había un tumor por ratón, pero el número de lumbar y metástasis en los ganglios linfáticos renales diferían de ratón a ratón. En la mayoría de los casos los LN 2 y 2 enfermeras estaban presentes por ratón. Per Se analizaron las imágenes de tumores o metástasis de las secciones 2, en el que los datos obtenidos de todas las metástasis en los ganglios linfáticos lumbares se fusionaron para LN y los datos obtenidos de todos los ganglios linfáticos renales se fusionaron para RN.
Medición de la linfa y los vasos sanguíneos de densidad .
Nódulos linfáticos y vasos sanguíneos de densidad se midió en imágenes digitales (× 80 y 100 × magnificación) de anti-LYVE-1 y anti-CD31 manchada 100 micras secciones. Ocho imágenes por tumor, LN y RN se analizaron por tinción. Tiempo de exposición para las imágenes individuales se ajustó para garantizar una visibilidad clara de todos los vasos sanguíneos y linfáticos detectables y decorado con 8 líneas horizontales equidistantes con Photoshop 7.0. Todos los vasos linfáticos o sanguíneos cruzan estas líneas se contaron para obtener la densidad de los vasos por sección.
Medición de diámetros de los vasos sanguíneos.
medición de los vasos sanguíneos de diámetro se realizó utilizando imágenes digitales (× 100 aumentos) de 100 micras secciones teñidas con anti-CD31 utilizando el software Leica IM1000 4.0. Las imágenes de tumores y metástasis en los ganglios linfáticos se obtuvieron con tiempos de exposición individuales para obtener las señales CD31 óptimas y excluir variabilidad de la señal dependiente del diámetro del vaso. Las imágenes individuales se cubrieron con tres líneas horizontales equidistantes y se midieron los diámetros de todos los vasos sanguíneos que cruzan estas líneas. diámetros de los vasos sanguíneos se determinaron de 4 imágenes por tumor, LN y RN.
Cuantificación de etiquetado sección.
Para cuantificar la permeabilidad de los vasos sanguíneos, imágenes digitales (× 160 aumentos) de 100 micras se analizaron secciones histológicas de tumores y metástasis. Se determinó el área total positivo para IgG (marcado con anti-rata-DyLight488) en 16 regiones diferentes por muestra. Se determinó la cantidad de tejido necrótico en PC-3 tumores o metástasis en imágenes digitales de 100 micras secciones. Los núcleos se etiqueta con Hoechst 33342. La fracción de una sección de no manchado por Hoechst debido a la degradación núcleos se definió como área necrótica. En este caso, se analizaron las imágenes de 2 secciones enteras por muestra. La cantidad de MHC-II, CD19 y células CD68 positivas en PC 3-tumores y metástasis se midió en imágenes digitales de 10 micras secciones. Se analizaron dos imágenes de sección enteros por muestra. Los análisis de la cantidad de IgG, el tejido necrótico y MHC-II-, CD19- y células CD68-positivas en imágenes digitales se realizaron utilizando el software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij) después de la conversión de RGB-imágenes en 8 -bit imágenes en escala de grises usando Photoshop 7.0.
Medición de la intensidad de la fluorescencia.
la medición de la intensidad CD31 y Ki-67 se llevó a cabo en las imágenes digitales de 100 micras y 10 micras secciones de PC- 3 tumores y metástasis. Para cada tinción, 8 imágenes diferentes por muestra fueron adquiridas con una configuración idéntica. RGB-imágenes se convirtieron en escala de grises de 8 bits con un rango de intensidad 0-255. La intensidad de fluorescencia de CD31 y Ki-67 tinciones representa el brillo promedio de todos los píxeles relacionados de tinción y se midió usando ImageJ. Imágenes de tinción CD31 fueron tomadas a 100x, las imágenes de Ki-67 un aumento de 400x.
Aislamiento y caracterización de proteínas
Proteína lisados de tumores PC-3-RFP, lumbar y metástasis en los ganglios linfáticos renales de 3 ratones 49 días después de la implantación de células tumorales se analizaron con un antígeno de perfiles relacionados con la proteína inmune (RodentMAP® v2.0, reglas basadas en Medicina, Austin, EE.UU.) usando perlas de anticuerpo ligado. Los lisados se realizaron como se describe anteriormente [11]. Los resultados se normalizaron basado en la concentración de proteína total.
Análisis estadístico
se utiliza
t
prueba de Student de dos colas para el análisis estadístico.
Los valores de P
≤0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre los grupos experimentales. (* Indica p = 0.05; ** indica p≤0.01; *** indica p≤0.001)
Resultados
Visualización de la diseminación metastásica de las células tumorales PC-3-RFP través del sistema linfático en ratones desnudos
para analizar la propagación metastásica de las células PC-3 en ratones desnudos, era necesario establecer tumores primarios mediante la implantación de 2 × 10
6 RFP-expresión de las células PC-3 por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Acerca de 70 días después de la implantación visualizamos células tumorales metástasis en lumbar (LN) y renales (RN) ganglios linfáticos en ratones portadores de tumor PC-3-RFP vida (Figura 1a). Además de la detección en lumbares y los ganglios linfáticos renal, las células PC-3-RFP también se visualizaron en los vasos que conectan los pares de nodos linfáticos (Figura 1B). Para averiguar si estos vasos son vasos linfáticos o sanguíneos se realizaron inmunohistoquímico coloraciones. Etiquetado de LYVE-1 (marcador linfático) y CD31 (marcador de vasos sanguíneos) en secciones de tejido reveló claramente un origen linfático de estas estructuras de los vasos similares que contienen células tumorales (Figura 1c).
2 × 10
6 PC-3 o PC-3-RFP células se implantaron en el flanco derecho de ratones desnudos. (A) de formación de imágenes en tiempo real de un ratón nude vivir que lleva un tumor PC-3-RFP 70 días después de la implantación, vista dorsal y ventral. T, tumor; LN, lumbares metástasis de ganglios linfáticos; RN, renales metástasis de ganglios linfáticos. (B) lumbar (LN1, LN2) y renales (RN1, RN2) metástasis en los ganglios linfáticos en el abdomen de un ratón portador de un tumor sólido PC-3-RFP 65 días después de la implantación. Foto de la derecha: la migración de las células PC-3-RFP entre LN y RN. (C) 100 m secciones transversales de la parte entre los LN y enfermeras teñidas con anti-CD31 y LYVE-1 anticuerpo anti, respectivamente. (D) Para linfáticos positivos β-actina humana nodos 21, 28, 35 y 42 días después de la implantación de las células PC-3 y la densidad (e) de los vasos linfáticos en el correspondiente PC-3 tumores primarios. Tumores, lumbares y los ganglios linfáticos renales de 4 ratones fueron analizados por punto de tiempo. Para determinar la densidad de los vasos linfáticos, 100 micras secciones de PC-3 tumores se prepararon y 2 secciones se tiñeron con-LYVE-1 anticuerpo anti. Se analizaron cuatro imágenes (x 80 aumentos) por sección como se describe en materiales y métodos. Las barras de escala representan 2 mm (B y foto de la izquierda c) y 200 micras (derecha) fotos C. Todas las imágenes son ejemplos representativos.
En su conjunto, visualizamos la diseminación metastásica de las células tumorales PC-3-RFP de la localización del tumor primario definido en el flanco derecho de lumbares regional y ganglios linfáticos renales distantes ratones desnudos.
Además, se demostró una correlación basada en el tiempo entre la formación de metástasis en los ganglios linfáticos y la densidad de vasos linfáticos en los correspondientes PC-3 tumores. Con el tiempo, un incremento continuo de los ganglios linfáticos positivos para células PC-3 se observó metástasis (Figura 1d). Al mismo tiempo, la densidad de vasos linfáticos en PC-3 tumores aumentó (Figura 1e) que indica la coherencia entre la cantidad de vasos linfáticos en los tumores sólidos y de los ganglios linfáticos formación de metástasis.
GLV-1h68 El tratamiento disminuye drásticamente la densidad de la sangre y los vasos linfáticos en el PC-3-RFP tumores y metástasis
Recientemente, se ha demostrado que el tratamiento GLV-1h68 de 3 PC-resultados ratones portadores de tumores en una reducción significativa de las metástasis de ganglios linfáticos [11]. Además, demostramos que GLV-1h68 también es un agente eficaz en el tratamiento PC-3 metástasis pulmonares, que surgió principalmente por la diseminación metastásica de las células PC-3 a través de la vía hematógena (Figura S1). Para entender el potencial terapéutico de GLV-1h68, se analizó el efecto del tratamiento viral en sangre y vasos linfáticos asociados al tumor ya los que juegan un papel esencial como rutas para la diseminación metastásica a órganos distantes y los ganglios linfáticos [13], [14].
para la sangre CD31-positivo, así como para los vasos linfáticos LYVE-1-positivas una reducción significativa de la densidad de los vasos en PC-3 tumores, los LN, y RN se observó debido a (iv) la inyección intravenosa de GLV -1h68 (Figura 2). mediciones de la densidad de los vasos sanguíneos revelaron una reducción de la densidad de 46% en los tumores y los LN y en un 60% en RN en los ratones inyectados con virus vaccinia, respectivamente (Figura 2a y b). Se obtuvieron resultados similares para la densidad de los vasos linfáticos (figura 2c y d) que indica que el efecto de GLV-1h68 fue más fuerte en las metástasis de ganglios linfáticos renales.
El análisis se realizó 57 días después de la implantación de 2 × 10
6 PC-3 células y 7 días después de la inyección de 1 x 10
7 pfu GLV-1h68. Para determinar la sangre y la densidad de los vasos linfáticos, 100 micras secciones de tumores, los LN y enfermeras de 5 PBS y 5 ratones tratados con GLV-1h68 se tiñeron con anti-CD31 o-LYVE-1 anticuerpo anti. Los vasos sanguíneos y linfáticos se contaron en 4 imágenes (× 100 aumentos) de cada uno de 2 secciones por muestra. (A) la densidad de vasos sanguíneos en PC-3 tumores /metástasis y (b) imágenes representativas de secciones contra-CD31 manchados. Los vasos sanguíneos se muestran en escala de grises, por GLV-1h68 expresa GFP en verde. (C) la densidad de vasos linfáticos en los tumores PC-3 /metástasis y (d) las imágenes representativas de anti-LYVE-1 secciones teñidas. Los vasos linfáticos se muestran en escala de grises, por GLV-1h68 expresaron GFP en verde. Las barras de escala representan 500 micras.
En resumen, los resultados indican claramente que la destrucción del tejido tumoral oncolítico en PC-3 tumores y metástasis se ha mejorado significativamente por la erradicación de la vasculatura del tumor, así como los vasos linfáticos.
la colonización preferencial de metástasis de ganglios linfáticos en comparación con los tumores primarios de PC-3 por GLV-1h68
Ya que hemos observado una reducción más fuerte de las densidades de la sangre y de los vasos linfáticos en metástasis de ganglios linfáticos renales en comparación con los tumores primarios , nos propusimos investigar los patrones de colonización virales de los tumores primarios, los LN y enfermeras. Para lograr este objetivo i.v., se inyectó a los ratones portadores de tumor PC-3-RFP con 1 × 10
7 unidades formadoras de placas (UFP) GLV-1h68. Para imitar la situación de los pacientes con cáncer en estadio avanzado y para asegurar la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos inyectamos virus vaccinia en la etapa final de la enfermedad 55 días después de la implantación de células tumorales. Las imágenes multiespectrales de tumores y metástasis reveló GFP señales claras en los tumores, los LN y enfermeras ya 3 días después de la inyección de virus (ppp). Sorprendentemente, la intensidad de GFP fue la más alta de enfermeras, seguido de los LN y luego tumores sólidos (Figura 3a). Sobre la base de estos hallazgos se supone una colonización más eficiente de metástasis de ganglios linfáticos por GLV-1h68 comparación con los tumores primarios de PC-3.
1 × 10
7 pfu GLV-1h68 eran i.v. se inyecta en ratones portadores de tumores PC-3-RFP. (A) del ratón portador de un tumor PC-3-RFP 3 días después de la inyección de GLV-1h68. (B) Los títulos de virus en los tumores PC-3-RFP, los LN y RN 3, 7 y 14 días después de la inyección de GLV-1h68. inyección de virus se realizó 55 días después de la implantación de células tumorales. Los tumores y metástasis en los ganglios linfáticos de 6 ratones se analizaron por grupo (n = 6). (C) 100 micras secciones de un tumor PC-3-RFP y un nodo linfático renal metástasis de 77 días después de la implantación y 7 días después de la inyección de virus. las células PC-3-RFP se muestran en rojo, por GLV-1h68 expresa GFP en verde. Todas las imágenes son ejemplos representativos. Las barras de escala representan 1 mm (b) y MM (c) 2.
Para un análisis más detallado, los patrones de colonización virales para tumores, los LN y enfermeras fueron estudiados en un curso de tiempo en el día 3, 7 y 14 después de la inyección de virus por ensayos de placa. De hecho, se demostró que había significativamente más altos títulos virales en las metástasis de ganglios linfáticos en comparación con los tumores PC-3-RFP primaria en los tres puntos de tiempo (Figura 3b). Curiosamente, a los 3 y 7 enfermeras dpi fueron colonizados en un grado mayor que los LN. En el día de la inyección del virus 7 después de 1,4 × 10
9 pfu de GLV-1h68 por gramo de tejido se determinaron en RN. En contraste, se detectó sólo el 28% de la concentración de virus de RN en los LN y tan poco como 2% en los tumores primarios. Después de dos semanas, las diferencias iniciales en los títulos virales entre los LN y enfermeras ya no eran detectables.
Además, el análisis microscópico de secciones de tumor PC-3-RFP y metástasis reveló, como era de esperar a partir de los títulos virales más altas, también mayor GFP señales de metástasis en contraste con los tumores sólidos de 7 días después de la inyección GLV-1h68 (Figura 3c). Además, hemos demostrado que la colonización preferencial de metástasis en comparación con los tumores sólidos por GLV-1h68 no se limita a lumbar y metástasis en los ganglios linfáticos renales. GFP señales más altas y los títulos virales se observaron también en metástasis de los ganglios (IN) y ciático (SN) de los ganglios inguinales (Figura S2). Además, la investigación de una ruta diferente de la inyección de virus reveló inyección similar GLV-1h68 patrones de colonización 7 días después tumoral intra (it) (Figura S3).
Tomados en conjunto, estos resultados indican una colonización altamente selectiva de metástasis por GLV-1h68 cuando se comparan con los tumores primarios.
Análisis de los factores microambientales en tumores primarios y metástasis necesario para concentraciones virales mejoradas en metástasis de ganglios linfáticos
para encontrar razones para la colonización vírica mejorada de linfa metástasis en los ganglios, se analizó la situación de la PC-3 tumores y metástasis antes de la inyección del virus vaccinia ha producido. Varios diferencias en el microentorno de los tumores y las metástasis que pueden ser cruciales para el virus de colonizar metástasis en un grado más alto de lo que se consideran tumores. Por lo tanto, la vasculatura, el estado proliferativo de las células PC-3, extensión de la necrosis, las células inmunes y la expresión de citoquinas en los tumores, los LN y RN se analizaron en ratones portadores de tumor PC-3-RFP no infectadas. Para imitar la situación de los pacientes con cáncer en etapa avanzada cuando ocurre generalmente diagnóstico de cáncer, se analizaron parámetros microambientales en la etapa final de la enfermedad entre los 45-60 días después de la implantación de células tumorales.
aumento de la permeabilidad vascular en los ganglios linfáticos metástasis.
en primer lugar, analizamos si se producen diferencias en la vasculatura con respecto a la densidad y la permeabilidad de los vasos entre tumores y metástasis, lo que lleva a una cantidad inicial más alto de partículas virales dentro de los diferentes tejidos tumorales. Histología de PC-3-RFP tumores, los LN y enfermeras se realizó y los vasos sanguíneos se marcaron con CD31. Aunque, no se observaron diferencias en la densidad de los vasos sanguíneos entre los tumores y metástasis 57 días de la implantación de células tumorales post (Figura 2a grupo PBS), la intensidad de fluorescencia de la tinción de CD31 fue significativamente mayor en los LN y RN en comparación con los tumores sólidos (Figura 4a) . En general, el marcador CD31 vaso sanguíneo es altamente hasta reguladas en las células endoteliales en los tejidos inflamados o en los sitios de la transmigración de leucocitos en curso y se asocia con una mayor permeabilidad vascular [17]. Por lo tanto, se realizó un estudio microscópico detallada de los vasos sanguíneos en relación con el diámetro del vaso y de la permeabilidad vascular en los tumores en comparación con aquellos en las metástasis. De manera significativa, los LN y enfermeras revelaron diámetros de los vasos sanguíneos más altos (diámetro 15 micras media) que los tumores PC-3-RFP sólidas (diámetro medio de 10 micras) (Figura 4b). Para averiguar si estos vasos sanguíneos dilatados de hecho contribuyen a una mayor permeabilidad vascular en metástasis a ganglios linfáticos, los patrones de extravasación de forma intravenosa inyectaron ratas-IgG se analizaron histológicamente. Curiosamente, se detectaron mayores cantidades significativas de extravasado de IgG en las metástasis (área media de IgG-positivo alrededor del 60%) en comparación con los tumores (área media de IgG positivo 25%).