Extracto
La patogenia del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) sigue siendo poco conocida. proteína de unión a calcio S100 A6 (S100A6) se ha asociado con PDAC; sin embargo, el efecto de S100A6 en la migración y la invasión PDAC aún no se ha explorado. En este estudio, las células Panc-1 fueron transfectadas con un plásmido para inducir la sobreexpresión de S100A6, y β-catenina fue derribado utilizando un ARN corto horquilla específica (shRNA). La curación de las heridas y los ensayos demostraron que Transwell S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC. Además, β-catenina shRNA inhibe la migración y la invasión de las células PDAC. Se confirmó que S100A6 induce la migración celular y la invasión PDAC través de la activación de β-catenina in vitro. Evaluación de niveles de ARNm y de proteínas reveló que S100A6 induce el aumento de expresión de β-catenina, N-cadherina y vimentina, y disminución de la expresión de E-cadherina en células PDAC. β-catenina shRNA también alteró la expresión de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) relacionados con la PI marcadores en células PDAC. Específicamente, se aumentó la expresión de E-cadherina, mientras que la expresión de N-cadherina y vimentina se redujo. Por último, hemos demostrado que S100A6 altera la expresión de marcadores relacionados con la EMT través de la activación β-catenina. En conclusión, S100A6 induce EMT y promueve la migración celular y la invasión de una manera β-catenina-dependiente. por lo tanto, S100A6 puede representar una diana terapéutica potencial novedoso para el tratamiento de cáncer de páncreas
Visto:. Chen X, Liu X, Lang H, Zhang S, Luo Y, Zhang J (2015) S100 Calcium-Binding Protein A6 promueve la transición epitelio-mesenquimal través de β-catenina en la línea celular de cáncer de páncreas. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10.1371 /journal.pone.0121319
Editor Académico: Yue Wang, Instituto Nacional para el Control de Enfermedades Virales y Prevención, CDC, China, china supplier
Recibido: Diciembre 10, 2014; Aceptado 30 de enero de 2015; Publicado: 23 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Cooperación básica y clínica de la Universidad de Medicina de capital No.13JL77 (República Popular china). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es un serio problema de salud global. Es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos, con una tasa de supervivencia relativa a 5 años, de 6% [1]. En China, la mediana de supervivencia de los pacientes PDAC es de 7,8 meses, con el 30,0% de los pacientes sometidos a operaciones de intención curativa, y sólo el 9,8% de los pacientes que reciben tratamiento integral [2]. A pesar de los avances en el tratamiento, PDAC sigue siendo extremadamente resistentes a la radioterapia y quimioterapia regímenes actualmente disponibles [3]. Un contribuyente al mal pronóstico es la limitada comprensión de la patogénesis del cáncer de páncreas. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para aclarar los mecanismos moleculares asociados con la incidencia, el desarrollo y la metástasis de esta enfermedad letal.
S100A6 pertenece a la familia S100, la expresión de que está conectado a la tumorigénesis y metástasis [4] . Logsdon et al. [5] utilizado microarrays para el perfil de expresión génica PDAC, la identificación de un total de 158 genes relacionados con el cáncer de páncreas, incluyendo S100A6. Nuestro grupo ha realizado previamente el análisis inmunohistoquímico de la expresión de S100A6 en tejidos pancreáticos, lo que confirma que la expresión de S100A6 es elevado en las muestras de PDAC, en relación a los tejidos normales [6]. Ohuchida y col. [7] mostró que la expresión de S100A6 se limita principalmente a los núcleos de las células de cáncer de páncreas, y los altos niveles de expresión de proteínas S100A6 nucleares están asociados con un mal pronóstico. El papel de S100A6 en relación con la formación de tumores y la metástasis es, sin embargo, poco conocida. Algunos estudios han demostrado que S100A6 está implicado en la regulación de la vía de señalización de Wnt /β-catenina [8], lo que conduce a la degradación de β-catenina.
/β-catenina destino celular influencias de señalización Wnt, proliferación, polaridad, y la muerte celular durante el desarrollo embrionario, así como la homeostasis del tejido en adultos [9]. por lo tanto, la regulación aberrante de esta vía se asocia con una variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer, la fibrosis y la neurodegeneración [10]. La vía Wnt está compuesto por el receptor de la proteína ligando de la superficie celular y wnt, además de los componentes citoplasmáticos y una nuclear específico transcripcional complejo [11]. Cuando la proteína ligando Wnt se une a, un receptor de superficie celular frizzled, se activa la ruta de Wnt. Citoplasmática β-catenina a continuación, entra en el núcleo de la célula, donde se modula la transcripción, lo que influye en la proliferación celular y la metástasis tumoral. En este proceso, β-catenina es la molécula efectora clave [12]. Una variedad de proteínas celulares, incluyendo Wnt, puede influir en la producción de β-catenina y la acumulación en el citoplasma. secuenciación de ARN de las células tumorales pancreáticas de circulación implica Wnt y β-catenina en la metástasis [13].
Hay una gran cantidad de investigaciones relativas a los atributos de las células tumorales circulantes que se relacionan con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT se refiere a la transdiferenciación de las células epiteliales en células mesenquimales en ciertas condiciones fisiológicas y patológicas, acompañado por la morfología celular y cambios de expresión génica [16]. EMT se produce en una variedad de procesos, tales como el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, algunas enfermedades crónicas, y la metástasis tumoral etapa temprana. Baja regulación de la E-cadherina, un marcador epitelial, es un sello distintivo de la EMT. La pérdida de E-cadherina está acompañada por la regulación al alza de los marcadores mesenquimales, tales como N-cadherina y vimentina. EMT es necesario para la mayoría de las metástasis tumorales, incluyendo PDAC [17]. La vía /β-catenina vía es una de las vías de señalización más importantes implicadas en la inducción de EMT.
En este informe, se investigó la función y el mecanismo asociado de S100A6 en relación a EMT inducción, mediante la evaluación de su influencia en Panc-1 migración celular y la invasión.
Materiales y Métodos
línea celular
la línea celular de cáncer pancreático humano, Panc-1, se adquirió de la American Type Culture Collection (ESTADOS UNIDOS). Las células se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (Invitrogen, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, Invitrogen, EE.UU.), 1% de penicilina y estreptomicina (Invitrogen, EE.UU.) a 37 ° C con 5% de CO
2.
los plásmidos y la interferencia de ARN
los ADN complementarios para S100A6 humana y el ADN control negativo se insertaron en un vector plásmido GV146 comprado a Genechem (Shanghai, china). Una secuencia shRNA orientación β-catenina (5'-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 ') y una secuencia de control negativo se sintetizaron y se ligó en el vector pRFP-C-RS (Origene Technologies, USA). Los plásmidos se amplificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de secuencia reveló después de la clonación del 100% de homología con las secuencias publicadas.
transfección transitoria y la creación de líneas celulares estables
El plásmido sobreexpresión de S100A6 y el plásmido de control se transfectaron en células Panc-1 utilizando óptima MEM medio de suero reducido (Invitrogen, EE.UU.) y Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
β-catenina shRNA y control shRNA fueron transfectadas en células Panc-1 como se ha indicado anteriormente. Después de la transfección transitoria, se seleccionaron las células Panc-1 utilizando 1,0 g /ml de puromicina, y se mantuvieron en medio de crecimiento suplementado con 1,0 mg /ml de puromicina. poblaciones clonales de células se aislaron mediante la transferencia de grupos individuales de células en pocillos individuales de una placa de seis pocillos. Las células fueron entonces mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2.
A continuación, S100A6 sobreexpresión y control plásmidos se transfectaron en β-catenina desmontables líneas celulares estables, como se ha indicado anteriormente.
Ensayo de curación de heridas
las células se sembraron en placas de seis pocillos y se transfectaron con el plásmido sobreexpresión o control S100A6, y β-catenina shRNA o control shRNA. Después de 36 h, el medio completo se sustituyó con DMEM FBS-libre, y después de otros 6 h, las monocapas de células fueron heridos con una punta de plástico estéril de 200 mL. Los cultivos se mantuvieron después en FBS-DMEM libre, y no se observaron y fotografiaron áreas de la herida usando un microscopio invertido a los 0, 24 y 48 h después de la herida. La anchura de la herida se midió usando el software Image J. tasa de cicatrización de la herida se evaluó de la siguiente manera:
se utilizaron
Transwell ensayo
Transwell cámaras (Corning, EE.UU.) con un poro de 8 micras para evaluar la migración en placas de 24 pocillos. Después de la transfección, un volumen de 200 l de células, a una densidad de 1 × 10
5 /ml en DMEM FBS-libre, se sembró en las cámaras superiores. Las cámaras inferiores se llenaron con DMEM que contenía FBS al 10% como factor estimulador. Las cámaras se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera, por 8 h. Las células fueron fijadas con 95% de etanol durante 20 min, teñido de violeta cristal durante 30 minutos, y se contaron usando un microscopio con un 40 × objetivo.
Para evaluar la invasión de células, BioCoat Matrigel (BD Biosciences) (300 g /ml, 100 l por cámara) se aplicó a las cámaras superiores de inserción 5 h antes de seguir el procedimiento para el ensayo de migración se ha descrito anteriormente.
cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total de Panc -1 células se aisló utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). El ARN total se utiliza como molde para sintetizar cDNA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). PCR en tiempo real se realizó con un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems, EE.UU.), con una mezcla de reacción que consiste en 5-l 2 × SYBR Green Master Mix, 1-l plantilla, 0,4-l cebador directo, 0.4- l cebador inverso y el agua de 3,2 l de ARN-libre. Las condiciones de ciclación fueron 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. niveles de expresión génica se normalizaron respecto a la de GAPDH. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. relativa niveles de mRNA fueron presentados como 2
-ΔΔCt [18]. Los cebadores utilizados se detallan en la Tabla 1.
Western Blot
Después se recogieron las células mediante transfección, tampón de lisis RIPA (Solarbio, Pekín, China), complementado con inhibidor de proteasa PMSF (Solarbio , Beijing, China). Las concentraciones de proteína de las muestras se determinaron utilizando un kit de cuantificación de proteínas (keygen Biotech, Nanjing, China). Las muestras (40 a 100 g) se sometieron luego a 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon durante 2 h en 5% de leche sin grasa seca. Las membranas se incubaron con anticuerpos específicos a 4 ° C durante la noche. Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados en este estudio: (Tecnologías de Señalización Celular 8480, EE.UU.) anti-β-catenina, anti-E cadherina (ab1416 Abcam, EE.UU.), anti-N cadherina (ab19348 Abcam, EE.UU.), anti-vimentina ( ab8069 Abcam, EE.UU.) y anti-β-actina (Tecnologías de Señalización celular 8457, EE.UU.). Las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes (Odyssey). Western blots se cuantificaron utilizando Odyssey Infrared Imaging. los niveles de expresión de la proteína se normalizaron respecto a la de β-actina.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron de forma independiente al menos tres veces. Los datos se presentan como medias ± SD (desviación estándar). Estudiante de
t-test
se utilizó para el análisis estadístico. Todos los datos fueron analizados utilizando el paquete de software estadístico SPSS 17.0 y las cifras se han generado utilizando el software GraphPad Prism 5. Para todas las pruebas, p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC in vitro
Para evaluar si S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC, Panc-1 células fueron transfectadas con un plásmido de sobreexpresión S100A6 o un plásmido de control. Real-time RT-PCR se utilizó para verificar que el plásmido sobreexpresión S100A6 aumentó los niveles de mRNA de S100A6 en células Panc-1. Hemos detectado un aumento significativo en el nivel de mRNA en células de S100A6 S100A6-overexpressing, en comparación con células de control (P & lt; 0,001) (. S1 Fig). A continuación, se analizó el efecto de la expresión S100A6 en la invasión de células in vitro. Un ensayo de cicatrización de heridas reveló un aumento significativo en la tasa de cicatrización de heridas en células S100A6-overexpressing, en comparación con las células de control, a las 24 y 48 h (p = 0,006 y p & lt; 0,001, respectivamente) (Fig. 1A y 1B). Un ensayo transwell también demostró aumento de la migración y la invasión en las células S100A6 (p = 0,04 para el ensayo de migración, p = 0,006 para el ensayo de invasión) (Fig. 1C y 1D) que sobreexpresa. Estos datos sugieren que S100A6 promueve la invasión de las células PDAC.
(A) El ensayo de cicatrización de heridas, las células que sobreexpresan S100A6 (izquierda), células de control (derecha). (B) La tasa de cicatrización de heridas fue significativamente mayor en las células que sobreexpresan S100A6, en comparación con las células de control, a las 24 y 48 h. (C) Transwell ensayo, "I" representa la sobreexpresión de S100A6 en el ensayo de migración; "II" representa el grupo de control en el ensayo de migración; "III" representa la sobreexpresión de S100A6 en el ensayo de invasión; "IV" representa el grupo de control en el ensayo de invasión. (D) Gráfico de estadística representativa para el ensayo transwell, mostrando un aumento significativo en la migración (I) y la invasión (II) por las células que sobreexpresan S100A6, en comparación con las células control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.
S100A6 altera la expresión de β-catenina y marcadores relacionados con la EMT en las células PDAC
Al investigar los posibles mediadores abajo de S100A6 responsables de la promoción de la migración celular y la invasión PDAC , hemos observado que la sobreexpresión de S100A6 resultó en un aumento significativo en los niveles de ARNm de β-catenina en células Panc-1 (p = 0,006) (Fig. 2A). Dado que EMT juega un papel importante en el proceso de invasión de metástasis, se procedió a evaluar la expresión de marcadores relacionados con la EMT. La expresión del marcador epitelial E-cadherina se redujo en el ARNm, mientras que la expresión de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina se incrementó (p & lt; 0,001, p = 0,002 y p & lt; 0,001, respectivamente) (Fig. 2B). También se examinaron los niveles de proteína de β-catenina y los marcadores de EMT utilizando transferencia Western, y confirmó que la sobreexpresión de S100A6 aumentó la expresión de β-catenina (p = 0,024) (Fig. 2C y 2D), disminución de la de E-cadherina , y el aumento de la expresión de N-cadherina y vimentina (p = 0,009, p = 0,026, p = 0,044, respectivamente) (Fig. 2E y 2F). En conjunto, estos resultados sugieren que S100A6 eleva los niveles de β-catenina y altera la expresión de marcadores relacionados con la EMT en las células PDAC
.
(A) La sobreexpresión de S100A6 resultó en un aumento significativo en el nivel de mRNA β-catenina en células Panc-1. (B) PCR en tiempo real reveló que S100A6 sobreexpresión resultó en disminución de la expresión de E-cadherina, y el aumento de expresión de N-cadherina y vimentina. (C) de Western Blot reveló que S100A6 upregulated β-catenina en el nivel de proteínas. (D) gráfico estadístico representativo que muestra el aumento de los niveles de proteína β-catenina, en comparación con el control. (E) transferencia de Western reveló que S100A6 sobreexpresión resultó en alteraciones en la expresión de los marcadores relacionados con la EMT. Específicamente, la expresión de proteínas de E-cadherina se redujo, mientras que se incrementó la expresión de N-cadherina y vimentina. (F) Los niveles de proteína relativos de E-cadherina, N-cadherina y vimentina fue significativamente diferente entre la condición S100A6 con sobreexpresión y el control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
β-catenina shRNA migración alterada y la invasión de las células in vitro PDAC
Para explorar el efecto de β-catenina en la migración y la invasión de las células PDAC, que utiliza β- catenina shRNA para generar una caída línea celular estable β-catenina Panc-1. células Panc-1 transfectadas con no objetivo shRNA se utilizaron como control. Desmontables de β-catenina fue confirmada por PCR en tiempo real y Western Blot (p & lt; 0,001 yp = 0,001, respectivamente) (. S2 figura). Un ensayo de ensayo y transwell de cicatrización de heridas se llevaron a cabo para evaluar el efecto de la β-catenina en la migración y la invasión. El ensayo de cicatrización de heridas demostró que desmontables de β-catenina inhibe de manera significativa la migración de las células PDAC en comparación con la condición de control en ambos 24 y 48 h (p = 0,013 y p = 0,002, respectivamente) (Fig. 3A y 3B). El ensayo transwell revelado disminuyó migración y la invasión en las células desmontables β-catenina, en comparación con el control (p = 0,009 para el ensayo de migración, p = 0,015 para el ensayo de invasión) (Fig. 3C y 3D). Estos datos indican que la inhibición de la β-catenina reduce la migración y la invasión de las células in vitro PDAC
.
(A) El ensayo de cicatrización de heridas reveló una disminución significativa de la migración en el grupo de shRNA β-catenina (izquierda) , en relación con el grupo de control (derecha). (B) La tasa de cicatrización de heridas fue significativamente menor en las células S100A6 que expresan, en comparación con el control, a las 24 y 48 h. (C) El ensayo transwell demostró que β-catenina shRNA se redujo drásticamente el número de la migración de las células y (× 40) invasor. "I" representa β-catenina shRNA en el ensayo de migración; "II" representa el grupo de control en el ensayo de migración; "III" representa β-catenina shRNA en el ensayo de invasión; "IV" representa el grupo de control en el ensayo de invasión. (D) Gráfico de estadística representativa para el ensayo transwell, que muestra una disminución significativa de la migración (I) y la invasión (II) en el grupo shRNA β-catenina, en comparación con el grupo control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.
β-catenina shRNA altera la expresión de marcadores relacionados con la EMT en células in vitro PDAC
Para evaluar si la β-catenina está implicada en la EMT, se evaluó la expresión de marcadores relacionados con la EMT en el mRNA y los niveles de proteína en células Panc-1 β-catenina-desmontables. Desmontables de β-catenina resultó en aumento de los niveles de E-cadherina mRNA, y la disminución de los niveles de N-cadherina y ARNm de vimentina (p = 0,002, p & lt; 0,001 y p & lt; 0,001, respectivamente) (Fig. 4A). resultados de transferencia Western respecto a la expresión de proteínas fueron consistentes con el tiempo real de datos de RT-PCR. Específicamente, se aumentó la expresión de proteínas de E-cadherina, mientras que la expresión de N-cadherina y vimentina se redujo (p = 0,004, p = 0,007 y p = 0,017, respectivamente), en células Panc-1 β-catenina-desmontables (Fig . 4B y 4C). Estos datos sugieren que el nivel de expresión β-catenina se correlaciona con la expresión de marcadores relacionados con la EMT en las células PDAC.
(A) β-catenina shRNA resultó en un aumento significativo en los niveles de E-cadherina mRNA, y una disminución significativa en los niveles de N-cadherina y vimentina mRNA. (B) transferencia de Western reveló que β-catenina shRNA resultó en la expresión de proteínas upregulated de E-cadherina y downregulated expresión de la proteína de N-cadherina y vimentina. (C) Los niveles de proteína de E-cadherina, N-cadherina y vimentina fueron significativamente diferentes entre el grupo shRNA β-catenina y el grupo control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC a través de la activación de β-catenina in vitro
Para explorar si S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC través de la regulación de β-catenina, que transfectadas Panc-1 células estables β-catenina-caída con un plásmido sobreexpresión de S100A6. Se evaluó la expresión de β-catenina usando en tiempo real RT-PCR y análisis de Western blot. No hubo diferencias significativas en el ARNm y los niveles de proteína entre los dos grupos (p = 0,354 y p = 0,765, respectivamente) (S3 Fig.). Estos resultados sugieren que la β-catenina fue hecho de manera estable derribado, y que su expresión no fue influenciado por S100A6 sobreexpresión. A continuación, se realizaron ensayos de curación de heridas y transwell para evaluar la migración y la invasión de estas células. El ensayo de cicatrización de heridas demostró que la migración no fue significativamente diferente entre los dos grupos, a los 24 o 48 h (p = 0,983 y p = 0,875, respectivamente) (Fig. 5A y 5B). Los resultados del ensayo transwell fueron consistentes con el ensayo de curación de heridas, sin diferencia significativa entre los grupos, ya sea para la migración o invasión (p = 0,803 para el ensayo de migración, p = 0,659 para el ensayo de invasión) (Fig. 5C y 5D ). Estos datos indican que S100A6 no tiene ningún efecto sobre la migración y la invasión de las células β-catenina PDAC-desmontables estables. Esto sugiere que S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC través de la activación β-catenina in vitro
.
(A) El ensayo de cicatrización de heridas no reveló cambios en la migración de células β-catenina-shRNA sobreexpresan S100A6 (izquierda) en comparación con el grupo de β-catenina shRNA control (derecha). (B) No hubo diferencia significativa en la tasa de cicatrización de heridas entre los dos grupos. (C) No hubo diferencia significativa en los resultados del ensayo transwell entre los dos grupos, con respecto tanto a la migración y la invasión (× 40). "I" representa β-catenina-shRNA + S100A6 sobreexpresión en el ensayo de migración; "II" representa-catenina-β + shRNA S100A6-control en el ensayo de migración; "III" representa β-catenina-shRNA + S100A6 sobreexpresión en el ensayo de invasión; "IV" representa β-catenina-shRNA + S100A6-control en el ensayo de invasión. (D) cuadro estadístico Representante de la transwell ensayo, que no muestran diferencias significativas en la migración (I) o invasión (II) ensayos entre los dos grupos.
S100A6 promueve la EMT a través de la activación de β-catenina
para investigar la posible relación mecanicista entre S100A6 y β-catenina en relación con la EMT en el cáncer de páncreas, las células transfectadas estables β-catenina-desmontables Panc-1 con un plásmido sobreexpresión de S100A6 o un plásmido de control, y se evalúa la expresión de marcadores relacionados con la EMT. Real-time RT-PCR no demostró diferencias significativas en los niveles de mRNA de la E-cadherina, N-cadherina y vimentina entre los dos grupos (p = 0,227, p = 0,228, y P = 0,067, respectivamente) (Fig. 6A). Se confirmó que los niveles de proteína de E-cadherina, N-cadherina y vimentina tampoco difirieron entre los dos grupos (p = 0,267, p = 0,638, p = 0,940 y, respectivamente) (Fig. 6B y 6C). Estos resultados sugieren que S100A6 no tiene ningún efecto en los marcadores relacionados con la EMT en las células PDAC β-catenina-knockdown estables, lo que indica que S100A6 altera la expresión de los marcadores relacionados con la EMT través de la activación de β-catenina.
(A) No hubo diferencias significativas en la expresión de los marcadores relacionados con la EMT entre las células β-catenina-shRNA sobreexpresan S100A6 y control de las células β-catenina-shRNA. (B) transferencia de Western reveló cambios similares en la expresión de marcadores relacionados con la EMT en los dos grupos. Se observaron (C) No hubo diferencias significativas entre los dos grupos con respecto a la expresión de E-cadherina, N-cadherina y proteína vimentina.
Discusión
En este estudio, se demostró que la sobreexpresión de S100A6 promueve, y β-catenina shRNA inhibe, la migración celular y la invasión PDAC. Establecimos que S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC a través de la activación de β-catenina in vitro. También confirmó que la expresión de S100A6 se correlaciona con la de β-catenina y que la expresión de los marcadores relacionados con la EMT en las células PDAC es modificado por tanto S100A6 sobreexpresión y β-catenina caída.
Se ha informado de S100A6 ser upregulated en un número de cánceres, incluyendo cáncer de pulmón, colorrectal, de piel, gástrico, adenocarcinoma ductal pancreático y otros cánceres epiteliales [19]. Se ha informado de que el aumento de expresión de S100A6 puede promover la proliferación y migración celular en el carcinoma hepatocelular humano [20]. Por otra parte, los niveles séricos de S100A6 pueden servir como un potencial biomarcador de pronóstico en el cáncer gástrico, y la inhibición de S100A6 disminuye el potencial metastásico de células de cáncer gástrico [21]. En la carcinogénesis pancreática, los ensayos de inmunohistoquímica se han utilizado para demostrar que las células PanIN 1a no expresan S100A6, y que la proporción de células teñidas positivamente se incrementa proporcionalmente con el grado PanIN, con niveles de ARNm de S100A6 también aumentar de una manera escalonada [22,23] .
una amplia gama de modelos experimentales sugieren la presencia de un importante papel de β-catenina en la metástasis del cáncer de páncreas [24]. Nowotny et al. [25,26] sugerido que S100A6 podría tener un efecto sobre la proteína de unión calcyclin-(CacyBP) /Siah-1 interacción de proteínas (SIP) y supresor de alelo G2 de Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP fue identificado como una proteína de unión S100A6-que está implicado en la ubiquitinación y la degradación de β-catenina [27]. La secuencia de Sgt1 comparte identidad 20% con la de CacyBP /SIP. Por otra parte, Sgt1 y CacyBP /SIP se encontraron para unirse y activar Skp1-Cullin-F-box proteína Skp1p (SCF) de la ubiquitina ligasa. Esta ligasa se describe en células de mamíferos como un complejo que regula la ubiquitinación y la degradación de fosforilados β-catenina [28]. Otro estudio [29] confirmó que CacyBP /SIP no se detecta en tejidos pancreáticos normales, pero se detecta en cáncer de páncreas. Por lo tanto, se especula que S100A6 afecta a la degradación de β-catenina vía Cacy BP /SIP y Sgt1 en PDAC. En este estudio, S100A6 indujo la expresión β-catenina en los niveles de ARNm y proteínas. Por otra parte, tanto un ensayo de cicatrización de heridas y un transwell ensayo demostraron que la sobreexpresión de S100A6 promueve la migración celular y la invasión PDAC.
En numerosos modelos, incluidas las líneas de células epiteliales y carcinoma de mama, se cree que la vía /β-catenina vía para inducir la EMT. β-catenina es por lo general obligados a E-cadherina, que es importante para las conexiones de célula-célula y el citoesqueleto de cadherina. Además, el transporte β-catenina en el núcleo puede promover la expresión de genes relacionados EMT [30]. Algunos estudios [31-34] han confirmado que ciertos factores pueden controlar plasticidad epitelial y alterar la metástasis a través de la regulación β-catenina-dependiente en PDAC, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular y cáncer de mama. Nuestro estudio también demostró que desmontables β-catenina puede inducir la regulación al alza de E-cadherina y regulación a la baja de N-cadherina y vimentina.
Un estudio reciente informó que S100A4, un miembro de la familia S100, podría ser un factor clave en la promoción del proceso de EMT en PDAC [35]. En este estudio, hemos explorado las relaciones entre S100A6, β-catenina, EMT y la invasión de células PDAC. Se confirmó que S100A6 podría inducir EMT de manera β-catenina que dependen, al demostrar que S100A6 puede promover la migración celular y la invasión a través de β-catenina in vitro. El papel exacto de la familia S100 y proteínas relacionadas con respecto al cáncer de páncreas es un tema importante que merece más estudio.
Conclusión
S100A6 puede inducir EMT y promover la migración celular y la invasión en un β catenina forma dependiente. Por lo tanto, S100A6 podría representar una nueva diana terapéutica potencial para el PDAC.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Transfección con la sobreexpresión S100A6 resultó en un aumento significativo en el nivel de mRNA S100A6
*** p & lt.; 0,001
doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. β-catenina éxito fue derribado en células PDAC.
(A) Real-time RT-PCR reveló una disminución significativa en el nivel de ARNm de β-catenina en las células β shRNA-catenina Panc-1. (B) transferencia de Western reveló una disminución significativa de la proteína β-catenina en el grupo de shRNA β-catenina, en relación con el control. (C) El nivel de proteína β-catenina fue significativamente diferente entre los dos grupos. ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001
doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. β-catenina expresión no se reguló por S100A6 en las células estables β-catenina-caída.
(A) No hubo diferencias significativas en los niveles de ARNm de β-catenina entre las células β-catenina-desmontables estables que sobreexpresan S100A6 y estable ß-catenina desmontables células que expresan el plásmido de control. (B) transferencia de Western reveló cambios similares en β-catenina entre los dos grupos. (C) No hubo diferencias significativas entre los niveles de la proteína β-catenina entre los dos grupos. Francia El Inglés en el presente documento ha sido revisado por al menos dos editores profesionales, ambos hablantes nativos de Inglés. Para un certificado, por favor see:http://www.textcheck.com/certificate/GZTsUk
doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003
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