Extracto
Antecedentes
Runt-relacionada con el factor de transcripción 3 (RUNX3) es un supresor de tumores de cáncer y que parece ser una componente importante del factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) inducida por vía de supresión tumoral. Sorprendentemente, se encontró que el nivel de expresión de RUNX3 en los tejidos del cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) de cabeza y, lo que es uno de los tipos más comunes de cáncer humano, fue mayor que en los tejidos normales por un conjunto de datos de microarrays publicado previamente en nuestro estudio preliminar. Por lo tanto, aquí hemos examinado el papel oncogénico de RUNX3 en CECC. No se observaron
Principales conclusiones
RUNX3 expresión frecuente y su correlación con el comportamiento maligno en CECC. Ectópico sobreexpresión de RUNX3 promueve el crecimiento celular y la apoptosis suero inhibe el hambre y la inducida por la apoptosis inducida por el fármaco quimioterapéutico en células HNSCC. Estos resultados fueron confirmados por caída RUNX3. Por otra parte, la sobreexpresión RUNX3 mejorada tumorsphere formación. nivel de expresión de RUNX3 se correlaciona bien con el estado de metilación en las células HNSCC. Además, la expresión de RUNX3 fue baja debido a la metilación de su promotor en las células epiteliales orales normales.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos sugieren que i) RUNX3 tiene un papel oncogénico en HNSCC, ii) RUNX3 expresión observada en los CECC puede deberse, en parte, por desmetilación durante el desarrollo del cáncer, y iii) la expresión de RUNX3 puede ser un marcador útil para predecir el comportamiento maligno y el efecto de los fármacos quimioterapéuticos en el CECC
Visto:. Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa I, Fujita T, Kurihara H, et al. (2009) RUNX3 tiene un papel oncogénico en cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10.1371 /journal.pone.0005892
Editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 4 Febrero 2009; Aceptado el 15 mayo del 2009; Publicado: 12 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Tsunematsu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado por becas-en-ayudas del Ministerio de educación, Ciencia y Cultura de Japón (YK y TT) y Satake educación y la investigación de subvención (YK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
RUNX3 /AML2 /PEBP2C /CBFA3 es un factor de transcripción y una de la familia relacionados con Runt (RUNX). Tres miembros de la familia de genes Runx,
RUNX1
,
RUNX2
y
RUNX3
, y el gen relacionado,
CBFB /Pebpb2
, son todos conocidos como los reguladores de desarrollo y han demostrado ser importantes en los cánceres humanos [1]. RUNX3 se clonó originalmente como AML2 y se localiza en el cromosoma 1p36.1 [2]. RUNX3 tiene múltiples funciones y fue en primera informó que se correlaciona con la génesis y progresión del cáncer gástrico humano como un supresor de tumor [2]. Runx3 nulo ratones muestran hiperplasia de la mucosa gástrica como resultado de la proliferación estimulada y la apoptosis de las células epiteliales suprimido [3]. De hecho, RUNX3 se inactiva en más de 80% de cáncer gástrico humano por el silenciamiento de genes y proteínas mislocalization [4]. Además de cáncer gástrico, se ha informado de que no se observó reducción de la expresión de RUNX3 en varios tipos de cáncer, incluyendo la vejiga, el hígado, colorrectal y los cánceres de pulmón [5] - [8]. En estos tumores, la reducción de expresión de RUNX3 fue causada frecuentemente por hipermetilación isla CpG [9]. Por otra parte, las mutaciones puntuales de
RUNX3
se observaron en cierto tipo de cánceres humanos, incluyendo el cáncer gástrico y de la vejiga [3], [5]. Tomados en conjunto, los actos RUNX3 como un supresor de tumores en varios tipos de cáncer.
Carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es uno de los tipos más comunes de cáncer humano, con una incidencia anual de más de 500.000 casos en todo el mundo [ ,,,0],10]. Como la mayoría de los cánceres epiteliales, CECC se desarrolla a través de la acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas en un proceso de múltiples pasos [11]. Sorprendentemente, se encontró que el nivel de expresión de RUNX3 en los tejidos HNSCC fue mayor que en los tejidos normales por un conjunto de datos de microarrays publicado previamente de 41 pacientes HNSCC y 13 controles normales en nuestro estudio preliminar [12] (Figura 1A). Curiosamente, recientemente se ha informado que la sobreexpresión RUNX3 se observó en el carcinoma de células basales de la piel [13]. Por lo tanto, pensamos que RUNX3 podría tener un papel oncogénico en HNSCC, así como en el carcinoma de células basales de la piel. En el presente estudio, hemos examinado la expresión y el papel de RUNX3 para el desarrollo CECC
A:. El ARN total de 41 CECC primaria y 13 tejidos normales se marcó y se hibridó a Affymetrix U133A chips de genes como se informó anteriormente. El gráfico muestra el promedio de intensidad de la señal de RUNX3 en 41 CECC y 13 tejidos normales en el análisis de microarrays. nivel de expresión RUNX3 en HNSCC es mayor que la de los tejidos normales. B: La expresión de mRNA de RUNX3 en 14 líneas celulares CECC (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1, Ho-1-T-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, HOC621, HOC119, HOC313, TSU y OMI) por RT-PCR. GAPDH se utilizó como control. C: Expresión de RUNX3 de ARNm en diversas líneas celulares de cáncer, incluyendo el cáncer de colon (RKO y HCT116), cáncer gástrico (MKN-1 y MKN-45), leucemia (HL60), linfoma (U937) y cáncer de mama (MCF7 y SK-BR3 ). GAPDH se utilizó como control. D: La expresión de RUNX3 mRNA en 18 casos HNSCC por RT-PCR. GAPDH se utilizó como control. E: Expresión de la proteína RUNX3 en 6 líneas celulares (CECC HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1 y HO-1-T-1) fue examinado por Western blot. Cul1 expresión se utilizó como control de carga.
Materiales y Métodos
Reactivos
Transformar SS1 del factor de crecimiento (TGF-ß), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ) y derivado de plaquetas factor de crecimiento AA (PDGF-AA) se obtuvieron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN). factor de crecimiento de insulina (IGF) se obtuvo de Sigma (Saint Louis, MO). factor de crecimiento epidérmico (EGF) se obtuvo de Pepro Tech EC (Londres, UK). Adriamicina (doxorubicina clorhidrato) se obtuvo de Sigma.
Líneas celulares y muestras de tejidos
líneas celulares CECC (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-T-1 y Ho -1-N-1) fueron proporcionados por la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Banco de células. líneas celulares CECC (ZA, HOC719-PE, HOC-719-NE, HOC621, HOC119, HOC313, TSU y OMI) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Kamata (Universidad de Hiroshima). líneas celulares de cáncer gástrico, líneas (MKN-1 y MKN-45) de cáncer de colon de células (RKO y HCT116), líneas celulares de cáncer de mama (MCF7 y SK-BR3), la línea celular de linfoma (U937) y la línea celular de leucemia (HL-60 ) fueron proporcionados por la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación del Banco de la célula. Se mantuvieron en RPMI-1640 o Modificado Medio Eagle (Nissui Pharmaceutical Co., Tokio, Japón) de Dulbecco suplementado con FBS inactivado por calor 10% (Invitrogen) y 100 U /ml de condiciones de penicilina-estreptomicina (Gibco) bajo de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C. Para el ensayo de crecimiento, se sembraron 5000 células en placas de 24 pocillos (Falcon), y las células tratadas con tripsina contados en 0, 2, 4, 6 días por Cell contador (Coulter Z1). tejidos de la lengüeta de embriones de ratón en el día embrionario ratones BALB /c 15.5 y 10 semanas fueron usados para histología e inmunohistoquímica. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Hiroshima.
Las muestras de tejido de los CECC fueron recuperados del Registro de Patología Quirúrgica del Hospital de la Universidad de Hiroshima, una vez aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Universidad de Hiroshima. Cada paciente firmó el consentimiento informado. Cincuenta y dos casos de HNSCC y 9 tejidos de la mucosa oral normal se utilizaron en este estudio. Cinco tejidos de cáncer de colon también se utilizaron para el análisis de inmunohistoquímica (amablemente proporcionado por el Dr. Shimamoto, la Prefectura de Hiroshima Universidad).
10% tamponada con formalina fijo y tejidos embebidos en parafina se utilizaron para el estudio inmunohistoquímico. El grado histológico y el estadio del tumor se clasificaron según los criterios de la Sociedad Japonesa para el cáncer de cabeza y cuello. Las muestras frescas fueron tomadas de los tejidos HNSCC para el análisis de RT-PCR.
RT-PCR
ARN total se aisló a partir de cultivos de células confluentes utilizando el Kit RNeasy Mini (Qiagen). Las preparaciones se cuantificaron y su pureza se determinó por métodos espectrofotométrico estándar. cDNA fue sintetizado a partir de 1 g de ARN total de acuerdo con el Dash ReverTra (Toyobo Bioquímicos, Tokio, Japón). amplificación por PCR de RUNX3 se hizo utilizando el cebador directo; 5'-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 'y el cebador inverso; 5'-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 '. GAPDH se utilizó como control. Las alícuotas de ADNc total fueron amplificados con Go Taq® verde Master Mix (Promega), y amplificaciones se realizaron en un termociclador PC701 (Astec, Fukuoka, Japón) durante 30 ciclos después de una desnaturalización inicial de 30 segundos a 94 ° C, recocido de 30 seg a 60 ° C, y se extendió durante 1 min a 72 ° C en todos los cebadores. Los productos de reacción de amplificación se resolvieron en 1,5% de agarosa /TAE geles (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japón), electroforesis a 100 mV, y se visualizó por tinción con bromuro de etidio.
Western blot análisis
Western Blot se llevó a cabo como se describió anteriormente [14]. Se utilizaron un anticuerpo monoclonal anti-RUNX3 (R3-5G4, proporcionado amablemente por el Dr. Ito, Instituto de Biología Molecular y Celular, Singapur), anticuerpo monoclonal anti-FLAG (M2, Sigma) y anti-Cul1 anticuerpo policlonal (Zymed). Treinta g de proteína se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% seguido por electrotransferencia a un filtro de nitrocelulosa. Para la detección de la inmuno-complejo, el sistema de detección de Western blotting ECL (Amersham) se utilizó.
tinción inmunohistoquímica
Detección inmunohistoquímica de RUNX3 en casos HNSCC se realizó en 4,5 micras secciones montadas en el silicio portaobjetos de vidrio recubiertas, utilizando una técnica de peroxidasa estreptavidina-biotina como se describe anteriormente [14]. La detección inmunohistoquímica de Runx3 en varios casos de cáncer humano incluyendo 3 cánceres de esófago, 3 cánceres gástricos, 3 cánceres de colon, 3 tipos de cáncer de recto, 3 tipos de cáncer de páncreas, 3 cánceres de hígado, 3 cánceres de pulmón, 3 cánceres de riñón, 3 tipos de cáncer de la vejiga, y 4 tipos de cáncer de útero se ha realizado mediante microarrays de tejidos (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japón). Para el estudio inmunohistoquímico, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-RUNX3 (R3-6E9, proporcionado amablemente por el Dr. Ito, Instituto de Biología Molecular y Celular, Singapur). Para el estudio inmunohistoquímico de tejidos de ratón, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-Runx3 (R3-1E10, MBL Co. Ltd.). La expresión de RUNX3 se calificó como positivo (más del 5% del tumor o las células epiteliales mostró immunopositivity) y negativo (menos de 5% de las células epiteliales del tumor o mostró immunopositivity débil o focal o ninguna tinción). Tres patólogos (Y.K., I.O., y T. T.) realizan todas las evaluaciones. Posible correlación entre las variables de las muestras tumorales analizadas fue probado para la asociación por la prueba exacta de Fisher. A
P
valor & lt; 0,05 se requería para la significación
tratamiento
5-aza-2 'desoxicitidina
células
HSC4 y células epiteliales normales se trataron con medio que contenía 300 nM. 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma) durante 72 h. Después del tratamiento, se recogieron y examinaron la expresión de RUNX3 ARNm por RT-PCR células.
modificación con bisulfito y reacción de metilación específica de cadena de la polimerasa (PCR)
ADN genómico a partir de células o tejidos se extrajo usando el kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). Cincuenta microlitros del sobrenadante se utilizaron directamente como fuente de ADN para el tratamiento de bisulfito de sodio. Las muestras de ADN fueron tratados con bisulfito para convertir todas las citosinas no metiladas a uracilos dejando citosinas metiladas no afectado. ADN se desnaturalizó por NaOH (concentración final, 0,2 M) durante 10 min a 37 ° C. Treinta l de hidroquinona 10 mM (Sigma) y