Extracto
cáncer de pulmón de células escamosas (SCC) y adenocarcinoma son los
más comunes subtipos histológicos de no
cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), y se han administrado tradicionalmente en la clínica como una sola entidad. El aumento de la evidencia, sin embargo, ilustra la diversidad biológica de estos dos subgrupos histológicos de cáncer de pulmón, y apoya la necesidad de mejorar nuestra comprensión de las bases moleculares más allá de los diferentes fenotipos si nuestro objetivo es desarrollar una terapia más específica e individualizada dirigida. El propósito de este estudio fue identificar los microARN (miARN) que dependen de la transcripción que regula las diferencias entre SCC y adenocarcinoma subtipos de cáncer de pulmón histológico. En este trabajo, se combina miARN (667 miRNAs por TaqMan Arrays de baja densidad (TLDA)) y el ARNm de perfiles (Whole Genome 44 K gama G112A, Agilent) se realizó en muestras tumorales de 44 pacientes con CPNM. Se encontraron nueve miRNAs y 56 que los ARNm se expresa de forma diferente en comparación con muestras de adenocarcinoma SCC. Once de estos 56 mRNA fueron predichas como blancos de los miRNAs identificados que se expresan de forma diferente en estas dos condiciones histológicas. De ellos, 6 miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a y miR-708) y 9 genes diana (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) fueron validados por PCR cuantitativa en una cohorte independiente de 41 pacientes con cáncer de pulmón. Por otra parte, también se validó la correlación inversa entre el ARNm y microRNAs expresión. Estos resultados sugieren que las diferencias de regulación transcripcional de los genes miARN dependientes desempeñan un papel importante en la determinación de características clave de CPNM, y pueden proporcionar nuevos biomarcadores para las estrategias de tratamiento personalizado
Visto:. Molina-Pinelo S, G Gutiérrez, Pastor MD, Hergueta M, Moreno-Bueno G, García-Carbonero R, et al. Reglamento (2014) microARN-dependiente de la transcripción en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10.1371 /journal.pone.0090524
Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: 29 Agosto, 2013; Aceptó 3 de febrero de 2014; Publicado: 13 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Molina-Pinelo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. LPA es financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (PI081156, PI1102688 y R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (P08-CVI-04090), y la participación de Roche en el 75 aniversario, España. SMP es financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (CD1100153), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cáncer, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 y PI-0046/2012), y la Fundación Mutua Madrileña (2009 ). MDP está financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (CD0900148). RGC está financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (PI10 /02164). GMB es financiado por SAF2010-20175 y Comunidad de Madrid (S2010 /DMB-2303). laboratorio de AC fue apoyado por becas a partir del Ministerio de Economía y Competitividad, ISCIII Español (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejería de Ciencia e Innovación (CTS-6844) y la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (PI-0135 hasta 2.010 y PI-0.306-2.012). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, siendo responsable de un millón de muertes al año [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 80% de todos los tumores de pulmón, e incluye varios subtipos histológicos, como el carcinoma de células grandes (LCC), carcinoma de células escamosas (SCC), y el adenocarcinoma. SCC y adenocarcinoma son los
tipos más comunes de NSCLC, que representan el 25% y el 40% de todos los casos, respectivamente [2], [3]. SCC deriva del epitelio multicapa displásicos en el
centro de las vías respiratorias
, mientras que el adenocarcinoma se origina preferentemente a partir de células precursoras de la mono- o bicapa superficie del epitelio de la periferia del pulmón [4].
NSCLC , independientemente del subtipo histológico, España se ha tratado tradicionalmente en la clínica como una entidad única y homogénea. Sin embargo, cada vez más pruebas ilustra la gran diversidad biológica de esta enfermedad, que está llevando progresivamente a las estrategias diagnósticas y terapéuticas más específicas dependiendo del subtipo histológico de que se trate. De hecho, los avances en la terapia del cáncer de pulmón dirigido ahora exigen una clasificación precisa de NSCLC [5]. Por ejemplo, las mutaciones de EGFR son más frecuentes en los pacientes con adenocarcinoma de pulmón, y la presencia de estas mutaciones se asocian con la sensibilidad a los inhibidores de EGFR tirosina quinasa [6]. Del mismo modo, traslocaciones ALK, presentes en sólo el 4% de los adenocarcinomas, son predictivos de una alta sensibilidad a las terapias ALK-dirigida como crizotinib. Por el contrario, FGFR1 amplificación se observa con mayor frecuencia en SCC, y ahora se está considerando un objetivo potencialmente procesables en los ensayos clínicos con inhibidores de FGFR [7]. Por lo tanto, un mayor conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la génesis, la progresión y propagación de los diferentes subtipos de NSCLC es necesaria para el desarrollo de métodos de diagnóstico específicos y el diseño de estrategias terapéuticas más adecuadas, individualizadas y eficaces.
Los grandes avances en las tecnologías de genómica han generado muchos biomarcadores candidatos con potencial valor clínico en CPNM. Los microARN, como moduladores post-transcripcional, son actores clave en la regulación de muchos procesos biológicos. La desregulación de sus papeles fisiológicos contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo el inicio y la progresión del cáncer. En este contexto, una serie de estudios han evaluado el papel potencial de las firmas de miARN para discriminar subtipos histológicos o para predecir la recurrencia o la supervivencia de los pacientes con CPNM [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], y los genes miARN perfiles se ha propuesto como una estrategia muy fiable para la clasificación de NSCLC [11], [15], [16]. Sin embargo, la alta complejidad de la regulación del transcriptoma complica la comprensión completa de las redes de regulación de genes implicados en estos procesos.
Para hacer frente a este problema, el objetivo de este estudio fue evaluar las diferencias de regulación transcripcional de los genes miARN-dependiente entre el SCC y el adenocarcinoma histológicos subtipos de cáncer de pulmón. Con este fin, y miARN ARNm emparejados perfiles de expresión fueron analizados en muestras de tumores de NSCLC, y se exploraron las posibles interacciones entre ellos. En este estudio hemos identificado y validado un subconjunto de miRNAs desregulados y los genes diana que son capaces de definir las características moleculares distintivas de estos dos grandes subtipos histológicos de NSCLC.
Materiales y Métodos
Pacientes y Las muestras de tumor
Los pacientes incluidos en este estudio fueron obligados a tener histológicamente confirmado SCC etapa temprana o adenocarcinoma NSCLC. muestras tumorales de 85 pacientes se recogen de forma prospectiva durante el procedimiento quirúrgico e inmediatamente se congelaron rápidamente-a -80 ° C hasta su uso posterior. tejido pulmonar no tumoral adyacente también se recogió de los pacientes incluidos en la cohorte de validación. El protocolo de estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de los centros participantes [Hospital Universitario Doce de Octubre (Madrid) y el Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla)] y todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito antes de la entrada en el estudio informó. Los datos clínicos y patológicos fueron extraídos de los registros médicos y revisados de forma centralizada para el propósito de este estudio. La población de estudio se dividió en una cohorte de formación (N = 44) que se utilizó para el desarrollo del perfil y una cohorte independiente de validación (N = 41). Principales características de la población de estudio se resumen en las Tablas 1 y 2.
microarrays de la Expresión Génica Perfiles
Microarray experimentos se realizaron con Whole Genoma Humano 44 K gama G4112A (Agilent Technologies , Wilmington, DE). RNA fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen) y RNAesy Extraction Kit (Qiagen, Alemania) como se indica por los fabricantes. ARN se marcó y se hibridó matriz usando el kit de ARN lineal de baja amplificación y la hibridación in situ con Plus Kit (Agilent Technologies, Wilmington, DE), respectivamente. Después de la hibridación y el lavado, las diapositivas fueron escaneadas en un escáner GenePix Axon (Axon Instruments Inc., Union City, CA) y se analizaron mediante extracción de características de software 6.1.1 (Agilent Technologies, Wilmington, DE). ARN de muestras tumorales fueron etiquetados con Cy5-dUTP, y se hibridó en contra de una reserva de referencia del cáncer de pulmón (marcado con Cy3-dUTP con) que consiste en tejido de tumor primario de pacientes con diferentes subtipos histológicos de cáncer de pulmón. Como control, diez hibridaciones adicionales se realizaron con el etiquetado de fluorocromo recíproco.
Para detectar los genes expresados diferencialmente entre los dos subtipos histológicos, se realizaron dos tipos de análisis con la herramienta MIDAW [17]. En primer lugar, se realizó una prueba t con el control de la tasa de falso descubrimiento (FDR) estimado mediante el procedimiento de Bonferroni de una sola etapa. Genes que pasaron el filtro de la prueba t se sometieron a un segundo filtro. Sólo los genes que muestran un valor de la relación media logarítmica un menor que -0,3 o superior a 0,3 (equivalente a un cambio de 2 veces) fueron seleccionados como expresados diferencialmente. En segundo lugar, un análisis discriminante para la identificación del conjunto de mejores genes marcadores fue realizado en base al análisis de microarrays algoritmo de predicción (PAM). tablas de datos en bruto de microarrays se han depositado en el Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso de GSE42998.
MicroARN QRT-PCR ensayo
El ARN total, que contiene pequeños ARN, fue extraído de muestras de tejido tumoral kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El rendimiento de ARN total se determinó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Tech, DE, EE.UU.). El Agilent 2100 Bioanalyzer se utilizó para determinar la cantidad y calidad de las muestras de ARN (Agilent, Palo Alto, CA). miARN expresión humana madura se detectó y se cuantificó usando las matrices TaqMan de baja densidad (TLDA) sobre la base de 7900 HT Micro neumático Tarjetas de Applied Biosystems (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La matriz v2.0 microARN humano conjunto de tarjeta (número de catálogo 4400238) es un conjunto de dos cartas que contiene un total de 384 ensayos TaqMan microARN por tarjeta para permitir la cuantificación exacta de 667 microARN humanos, todos catalogados en la base de datos miRBase. TLDAs se realizaron en un proceso de dos pasos. Brevemente, durante la primera etapa, 450 ng de ARN total fueron transcritas inversa usando Megaplex RT cebadores y el kit de transcripción inversa TaqMan miARN en un volumen total de 7,5 l. Los 7,5 reacciones l se incubaron en un G-Tormenta Termociclador (Tecnologías Genéticas, Essex, Reino Unido) durante 2 minutos a 16 ° C, 1 min a 42 ° C y 1 min a 50 ° C durante 40 ciclos, se mantuvo durante 5 min a 85 ° C, y después se mantuvo a 4 ° C. En el segundo paso, 6 l de muestra de ADNc y la mezcla maestra TaqMan Universal de PCR se cargaron en los puertos de llenado en la tarjeta de microfluidos TLDA. La tarjeta se centrifugó brevemente durante 1 min a 331 g para distribuir las muestras en los múltiples pozos conectados a los puertos de llenado y luego sellada para evitar la contaminación del pozo a pozo. Las reacciones se incubaron en una placa de 384 pocillos a 50 ° C durante 2 seg y 94,5 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 97 ° C y 1 min a 59 ° C. Por último, las tarjetas fueron procesados y analizados en un Sistema de Detección de Secuencia HT ABIPrism 7900. tablas de datos en bruto TLDA se han depositado en el Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso de GSE43000. La expresión de miRNAs objetivo se normalizó a la expresión de RNU48. Una miRNA no humano, se utilizó en cada experimento como un control negativo. valores de ciclo umbral (Ct) se calcularon utilizando el software de SDS v.2.3 utilizando la configuración básica automática y un umbral de 0,2. la cuantificación relativa de la expresión de los genes miARN se calculó por la 2
-ΔCt método (usuario boletín Applied Biosystems no. 2 (P /N 4303859)). Sólo miRNA detectable en por lo menos 80% de las muestras se consideraron para la evaluación. Importancia de las diferencias de expresión de los genes miARN observadas entre los dos subgrupos histolofical (adenocarcinoma y SCC) se evaluó mediante la prueba t.
ARNm y la expresión de miRNA Correlación Evaluación
Para evaluar la posible asociación entre expresados diferencialmente ARNm y miARN observada en nuestro estudio, se realizaron búsquedas de los objetivos de la transcripción de los miRNAs identificados en tres bases de datos web para la predicción de los genes miARN objetivo: Miranda [18], TargetScan versión 6.0 [19], y miRWalk [20]. Se seleccionaron los genes diana putativos que coincidían con las que se encuentran para ser desregulada en nuestra población de pacientes para su posterior validación por qPCR.
genes de validación de perfiles de microarrays de expresión génica mediante qPCR
Once expresados diferencialmente entre los dos condiciones de estudio (SCC) y adenocarcinoma de NSCLC, identificados como supuestos objetivos de varios miRNAs des-regulados, se seleccionaron para su posterior validación por qPCR en la cohorte original de entrenamiento y luego en una cohorte de validación independiente. El ARN se transcribe de forma inversa a cDNA con la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems). Brevemente, el ADNc de cadena simple se sintetizó a partir 1 g RNA total en 10 l de volumen de reacción, de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción se incubó a 25 ° C durante 10 min seguido de 120 min a 37 ° C y la inactivación a 85 ° C durante 5 min. Se utilizó el sistema de ensayo TaqMan Expresión Génica (Applied Biosystems) para cuantificar los niveles de transcripción de genes seleccionados (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3
y
KRT6A )
. Tres genes endógenos de control (
B2M
,
ACTB
y
GAPDH
) y uno sin molde y controles (NTC) fueron también se ejecutan para cada ARN muestra. Elegimos
B2M
para la normalización a través de diferentes genes como este gen mostró la expresión más relativamente constante a través de diferentes muestras de tejido (datos no mostrados). La expresión génica de cada gen se determinó utilizando el nivel de expresión medio de las tres repeticiones técnica. Las reacciones de PCR se realizaron en un sistema de Detección de Secuencia Applied Biosystems 7900HT en 10 volúmenes mu l a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Los valores de Ct se obtuvieron con el v.2.3 software SDS (Applied Biosystems). la cuantificación relativa de la expresión del ARNm se calculó por la 2
-ΔCt método (usuario boletín Applied Biosystems no. 2 (P /N 4303859)).
La validación de los perfiles de expresión de los genes miARN TLDA por qPCR
la expresión de nueve seleccionados miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 y miR-708) se evaluó en el cohorte independiente de la validación de los ensayos TaqMan microARN específicos de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Brevemente, 2 ng /l de RNA total se convirtió en cDNA por reacción de transcriptasa inversa que se realizó por incubación secuencial a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min y 85 ° C durante 5 min. mezcla de reacción de PCR (10 l) contenía 0,66 l de producto de RT, 5 l de Master Mix 2X TaqMan PCR Universal y 0,5 l de la MicroARN Ensayo TaqMan apropiado (20X) que contiene cebadores y la sonda para el miARN de interés (Applied Biosystems). La mezcla se incubó inicialmente a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 60 segundos. la expresión de microARN se cuantificó por el método comparativo 2
-ΔΔCt, la normalización de los valores de Ct para RNU48. En la cohorte de validación, los valores de expresión del tumor eran, además, normalizado a los valores de expresión en el tejido pulmonar normal adyacente emparejado.
3'-UTR reportero de ensayo para MIR Validación del destino
Confirmación de miR-149 vinculante a los 3 'UTR de ABCC3 y de miR-378 y miR-422 vinculante a los 3' UTR de TMEM45B. HEK 293 células en 80% de confluencia fueron co-transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa que albergan el completa 3'-UTR del gen deseado (Conmutación de Genómica) junto con 100 nM de cada control miARN miR-imitan o (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) fue utilizado como el reactivo de transfección en
Opti-MEM
(Life Technologies). La luminiscencia se ensayó 24 horas más tarde usando LightSwitch ensayo Reactivos (Conmutación de Genómica) según las instrucciones del fabricante. Caída se evaluó mediante el cálculo de la razón de señal de luciferasa de miARN específico /control no diana, usando vacío vector indicador como control para los efectos no específicos. Cada experimento se realizó por triplicado. t-test se realizó para los pozos de múltiples experimentos, y se compararon las células transfectadas-mímica con un control sinóptico para cada vector de genes.
Evaluación de rendimiento diagnóstico de los genes seleccionados
Se calcularon los parámetros de rendimiento diagnóstico para los genes seleccionados de las tablas de contingencia de 2x2. Los intervalos de confianza para estos parámetros se calcularon con el método de Pearson sobre la base de la distribución F. Como la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) son medidas estadísticas de la realización de una prueba de clasificación binaria, los valores de expresión de genes se convierten en variables binarias con el valor medio de expresión como valor de referencia (alta versus baja expresión). Estos parámetros se calculan para cada par de mRNA validado miARN /target. La ocurrencia simultánea de los genes miARN expresión alta y baja expresión del ARNm diana en el estado histológico correspondiente (SCC o adenocarcinoma) se consideró una verdadera prueba positiva. Sensibilidad o verdaderas medidas tasa positiva la proporción de positivos reales que se han identificado correctamente. Especificidad o verdaderos medidas de tasas negativas, la proporción de negativos correctamente identificados. El PPV describe la probabilidad de tener la enfermedad dado un resultado positivo en la prueba de cribado en la población analizada. El VAN describe la probabilidad de no tener la condición dado un resultado negativo prueba de cribado en la población analizada.
Resultados
Perfil de Desarrollo
Perfiles de expresión génica por subtipo histológico.
Todo el genoma arrays de expresión se realizaron en muestras tumorales de pacientes de la cohorte de formación, y los perfiles de expresión de SCC y tumorales de adenocarcinoma tipos se compararon un gen a la vez usando el de una sola muestra de
t CD - prueba. Después del ajuste de Bonferroni de un solo paso, se identificaron a ser expresadas diferencialmente en más de dos veces en cualquiera de subtipo histológico con respecto a la reserva de referencia (tablas A, B, C y D en la Tabla S1) 727 genes. De estos 727 genes, cinco fueron reguladas y 195 las reguladas en los pacientes con adenocarcinoma, y 13 fueron reguladas y 516 las reguladas en los pacientes con SCC.
Además, una segunda evaluación independiente del ARNm la expresión diferencial se realizó mediante el análisis de datos de microarrays discriminante para minimizar falsos resultados positivos. El Análisis de Predicción de Microarray algoritmo (PAM) identificó 61 genes que definen una firma molecular capaz de discriminar adenocarcinoma de muestras de SCC (figura 1). De estos 61 genes, los genes desregulados 56 coincidentes encontrados por el realizado previamente una muestra de t-test, y por lo tanto fueron seleccionados para su posterior análisis y validación.
El análisis de microarrays algoritmo de predicción identificó 61 genes que definían un molecular firma para cada subtipo histológico. dendrograma los moduladores 'representa un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de 19 y 25 adenocarcinoma SCC en base a su perfil de expresión génica. El mapa de calor era un código de color que utiliza el rojo para la regulación y verde para la regulación a la baja de una reserva de referencia cáncer de pulmón. En la página
parte superior del mapa montón de búsqueda colores se corresponden con los perfiles de expresión génica de muestras de SCC (azul) frente a muestras de adenocarcinoma (rojo).
perfil de expresión de microARN por subtipos histológicos.
los microARN matrices TLDA se realizaron en muestras tumorales de pacientes de la cohorte de formación. Se encontraron nueve miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a, miR-483-5p, miR-494, miR-601 y miR-708) que se expresó diferencialmente entre el SCC y subtipos histológicos de adenocarcinoma de un umbral corregido-FDR de 0,05. Ocho de estos 9 miRNAs se sobre-expresa en SCC en comparación con adenocarcinoma, y uno (miR-375) fue sobre-expresado en el adenocarcinoma en comparación con SCC (Tabla 3).
objetivo de predicción microARN.
Once de los 56 genes (20%) se encuentran para ser desregulado por tipo tumoral en nuestro estudio se encontró que eran los supuestos objetivos de al menos uno de los 9 miRNAs también identificados para ser expresadas diferencialmente en la población estudiada según subtipo histológico (SCC frente al adenocarcinoma). Para los 8 miRNAs sobreexpresado en SCC, 8 mRNA (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B
y
MUC1
) estaba previsto como objetivos por varios algoritmos. Se encontró que estos genes que se redujeron reguladas en SCC en comparación con adenocarcinoma en nuestro estudio (Tabla 2). Tres de estos 8 genes (
CEACAM6, MLPH
y
TMEM45B)
se predijo objetivos de más de uno de estos miRNAs (Figura 2). Como se muestra en la tabla 2, tres genes (
DSC3, KRT6A
y
DMRT2
) fueron predichas como objetivos de miR-375, el miARN aumentada en el adenocarcinoma, y estos genes fueron consistentemente el regulado en este subtipo histológico.
El gráfico muestra los objetivos transcripcional de manera diferente expresaron miRNAs en SCC y tumorales de adenocarcinoma tipos utilizando tres bases de datos web de miARN objetivo de predicción (Miranda, TargetScan y miRWalk). El esquema de color predeterminado que se utiliza para representar el nivel de expresión es de color rojo /azul (rojo para la sobre-expresión de ARNm o miRNAs en SCC contra el adenocarcinoma y el azul para abajo-expresión de ARNm o miRNAs en SCC frente adenocarcinoma). El
flechas indican
ARNm represión por parte del
miRNAs conectada
. Los cuadrados representan los ARNm desregulados y óvalos representan expresados diferencialmente miRNAs en el adenocarcinoma de pulmón y SCC.
Perfil de validación
Validación de la expresión diferencial de genes por RT-PCR cuantitativa.
once genes desregulados (
CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2
y
KRT6A), Francia identificado como objetivo genes putativos de miRNAs desregulados en nuestro estudio , a continuación, se seleccionaron para su posterior validación por rtPCR tanto en la cohorte de formación y en una cohorte independiente de los pacientes.
en la cohorte de formación, 9 de los 11 genes ensayados se confirmó que se expresó diferencialmente por subtipos histológicos por cuantitativos PCR (figura 3).
CEACAM5
,
CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5
,
MLPH
y
TMEM45B
fueron significativamente las reguladas en SCC, y
KRT6A
fue significativamente las reguladas en el adenocarcinoma.
Para validar los genes identificados como diferencialmente expresado por la histología del tumor en los datos de microarrays, los niveles relativos de expresión de ARNm se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando el método? Ct por
B2M
como gen de mantenimiento. Los gráficos muestran valores de la mediana? Ct de los genes validados en pacientes con adenocarcinoma frente SCC. Los datos derivados de RT-qPCR se presentan como log
2 2
-ΔCt valores.
P valor
por debajo de 0,05 fue considerado significativo.
Sobre la base de los resultados obtenidos en la cohorte de formación, se seleccionaron 9 ARNm y 9 miRNAs para su posterior validación por parte basada en TaqMan RT-qPCR en tumor y el tejido normal correspondiente a partir de una cohorte independiente de pacientes con cáncer de pulmón. En esta cohorte, los patrones de expresión de mRNAs fueron consistentes con los cuantificado en la cohorte de formación. Los patrones de expresión de subtipo histológico de los 9 ARNm probados se parecían a los observados en la cohorte de formación, y las diferencias observadas entre los subgrupos eran estadísticamente significativas (figura 4). En cuanto a las 9 miRNAs, cinco (miR-149, miR-205, miR-378, miR-422a y miR-708) resultaron ser significativamente sobre-expresado en SCC y miR-375 fue significativamente sobreexpresado en el adenocarcinoma (figura 5).
la expresión de ARNm nueve fue validado por PCR en tiempo real en una cohorte independiente de pacientes con CPNM. los niveles de expresión de ARNm se determinaron en muestras de tumores y el tejido pulmonar normal emparejados de pacientes con cáncer de pulmón y expresión relativa por subtipos histológicos se evaluó. La mediana de los valores ΔΔCt se determinaron en los genes validados en pacientes con adenocarcinoma y SCC. Los datos derivados de RT-qPCR se presentan como valores 2
-ΔΔCt.
P valor
por debajo de 0,05 fue considerado significativo.
Se evaluó la expresión de miRNAs desregulados en la cohorte de validación. los niveles de expresión de microARN se determinaron en el tumor y el tejido pulmonar normal emparejados de pacientes con cáncer de pulmón y expresión relativa por subtipos histológicos se evaluó. La mediana de los valores ΔΔCt se determinaron en nueve miRNAs en pacientes con adenocarcinoma frente SCC. Los datos derivados de RT-qPCR se presentan como valores 2
-ΔΔCt.
P valor
por debajo de 0,05 fue considerado significativo.
Correlación entre la expresión de los genes miARN y el ARNm.
Para estudiar la relevancia funcional de miRNAs en la regulación del ARNm específicos identificados como biomarcadores potenciales, analizamos en la cohorte de validación la correlación entre los miRNAs y predijo expresión diana-ARNm en cada paciente (figura 6). Se observó una correlación inversa entre el
ABCC3, MUC1
y
CEACAM6
y miR-149 niveles de expresión. Por otra parte, los niveles más altos de
CEACAM6
se asocia con niveles más bajos de miR-205 y miR-708, siendo la correlación significativa para el miR-708 (r = -0,362; p = 0,030).
ACSL5
y
KRT6A
tenían una correlación estadísticamente significativa con el miR-205 (r = -0,475; p = 0,003) y miR-375 (r = -0,311; p = 0,065), respectivamente .
En el caso de
TMEM45
B, se encontraron correlaciones significativas para el miR-378 y miR-422a (r = CD -
0,394, p = 0,016 yr = CD -
0,413, p = 0,015, respectivamente).
estos resultados sugieren un papel potencial de miRNAs en la regulación de estos genes. Posteriormente, algunos de estos objetivos se pusieron a prueba utilizando ensayos de gen reportero de la luciferasa. Hemos logrado que la sobreexpresión de miR-149 en células HEK 293 regula negativamente la actividad luciferasa de construcción de reporte que contiene el ABCC3 3-UTR (figura 7). Esto demuestra que miR-149 se une directamente a este ARN diana e inhibe su expresión. Además, la sobreexpresión de miR-378 y miR-422a inhibe significativamente la expresión TMEM45B (figura 7).
La expresión de los miRNAs 6 validados y la de sus genes diana putativos se midió en cada paciente en la cohorte de validación. El significado de la asociación inversa entre cada uno de estos miARN /parejas de ARNm se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. A) Las relaciones entre los
ABCC3
,
MUC1
y
CEACAM6
con miR-149. B) Las relaciones entre los
ACSL5
y
CEACAM6
con miR-205. C) Relación entre la
TMEM45B
y miR-378. D) Relación entre la
TMEM45B
y miR-422a. E) Relación entre
CEACAM6
y miR-7018. F) Relación entre la
KRT6A
y MIR-MIR-175.
Las células HEK 293 fueron transfectadas con el vector reportero de luciferasa que contiene la región 3 'UTR de ABCC3 y TMEM45B. vectores informadores fueron co-transfectadas con un MIRN MIRN imitan o de control imitan. Después de 24 h de incubación, se midió la actividad de luciferasa. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,001 por
t-test
rendimiento diagnóstico de los genes seleccionados para discriminar SCC a Adenocarcinoma histológico de NSCLC subtipos
Por último. , se evaluó la especificidad y sensibilidad de estos seis miRNAs validados en combinación con sus ARNm predichas para discriminar entre SCC y adenocarcinoma (figura 8). El mejor rendimiento se observó para
KRT6A, España como un objetivo de miR-375, con valores de sensibilidad y especificidad de 94,1% y 88,9%, respectivamente. El buen desempeño de diagnóstico también se observó para
CEACAM6, ACSL5 y MLPH, España como objetivos de miR-205, con valores más bajos de especificidad (71,4 a 76,2%), pero mayor sensibilidad (100%). Por último,
TMEMB45B, España como destino de miR-378, mostró una sensibilidad del 87,5% y una especificidad del 57,7%. Las otras parejas miARN /mRNA revelaron valores de sensibilidad y especificidad más bajas, aunque eran más de un 75% y un 50% en todos los casos, respectivamente (Tabla S2).
gráfico que muestra especificidad y sensibilidad de miRNAs validados en combinación con ARNm predichas para discriminar entre el SCC y el adenocarcinoma. Los colores representan las reguladas ARNm de seis miRNAs desregulados en los CE o adenocarcinoma.
Discusión
En este estudio se analizaron los ARNm y la expresión de los genes miARN firmas de pacientes con diferentes subtipos de NSCLC . Esto nos permitió construir un perfil transcripcional robusta de adenocarcinoma de pulmón y SCC. Nuestros resultados no sólo indican la existencia de un mRNA y o patrones de expresión /miARN que son capaces de distinguir entre SCC y adenocarcinoma, sino también que el patrón de expresión de genes alterados es causado en parte por la desregulación de los genes miARN específico.
En primer lugar, se analizaron mediante dos enfoques todo el genoma de datos de microarrays de expresión para minimizar los falsos positivos. Examinamos diferenciales niveles de expresión génica mediante el análisis de datos de microarrays discriminar y por el de una sola muestra de
t-test
. Se encontraron Cincuenta y seis genes para ser desregulado significativamente por ambos análisis y por lo tanto fueron seleccionadas para una evaluación y validación. Cabe destacar que varios de ellos habían sido previamente implicadas en los procesos biológicos relevantes (de acuerdo a la ontología de genes) en el cáncer de pulmón. Por ejemplo, algunos genes de la
KRT
familia, que se redujeron reguladas en el adenocarcinoma, participan en varias funciones celulares críticas tales como la migración celular, el crecimiento y la proliferación [21]. En segundo lugar, la elaboración de perfiles de miARN identificado 9 miRNAs que son expresados diferencialmente entre los dos subtipos histológicos de NSCLC estudiados. Seis de ellos (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422a y miR-708) fueron validados en una cohorte independiente de pacientes con CPNM como biomarcadores capaces de discriminar el adenocarcinoma y el SCC. Para evaluar si estos miRNAs podría ser una regulación directa de algunos de los 56 genes desregulados identificado, se utilizaron varios algoritmos que se utilizan ampliamente. Once de estos 56 genes (20%) fueron por lo tanto prevé que ser supuestos objetivos de al menos uno de los seis miRNAs encontrado que se expresa diferencialmente en SCC en comparación con adenocarcinoma.