Extracto
Antecedentes
SIRT1 (SIRT1) actúa como un regulador clave de la homeostasis vascular endotelial, la angiogénesis y la disfunción endotelial. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo subyacente para la angiogénesis carcinoma de pulmón de SIRT1 mediada. Aquí, nos informan que la nicotinamida adenina dinucleótido 1 (nad1) -dependiente deacetilasa SIRT1 puede funcionar como un modulador negativo intrínseco de Delta-como ligando 4 (DLL4) /señalización Notch en el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) de células endoteliales vasculares de xenoinjertos derivados ( cáncer de pulmón derivado de EC).
Principales conclusiones
SIRT1 regula negativamente dominio intracelular Notch 1 (N1IC) y Notch1 genes diana HEY1 y hey2 en respuesta a ligando 4 (estimulación Delta-como DLL4). Además, SIRT1 desacetilado y reprime la expresión N1IC. Quantitative inmunoprecipitación de la cromatina (qChIP) análisis y gen reportero ensayo demostró que SIRT1 ligado a una región altamente conservada, que se encuentra aproximadamente a -500 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional de Notch1, y reprime la transcripción Notch1. La inhibición del crecimiento de células endoteliales y la angiogénesis que brota por la señalización /Notch DLL4 se mejoró en el caso CE derivada de cáncer de pulmón SIRT1 silenciada y rescatados por DAPT inhibidor de Notch. In vivo, un aumento en la actividad proangiogénico se observó en Matrigel se conecta de SIRT1-endotelial específico ronda en ratones. SIRT1 también se ha mejorado la neovascularización tumoral y el crecimiento de tumores de xenoinjertos LLC.
Conclusiones
Nuestros resultados muestran que la SIRT1 facilita la ramificación de las células endoteliales y la proliferación de aumentar la densidad de vasos y promover el crecimiento del tumor pulmonar a través de la baja regulación de DLL4 de señalización /Notch y desacetilación de N1IC. Por lo tanto, centrarse en la actividad de SIRT1 o /y la expresión génica puede representar un nuevo mecanismo en el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Xie M, Liu M, A C-S (2012) SIRT1 Regula endotelial señalización Notch en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (9): e45331. doi: 10.1371 /journal.pone.0045331
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 24 Agosto, 2011; Aceptado 21 de agosto de 2012; Publicado: 18 Septiembre 2012
Copyright: © Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Científica de la Investigación médica de la provincia de Guangdong, china (número A2009265) Ciencia y Tecnología Proyecto de Planificación de la provincia de Guangdong, china (número 83050) y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) -dependiente deacetilasa Sir2 regula esperanza de vida en múltiples organismos en respuesta a la restricción calórica [1]. homólogos de mamíferos de Sir2 comprenden una familia de siete proteínas, que se conocen como las sirtuinas (la clase III histona desacetilasas (HDAC) SIRT1-SIRT7), y se han caracterizado como reguladores clave de varios procesos fisiológicos importantes asociadas con el metabolismo y la resistencia al estrés [ ,,,0],2].
estudios recientes han sugerido que la SIRT1 es un importante mediador de la homeostasis del endotelio vascular, contribuyendo específicamente a la angiogénesis, el tono vascular, y las funciones endoteliales [3]. Notablemente, SIRT1 es altamente expresado en la vasculatura durante el crecimiento de los vasos sanguíneos, donde se controla la actividad angiogénica de las células endoteliales. Además, la pérdida de los resultados de SIRT1 en la baja regulación de genes relacionados con el desarrollo de los vasos sanguíneos y la remodelación vascular, que conduce a la inhibición de la germinación de la angiogénesis y la morfogénesis de ramificación de las células endoteliales [4].
La vía de Notch regula numerosas decisiones del destino celular /linaje de organismos multicelulares durante la embriogénesis normal y el desarrollo postnatal [5]. Tras la unión del ligando de Notch a su receptor cognado, una cascada de escisión proteolítica se inicia en el dominio intramembrane del receptor. La etapa de escisión final es catalizada por el complejo de proteínas γ-secretasa y conduce a la liberación del dominio intracelular Notch activa. Este fragmento de proteína se transloca en el núcleo y funciona como un cofactor para regular la transcripción de genes diana Notch [6]. Además de los receptores Notch1 y Notch4, las células endoteliales vasculares también expresan Jagged 1, Delta-como ligando 1 (DLL1), y el endotelial DLL4 específico de la célula [7]. Zhang et al. informó de que la inactivación de un solo alelo de DLL4 llevó a letalidad embrionaria, lo que sugiere que la señalización de DLL4 /Notch es esencial para el desarrollo vascular. expresión DLL4 se limita en gran medida al endotelio de los vasos en desarrollo y las células de la punta de desarrollar arterias, donde funciona para regular el número de células de la punta para el control de la germinación recipiente y la ramificación [8].
Numerosos estudios han sugerido que alteraciones en la actividad Notch pueden tener profundos efectos sobre el comportamiento endotelial y formación de vasos sanguíneos. Sin embargo, poco se sabe acerca de la regulación y la adaptación de las respuestas Notch endoteliales en la angiogénesis del cáncer de pulmón. En el estudio actual, se aislaron células endoteliales vasculares de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) xenoinjertos subcutáneos en SIRT1 específico de células endoteliales ronda en ratones C57BL /6J. Nuestros resultados muestran que las células endoteliales que carecen de actividad de SIRT1 se sensibilizan a Notch de señalización, lo que resulta en la expresión del gen diana de Notch mejorada y deterioro de alargamiento del brote en respuesta a la estimulación DLL4. Nuestros datos apoyan la hipótesis de que la señalización Notch se regula dinámicamente por acetilación y sugieren que la SIRT1 actúa como un reóstato para afinar las respuestas Notch endotelial.
Resultados
El aislamiento de vascular derivado de xenoinjerto cáncer de pulmón células endoteliales (cáncer de pulmón-derivado ECs)
pulmón ECs derivados del cáncer se aislaron de LLC xenoinjertos subcutáneos en SIRT1 específico de células endoteliales ronda en ratones C57BL /6J [9] (Fig. 1A). Como se muestra en la Fig. 1B, los EC derivado de cáncer de pulmón demostró la morfología típica de adoquines y expresa CD31, un fabricante de células endoteliales maduras. Por otra parte, estos EC expresó altos niveles de sintasa EC-específica del óxido nítrico endotelial (eNOS), pero no la E-cadherina (Fig. 1C). Estos datos sugieren que la LLC xenogaft se enriquece de manera eficiente en el cáncer de pulmón derivado de ECs. Estas células se utilizaron para los experimentos posteriores in vitro.
LLC xenoinjertos se resecaron a partir de ratones inyectados por vía subcutánea en el flanco dorsal con células de LLC (3 × 10
6 en suspensión en 50 l de PBS) durante 30 días . Después de eliminar los tejidos necróticos obvias o composiciones grasos adicionales, los tejidos picados se molieron en hielo usando un molinillo de vidrio y después se filtraron a través de filtros de células para eliminar los restos de tejido. (A) Los ECs derivados del cáncer de pulmón que expresan CD31 se aislaron de la suspensión de una sola célula mediante clasificación inmunomagnética, como se evidencia por microscopía de barrido, y se cultivaron in vitro. (B) CD31 se detectó en los EC derivados del cáncer de pulmón aislado utilizando inmunofluorescencia. tinción de anticuerpos CD31 de las membranas de la CE derivados del cáncer de pulmón se muestra en rojo, y la tinción DAPI nuclear se muestra en azul. (C) proteína total fue aislado de ECs derivada de cáncer de pulmón enriquecido, las células bEnd.3 (control positivo), y células MLE-12 (control negativo). Western blot se realizó utilizando anticuerpos contra la eNOS y E-cadherina y β-actina se utilizó como control interno.
Efecto de la hipoxia sobre la expresión de SIRT1 en el cáncer de pulmón derivado de EC
expresión SIRT1 se evaluó en el ECs derivada de cáncer de pulmón, y como se muestra en la Fig. S2A, SIRT1 fue altamente expresado en estas células. Debido a que la hipoxia es una característica de la mayoría de los tumores, se examinó la expresión de SIRT1 bajo diferentes condiciones de hipoxia en estas células utilizando análisis de Western blot. Nuestros resultados indican que los niveles de proteína SIRT1 se aumentaron de una manera dependiente del tiempo y alcanzó el máximo a 8 h después de la exposición el ECs derivada de cáncer de pulmón a la hipoxia (Fig. 2A). Para determinar si estos cambios en los niveles de proteína SIRT1 durante la hipoxia se debían a cambios en la transcripción de genes SIRT1, que mide los niveles de ARNm utilizando SIRT1 en tiempo real RT-PCR. Nuestros datos revelaron los resultados similares a los observados en la expresión de la proteína SIRT1 (Fig. 2B). Estos resultados demostraron el efecto de la hipoxia sobre la expresión de SIRT1 en ECs derivada de cáncer de pulmón
.
(A) Western blot de SIRT1 en ECs derivados del cáncer de pulmón expuestas a la hipoxia (2% de O
2) para el tiempo indicado utilizando un anticuerpo contra la SIRT1. (B) los niveles de ARNm de SIRT1, tal como se mide por tiempo real de RT-PCR, de ARN total obtenido de las CE derivados del cáncer de pulmón expuestas a la hipoxia (2% de O
2) para el período de tiempo indicado. Los datos representan la media de tres experimentos independientes de cada punto de tiempo realizado por triplicado. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
SIRT1 regula negativamente N1IC por desacetilación y Controles Los genes Notch objetivo en derivados de cáncer de pulmón ECs
A translocación al núcleo, el intracelular dominio de Notch1 (N1IC) interactúa con la proteína de unión a ADN CSL (llamado así por CBF1 en mamíferos, Su (H) en Drosophila, y Lag-1 en Caenorhabditis elegans), que resulta en la activación transcripcional de genes objetivos Notch1. Debido N1IC sufre una rápida degradación mediada por ubiquitina y la acetilación puede perjudicar ubiquitinación [10], se examinó el efecto de SIRT1 sobre la expresión de N1IC y encontramos que la inactivación de SIRT1 condujo a un aumento de expresión de la proteína N1IC en respuesta a la estimulación DLL4 (Fig. 3A). En conjunto, estos resultados indicaron que la SIRT1 regula negativamente la señalización Notch en células endoteliales cuando se activan las señales de DLL4 /Notch1.
(A) ECs derivados del cáncer de pulmón fueron transfectadas con siRNAs de control o SIRT1 durante 48 h y se cultivaron en la ausencia o presencia de DLL4 para una 6 h adicionales. A continuación, se detectó la expresión de proteínas N1IC usando análisis de transferencia Western. bloqueo de siRNA mediada por la actividad de SIRT1 en las células endoteliales aumenta los niveles endógenos de proteína N1IC. ECs derivados del cáncer (B) de pulmón fueron transfectadas con HA-N1IC, pcDNA-SIRT1, H363Y pcDNA-SIRT1, o pcDNA3 (4 g /l de cada uno) para 48 h y luego se trataron con o sin 5 NAM nM para un adicional de 12 marido. Después, los extractos celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA y se sometieron a análisis de transferencia Western con una lisina anti-acetilo (panel superior) o anticuerpo anti-HA (panel inferior). ECs de cáncer derivado de (C) de pulmón se Triple transfectadas con N1IC, la p300 acetiltransferasa, y cantidades crecientes de SIRT1, y las células se lisaron 48 h más tarde. niveles comparables de N1IC se inmunoprecipitaron y se transfirieron para los residuos de lisina acetilados (IP: HA y IB: anti-acetilo; panel superior). La transferencia se volvió a sondear para HA, lo que demuestra niveles aproximadamente iguales de HA-N1IC (IP: HA y IB: HA; panel inferior). derivada de cáncer (D) de pulmón ECs fueron transfectadas con N1IC, la p300 acetiltransferasa, y cantidades crecientes de SIRT1 junto con el indicador de luciferasa de Renilla y el plásmido pGL3-CBF que contiene un gen reportero de luciferasa de luciérnaga para 24 h. A continuación, se midió la actividad luciferasa utilizando un ensayo reportero de luciferasa dual. Los datos se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla (media ± SD, n = 3). análisis (E) qChIP de ocupación SIRT1 en la región promotora proximal Notch1 en ECs derivada de cáncer de pulmón. SIRT1 ocupaba una región específica a -500 pb del locus Notch 1. SIRT1 se inmunoprecipitó (IP) con sueros anti-SIRT1 (SIRT1 IgG) o suero preinmune (IgG normal, utilizado como control) (media ± SEM; n = 3). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. reportero resultados de los análisis de genes (F) de la luciferasa. pGL3, pGL3-Notch1 -500-400 (N + 400), o pGL3-Notch1 + 400-1750 (N + 1 750) se transfectaron en células HEK293 con o sin SIRT1. * P & lt; 0,05. Las barras de error representan el SEM. (G) Expresión de los genes diana de Notch HEY1 y hey2 se evaluaron en el control siRNA- y derivados del cáncer de pulmón transfectadas con siRNA SIRT1 ECs, que fueron transfectadas posteriormente con el vector vacío o N1IC para un máximo de 48 h. células endoteliales deficientes en SIRT1 muestran un marcado aumento de la actividad y HEY1 hey2 en respuesta a la sobreexpresión N1IC. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. ECs derivados del cáncer (H) de pulmón fueron transfectadas con siRNAs de control o SIRT1 y se trataron con DMSO o NAM 20 mM durante 24 h, seguido de incubación con Matrigel para un 5 h adicional. A continuación, la formación del tubo se evaluó usando un microscopio de fase invertida. Los gráficos de barras que representan los resultados de densitometría. * P & lt; 0,05 en comparación con el control
A continuación se probó si la SIRT1 regula negativamente N1IC a través de desacetilación.. En pocas palabras, las diferentes versiones de N1IC marcada con HA (HA-N1IC) se expresaron en ECs derivados del cáncer de pulmón con vectores que codifican cualquiera de SIRT1 o un mutante que carece de actividad de SIRT1 deacetilasa (SIRT1 H363Y). Los extractos celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-HA y se detectan con una inmunotransferencia usando un anticuerpo contra acetil-lisina. Nuestros resultados demuestran que la expresión de HA-acetilado N1IC se redujo significativamente en las células que expresan SIRT1 completo, en comparación con los niveles de proteína en células que expresan SIRT1 H363Y (Fig. 3B). Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con NAM 5 nm, la inhibición de SIRT1 mediada de N1IC acetilación estaba aliviado. Además, la transfección de pulmón derivados del cáncer ECs con N1IC, la p300 acetiltransferasa, y cantidades crecientes de SIRT1 reveló que p300 era capaz de acetilar N1IC (Fig. 3C) y la mejora de la actividad transcripcional N1IC (Fig. 3D). Sin embargo, la adición de SIRT1 abolió la forma acetilada de N1IC y la actividad N1IC disminuido significativamente inducida por p300. Estos resultados sugieren que la actividad de SIRT1 desacetilasas reduce la abundancia de N1IC acetilado. Por otra parte, la activación de SIRT1 por SRT1720 o SRT2183 (activadores de la NAD
+ - deacetilasa dependiente) reduce los niveles de proteína N1IC endógenos (Fig. S1A), y el bloqueo de la actividad deacetilasa de SIRT1 con la nicotinamida inhibidor sirtuinas (NAM) aumentó endógena N1IC niveles en las células endoteliales (Fig. S1B).
para definir el mecanismo por el que la SIRT1 reprime la expresión N1IC, hemos examinado el reclutamiento de SIRT1 con el locus Notch 1 en respuesta a la estimulación DLL4 usando análisis qChIP. Es de destacar que, se piensa que el locus Notch 1 para contener más de 20 regiones muy conservadas [11]. Nuestros datos indicaron que SIRT1 ligado a una región altamente conservada, que se encuentra aproximadamente a -500 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional de Notch1 (Fig. 3E). Este hallazgo sugiere que SIRT1 puede controlar directamente la expresión de Notch1 través de la unión a la región promotora proximal de Notch1. Para determinar la consecuencia funcional de SIRT1 unión al locus Notch1, construcciones de reportero de luciferasa que contienen gen indicador Notch1 se transfectaron en células HEK293. Estos resultados demostraron que SIRT1 inhibió significativamente la actividad de reportero Notch1 cuando el sitio de unión de SIRT1 estaba presente (Fig. 3F, N + 400), que no se observó cuando el sitio de unión SIRT1 estaba ausente (Fig. 3F, N + 1 750). Esto confirma aún más nuestra observación de que SIRT1 reprime la transcripción Notch1 través de la unión al promotor Notch1.
HEY1 y hey2 son objetivo directo los genes de la vía de señalización Notch durante el desarrollo vascular [12]. Para investigar más a fondo el efecto de SIRT1 en HEY expresión, la expresión de SIRT1 fue silenciado en ECs derivados del cáncer de pulmón de siRNA, y la expresión de HEY1 y se determinó hey2. En particular, derivada de cáncer de pulmón deficientes en SIRT1 EC sobreexpresan N1IC muestra un nivel notablemente mejorada de HEY1 y la actividad hey2 (Fig. 3G). De manera similar, el silenciamiento de SIRT1 mejora de forma significativa HEY1 y expresión hey2 en el cáncer de pulmón derivados de ECs en respuesta a la estimulación DLL4, mientras que no se observaron cambios en ECs derivada de cáncer de pulmón no estimulada (Fig. S1C). Este resultado indica que la regulación de los genes diana SIRT1 Notch era dependiente de la estimulación DLL4. Además, la capacidad de respuesta Notch mejorado para DLL4 del ECs derivada de cáncer de pulmón SIRT1 deficientes fue abrogada por la adición del inhibidor de DAPT γ-secretasa (Fig. S1C). Por el contrario, la activación de SIRT1 señalización a través de la utilización de las pequeñas moléculas SRT1720 o SRT2183 inhibe la inducción mediada por DLL4 de HEY1 y expresión hey2, lo que indica que SIRT1 modula negativamente DLL4 /Notch1 señalización en ECs derivada de cáncer de pulmón (Fig. S1D).
SIRT1 regula la actividad angiogénica del derivado de cáncer de pulmón EC
la inhibición del crecimiento celular endotelial por la señalización /Notch DLL4 se mejoró en ECs derivados del cáncer de pulmón en SIRT1 silenciada y fue rescatado por el inhibidor de Notch DAPT (Fig. S2A). En la última etapa de la angiogénesis, las células endoteliales se autoensamblan en tubos para formar nuevos vasos sanguíneos [13]. A continuación, investigaron los efectos de SIRT1 sobre la neovascularización mediante el examen de la formación del tubo. Como se muestra en la Fig. 3H, formación tubular se inhibió significativamente en ECs derivada de cáncer de pulmón SIRT1 silenciada. Del mismo modo, la formación de tubos en ECs derivada de cáncer de pulmón también fue reprimido cuando las células fueron tratadas con el inhibidor de NAM SIRT1 deacetilasa. Para confirmar esta regulación SIRT-mediada de la función celular endotelial, tridimensionales ensayos de angiogénesis in vitro se realizaron con esferoides endoteliales de gel de colágeno incrustado que habían sido transfectadas con el control o SIRT1 siRNAs. Como se muestra en la Fig. S2B, las longitudes de brotes acumulativos de esferoides en ECs derivados del cáncer de pulmón transfectadas con siRNA SIRT1 fueron significativamente más corta que en las células control transfectadas. Por otra parte, el tratamiento con DAPT abrogó la inhibición de la respuesta angiogénica a ECs derivados del cáncer de pulmón inducidos a través de silenciamiento SIRT1, lo que sugiere que SIRT1 es un importante modulador de la función angiogénica endotelial.
Efecto de SIRT1 sobre la neovascularización tumoral en xenoinjertos LLC
Para investigar el papel de SIRT1 en la vascularización in vivo, se realizó un ensayo de tapón de Matrigel. En contraste con los tapones en el control de ratones C57BL /6J, los enchufes en SIRT1 ronda en ratones transgénicos muestran una coloración rojo brillante, lo que indica que SIRT1 había inducido nueva formación de vasos sanguíneos. El nivel de hemoglobina, que es indicativo de la extensión de la angiogénesis, fue mayor en el Matrigel se conecta a partir de ratones SIRT1 transgénico que los de control de ratones C57BL /6J (Fig. 4A). Para investigar el efecto del gen SIRT1 en la vascularización del tumor y el crecimiento del tumor, se inyectaron células LLC subcutáneamente en SIRT1, SIRT1 H363Y, y ratones C57BL /6J de tipo silvestre. Estos resultados indicaron que el volumen del tumor LLC en el SIRT1 ronda en ratones transgénicos era 115% de la observada en los ratones de control 30 días después de la implantación de células tumorales. Por el contrario, el crecimiento tumoral en los ratones transgénicos SIRT1 H363Y se redujo y fue similar a la observada en los ratones de tipo salvaje. Además, en los ratones transgénicos SIRT1, el crecimiento tumoral se redujo cuando la actividad deacetilasa de SIRT1 se bloqueó con la administración de la clase III inhibidor de HDAC nicotinamida (Fig. 4B). Tras la evaluación del índice de densidad de los microvasos por tinción de anticuerpos CD31, la mejora el crecimiento del tumor observada en el SIRT1 ronda en ratones transgénicos se asoció con un aumento en la vascularización del tumor. Además, el tratamiento anti-Dll4 reveló que el crecimiento del tumor reducida se asocia con una aparente disminución en la densidad vascular del tumor (Fig. 4C).
(A) SIRT1 promueve la angiogénesis in vivo. tapones de Matrigel se inyectaron por vía subcutánea en el abdomen de control o ratones SIRT1 transgénico, y los tapones se extrajeron 7 días más tarde para determinar el grado de vascularización. La cantidad de hemoglobina presente en los tapones se cuantificó como un indicador de la formación de vasos sanguíneos funcionales (media ± SD, n = 10 para cada grupo). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. (B) Los cambios en los volúmenes tumorales medios medidos en los ratones de tipo salvaje (control) C57BL /6J, SIRT1, o SIRT1 (H363Y) después de la inoculación con células LLC para el período de tiempo indicado. * P & lt; 0,05 en comparación con los ratones SIRT1. (C) Las fotomicrografías de la tinción IHC de CD31 en secciones de xenoinjertos de LLC (aumento, x 200) de tipo salvaje, SIRT1 o ratones SIRT1 (H363Y). Cuando los volúmenes de los tumores de xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron asignados aleatoriamente al brazo de control (n = 8) o el brazo experimental (anticuerpo monoclonal DLL4; n = 10). Los campos de gran aumento (x400) se analizaron para el recuento de la densidad de microvasos utilizando el software ImageJ (media ± SD, n = 10 para cada grupo). * P & lt; 0,05 en comparación con los ratones SIRT1. Los volúmenes promedio de tumor en los de tipo salvaje, la SIRT1 y los ratones SIRT1 (H363Y) se midieron a las 4 semanas después del tratamiento. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
Discusión
Este estudio se expande el papel de SIRT1 para incluir la modulación específica de la actividad angiogénica en células endoteliales. Para examinar el efecto de SIRT1 sobre la angiogénesis del cáncer de pulmón, establecimos modelos de xenoinjerto LLC con SIRT1 endotelial específico de la célula y la expresión H363Y SIRT1 en ratones transgénicos. Las células endoteliales se aislaron con éxito de los xenoinjertos LLC de SIRT1 ratones transgénicos utilizando perlas magnéticas CD31 conjugado, así como una serie de pasos para eliminar todas las células y leucocitos tumorales contaminantes. El bloqueo de la función de SIRT1 suprimió la formación de tubo endotelial y la formación de brotes in vitro, que fue abrogada por inhibidor de Notch. Estos resultados sugieren que la regulación SIRT1 mediada por la vía de Notch en células endoteliales puede ser modulada.
En nuestros estudios, SIRT1 fue altamente expresado en ECs derivada de cáncer de pulmón. Por otra parte, la hipoxia se ha demostrado que es uno de los principales factores desencadenantes de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los tumores malignos [14]. Zhang et al. demostró que debido HIC1 (hypermethylated en Cáncer 1) unido al promotor de SIRT1, la consiguiente reducción del reclutamiento CtBP disminuyó la represión de la transcripción y la expresión de SIRT1 inducida en células de cáncer de pulmón [15]. La hipótesis de que la regulación SIRT1 durante la hipoxia podría ser conferida a través de cambios en la expresión de genes SIRT1 en los CE derivada de cáncer de pulmón. Para nuestro conocimiento, este fue el primer estudio que demuestra que la expresión de SIRT1 se incrementa de una manera dependiente del tiempo durante la hipoxia en las células endoteliales del tumor.
A continuación pregunta si SIRT1 interactuó con determinados socios de la transcripción en las células endoteliales vasculares a mediar sus efectos específicos. Guaraní y col. [16] anteriormente mostró que la acetilación de N1IC en lisinas conservadas controla la amplitud y duración de las respuestas a través de Notch alterado recambio de proteínas N1IC. asociados SIRT1 con N1IC y funciona como un desacetilasa N1IC para inhibir la estabilización N1IC acetilación inducida. Constantemente, nuestros resultados también indicaron que la SIRT1 desacetilado y se reprime la expresión N1IC, lo que llevó a la brotación angiogénico mejorada y tubulogénesis regulada por la vía de señalización angiogénica SIRT1-dependiente. Más importante aún, hemos demostrado por primera vez que la SIRT1 se contrató a una región altamente conservada situada en -500 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Notch 1, lo que sugiere que SIRT1 podría unirse directamente al promotor Notch 1, inhibiendo de este modo la expresión génica. De notas, la SIRT1 regula negativamente Notch1 a través de desacetilación, por tanto, los cambios a nivel transcripcional de Notch también pueden desempeñar un papel en la reducción de la actividad de Notch afectados por SIRT1. Esto tiene que ser determinada más allá.
HEY es hélice-bucle-hélice (bHLH) represor transcripcional. miembros de la familia HEY se consideran genes diana de Notch1 de señalización en el endotelio, ya que su expresión puede ser inducida por Notch1 [12]. En este estudio, hemos examinado la capacidad de SIRT1 para regular la expresión de genes controlados por N1IC, como HEY1 y hey2. De acuerdo con informes de Mulligan et al. [17], nuestros resultados revelaron que la SIRT1 regula negativamente la expresión de HEY1 y hey2 en ECs derivada de cáncer de pulmón. Por otra parte, Takara et al. demostró que SIRT1 interactúa funcionalmente con los represores bHLH peludo y potenciador de dividir-[18]. Para investigar más los efectos de SIRT1 sobre la respuesta de células Notch mediada y el crecimiento tumoral, se investigó la formación de brotes en ECs derivados del cáncer de pulmón y encontramos que la inactivación de la formación de brotes SIRT1 deteriorado y alargamiento. Estos efectos fueron contrarrestados por la adición o la DAPT inhibidor de Notch 1, lo que sugiere que SIRT1 modula funciones angiogénicas endoteliales mediante la regulación de la señalización de Notch. Sin embargo, la inactivación de SIRT1 no impedía por completo la formación de brotes. Por lo tanto, la hipótesis de que, además de Notch1, nuevos factores de transcripción en SIRT1 regula también pueden estar implicados en el desarrollo vascular, aunque se requieren estudios futuros para abordar el papel de estos reguladores desconocidos en el cáncer de pulmón.
Guaraní et Alabama. informaron que p300 podría obligar a N1IC y funcionar como un co-activador en promotores Notch regulado [16]. Además, nuestro estudio mostró que p300 era no sólo capaz de acetilar N1IC pero también podría activar su transcripción. Más importante aún, SIRT1 inhibió la forma acetilada de N1IC y disminuyó significativamente la actividad N1IC en presencia de p300. Por el contrario, el tratamiento con el inhibidor de deacetilasa NAM condujo a un aumento significativo en la expresión de mRNA N1IC. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la actividad deacetilasa SIRT1 endotelial alterada la cascada de señalización por deacetylating N1IC y antagonizar p300 Notch. Hansson et al. mostró que MAML1 (Notch coactivador) podría potenciar autoacetylation p300 y p300 de activación transcripcional [19]. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que la SIRT1 interactúa físicamente con y reprime la transactivación p300 de una manera dependiente de NAD. SIRT1 represión de p300 se ha demostrado que se producen a través de la desacetilación de dos residuos de lisina (1020 y 1024) dentro del dominio de p300 rica en cisteína (CRD1) [20]. Debido a p300 es un cofactor transcripcional gating, desacetilación y la represión de p300 por SIRT1 puede servir como un importante punto de integración durante el metabolismo y la diferenciación celular.
Tras la unión de un ligando transmembrana de la /las familias dentados, transmembrana Delta de Notch Los receptores generalmente proporcionan señales que guían las decisiones de destino celular. En particular, DLL4 se requiere para el desarrollo vascular y se expresa fuertemente en los vasos tumorales [21]. Además, el estudio de SIRT1 knock-en ratones indicaron que SIRT1 funcionaba para mantener la capacidad de neovascularización en respuesta a la estimulación DLL4 en el endotelio vascular del tumor. Para determinar la función de DLL4 durante la angiogénesis del tumor en los ratones transgénicos SIRT1, se disminuyó el nivel DLL4 presente en un modelo de tumor murino utilizando un anticuerpo monoclonal anti-DLL4. Nuestros resultados sugieren que la inhibición de la señalización Notch-DLL4 resultó en un aumento de la densidad tumor vascular. Sorprendentemente, este fenotipo crecimiento excesivo vascular dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral. Una explicación plausible podría ser que los resultados de ramificación excesivas en una red vascular altamente caótica que carecen de la jerarquía esencial para el flujo sanguíneo direccional eficiente. Estudios de perfusión demostraron que la vasculatura del tumor hypersprouting era no funcional [6], lo que sugiere que el bloqueo de la señalización de Notch-DLL4 podría conducir a buque tumor "abnormalization" y inhibió el crecimiento tumoral. En las células endoteliales, SIRT1 modula la actividad transcripcional de FoxO1 y p53, y activa la actividad enzimática de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Dada la multitud de factores corriente abajo dirigidos por SIRT1 por desacetilación, SIRT1 ha planteado la hipótesis de actuar como un regulador clave de varias vías de señalización implicadas en el crecimiento tumoral y la vascularización [22]. Nuestros hallazgos sugieren que el bloqueo pharmacological- o base molecular de la actividad de SIRT1 puede representar un enfoque prometedor y novedoso para el bloqueo de la progresión del tumor.
En conjunto, nuestro estudio demuestra un nuevo papel para la SIRT1, con lo que la SIRT1 actúa como por células modulador negativo autónoma de la señalización de Notch, y estos resultados identifican la acetilación reversible de N1IC como un mecanismo molecular por el cual las respuestas clave Notch se pueden modular de forma dinámica. SIRT1 inhibe la forma acetilada de N1IC y disminuye significativamente la actividad N1IC inducido por p300, lo que limita la respuesta de señalización DLL4 /Notch y la inhibición de la angiogénesis del tumor (Fig. 5). Nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la actividad de SIRT1 o /y la expresión génica puede proporcionar nuevas oportunidades para el tratamiento anti-cáncer.
Nuestro estudio muestran que el ligando Delta-como 4 (DLL4), que está altamente expresado en las células vasculares durante la angiogénesis tumoral, se une al receptor e inicia Notch1 escisiones proteolíticas. La escisión definitiva intramembrane catalizada por la γ-secretasa conduce a la liberación del principio activo Notch1 dominio intracelular (N1IC), que se transloca al núcleo y recluta la MAML1 proteínas y acetiltransferasas de histonas (HAT, como p300) al complejo de CSL. Este reclutamiento conduce a la activación de los genes diana Notch1 HEY1 y hey2. Además, p300 acetila N1IC y mejora su actividad transcripcional mientras que SIRT1 inhibe la forma acetilada de N1IC y significativamente disminuye la actividad inducida por N1IC p300, lo que limita la respuesta de señalización DLL4 /Notch y la inhibición de la angiogénesis tumoral.
Materiales Métodos y
Ética Declaración
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo las directrices institucionales de la provincia de Guangdong y aprobado por el Comité de uso de los animales. La aprobación se obtuvo también del comité de ética de Guangzhou Instituto de Investigación de Enfermedades Respiratorias (ID. 2009-2130).
Reactivos y
in vitro
tratamientos con células
La nicotinamida y N - [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanil] -S- fenilglicina éster t-butilo (DAPT) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). SRT2183 y SRT1720 fueron adquiridos de Sirtris Pharmaceuticals (USA). DLL4 se adquirió de amp I +; D Systems (EE.UU.). Los grupos de control se trataron con los vehículos respectivos. El anticuerpo monoclonal anti-DLL4 (un isotipo IgG1 humano que reacciona de forma cruzada con los humanos y ratón DLL4, 1 mg /ml) fue un regalo de MedImmune, LLC (EE.UU.).
modelos de xenoinjertos
C57BL /6J (hembras, de 6-8 semanas de edad, con un peso 15-22 g) fueron adquiridos de la Shanghai Slac Animales de Laboratorio Co., Ltd. (china). SIRT1-knock-in o SIRT1 (H363Y) -transgenic C57BL /6J específicos de células endoteliales fueron proporcionados por la Academia China de Ciencias Médicas. Para generar SIRT1 específico del endotelio o SIRT1 (H363Y) -transgenic ratones, humanos SIRT1 ADNc (NCBI ref: NM_012238.4) o SIRT1 (H363Y) de cDNA se ligó con el ratón VE-cadherina promotor, y los clones resultantes se conoce como VE-S.