Extracto
A pesar de sus efectos secundarios, docetaxel (DTX) sigue siendo un tratamiento de primera línea contra el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Por lo tanto, las estrategias para aumentar su eficacia anti-tumor y disminuyen se necesitan críticamente sus efectos secundarios. La orientación de la tensión constitutiva retículo endoplasmático (ER) en las células cancerosas está siendo investigado como un enfoque quimiosensibilización. La hipótesis de que la inducción simultánea de ER-estrés y la supresión de la vía de supervivencia /AKT PI3K será un enfoque más eficaz. En una línea celular CRPC, C4-2B, se observó significativa (p & lt; 0,005) aumento de la citotoxicidad tras coexposure DTX-inducido a thapsigargina y un inhibidor de AKT-. Sin embargo, ya que estos dos agentes no están aprobados clínicamente, se investigó si una combinación de nelfinavir (NFR) y curcumina (CUR), conocido para orientar estos dos vías metabólicas, pueden aumentar de manera similar DTX citotoxicidad en células CRPC. Dentro de las 24 horas después de la exposición a concentraciones fisiológicas de NFR (5 M) y CUR (5 M) una significativa (p & lt; 0,005) aumentada su citotoxicidad fue evidente con una baja concentración de DTX (10 nM). Esta combinación de 3 fármacos aumentó rápidamente la apoptosis en células C4-2B agresivos, pero no en RWPE-1 en las células o en las células epiteliales de la próstata (PrEC) primaria. estudios moleculares comparativos revelaron que esta combinación de 3 fármacos causó una supresión más pronunciada de fosforilados-AKT y la inducción más alta en fosforilados-eIF2α en células C4-2B, en comparación con células RWPE-1. La exposición aguda (3-9 horas) a esta combinación de 3 fármacos se intensificó inducidos marcadores pro-apoptóticos ER-estrés, es decir, ATF4, CHOP, y trib3. A concentraciones mucho más bajas, (3 semanas) las exposiciones crónicas a estos tres agentes reducen drásticamente unidades formadoras de colonias (CFU) por las células C4-2B.
In vivo
estudios que utilizan ratones que contienen xenoinjertos de tumores C4-2B mostraron significativa (p & lt; 0,05) la mejora de la DTX (10 mg /kg) la eficacia antitumoral siguientes coexposure a NFR (20 mg /kg) & amp; CUR (100 mg /kg). Inmunohistoquímica (IHC) el análisis de secciones de tumor indicados disminución de Ki-67 y aumento de la intensidad de tinción TUNEL en los ratones expuestos a la combinación de 3 fármacos. Por lo tanto, subvertir ER-estrés hacia la apoptosis mediante la terapia adyuvante con NFR y CUR puede chemosensitize las células CRPC para DTX terapia
Visto:. Mathur A, Abd Elmageed ZY, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel Mageed AB, et al. (2014) Subvirtiendo ER-estrés hacia la apoptosis por Nelfinavir y curcumina Coexposure Augments Docetaxel eficacia en células de cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10.1371 /journal.pone.0103109
Editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de enero de 2014; Aceptado: June 12, 2014; Publicado: 14 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Mathur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios contaron con el apoyo de subvenciones del Departamento de Defensa, a DM (# PC080811) y para A.B.A. (# PC081598), y los fondos de la Louisiana Consorcio de Investigación del Cáncer (LCRC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos. El tratamiento inicial de los tumores localizados consiste en la cirugía y la radioterapia, seguida de terapia de privación de andrógenos (ADT). Sin embargo, ADT sólo es eficaz durante un promedio de 18-24 meses, y la recurrencia del cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) dicta la morbilidad y la mortalidad en los pacientes [1]. Aunque los antagonistas del receptor de nuevos y más potentes andrógenos (AR), por ejemplo, MDV-3100 (Enzalutamida), han mostrado alguna promesa, la resistencia ya está siendo encontrado en la clínica [2]. Por lo tanto, la quimioterapia con taxanos sigue siendo el fármaco de elección para los pacientes con CRPCs agresivos y metastáticos. Sin embargo, una estrategia segura y eficaz para aumentar la eficacia de los taxanos representa una necesidad clínica insatisfecha.
El docetaxel (DTX), un agente anti-microtúbulos, fue aprobado por la FDA de Estados Unidos como el principal tratamiento contra el CRPC [3 ]. Aunque inicialmente eficaz, basado en la DTX régimen sólo ha mostrado una supervivencia media de 18-20 meses y la tasa de respuesta de sólo el 50%. Además, DTX presenta efectos adversos significativos en los pacientes con trastornos comórbidos, que la reducción de dosis mandato lo que aumenta la posibilidad de que la selección de clones resistentes. Estudios recientes han demostrado que el desarrollo de resistencia después del tratamiento a largo plazo con DTX puede ocurrir debido a la regulación al alza de la señalización /AKT PI3K en células CRPC [4], [5]. Por lo tanto, la regulación negativa de la señalización PI3K /AKT en las células CRPC deberá aumentar la eficacia de este agente quimioterapéutico [6].
células cancerosas agresivas son también capaces de escapar a la quimioterapia mediante la modulación de las vías de regulación maestros que determinan su decisión supervivencia o la muerte haciendo habilidades. A este respecto, el control de la traducción de proteínas a través de la cascada de ER-estrés exquisitamente regulada se ha demostrado para promover la supervivencia de células tumorales y escapar de la apoptosis [7]. Un enlace directo entre el fenotipo agresivo tumor y el aumento de la expresión del marcador ER-estrés, bip /GRP78, se ha documentado [8] - [10]. De hecho, varios informes recientes han establecido que la ER-estrés puede facilitar el crecimiento del tumor persistente y su resistencia terapéutica. Por lo tanto, los investigadores han sugerido que la focalización de ER-estrés puede ser una estrategia quimiosensibilizante potente [11] - [13]. Wu et al, (2009) demostró que el ácido methylseleninic inductor ER-estrés (MSA) sensibiliza a las células PC-3 a los efectos citotóxicos de paclitaxel y DTX [11]. compuestos naturales como el galato de epigalocatequina, un compuesto polifenólico en el té verde, pueden mejorar la eficacia de la quimioterapia en las células de glioblastoma mediante el aumento de ER-estrés [14]. Sin embargo, la eficacia de la regulación por disminución simultánea de la vía PI3K /AKT supervivencia y la regulación positiva de la apoptosis inducida por el estrés ER-como un enfoque quimiosensibilización potente no ha sido probado.
Los estudios proporcionan evidencia clara de conversaciones cruzadas entre múltiples vías de transducción de señales que regulan las decisiones del destino celular después de la inducción de estrés ER-en células de cáncer [7], [15] (por favor refiérase a la Fig. 1A para obtener una descripción detallada). Un leve nivel de ER-estrés activa una respuesta de supervivencia llamado la respuesta a proteínas desplegadas (UPR). Sin embargo, el estrés severo ER-subvierte esta UPR hacia una vía de pro-apoptóticos, que es dictada por la expresión de ER-inducida por el estrés y factores de transcripción ATF4 CHOP, y la inducida por el estrés ER-trib3 sensor de muerte. Curiosamente, bajo ER-estrés leve, los bajos niveles trib3 actúan como un regulador negativo de ATF4 CHOP y que favorece la supervivencia celular. Sin embargo, durante severa ER-estrés, altos niveles de ATF4 CHOP y aumentan la expresión trib3 y una supresión en paralelo de AKT, que favorecen la apoptosis [16] - [18]. Por lo tanto, trib3 parece funcionar como un "interruptor molecular" maestro para la supervivencia
vs.
La muerte de señalización en las células de cáncer sometidos a estrés ER-(fig. 1B). Por lo tanto, los agentes farmacológicos que inducen altos niveles de trib3 deberían sensibilizar a las células cancerosas a la quimioterapia.
(A). En condiciones normales homeostáticos, el ATF6, IRE1 y proteínas PERK están obligados a Bip /GRP78 en la membrana del RE. Una respuesta de la proteína desplegada (UPR) libera estos transductores ER-estrés de Bip. ATF6 autorización se transloca al núcleo para aumentar XBP-1 la expresión génica. la activación en paralelo de IRE1 permite el empalme de XBP-1 mRNA, que codifica un factor de transcripción que estimula varios genes inducibles de estrés. PERK lanzado activa eIF2α, que a su vez inhibe la traducción de proteínas cap-dependiente para proteger aún más las células de la progresión de la UPR. Por lo tanto, las conversaciones cruzadas entre estos transductores ER-estrés actúan a través de vías paralelas para facilitar la supervivencia celular y restaurar la homeostasis celular después de una ER-estrés leves y transitorios. Sin embargo, bajo ER-estrés prolongado o severo, la traducción independiente de caperuza de ATF4 continúa. los niveles nucleares ATF4 desregular la homeostasis celular mediante el aumento de la expresión de sensores de muerte ER-estrés, CHOP y trib3. (SEGUNDO). Trib3 actúa como el "interruptor molecular" que dicta las decisiones de supervivencia celular o muerte celular después de ER-estrés. Los bajos niveles de funciones trib3 a través de una retroalimentación de bucle negativo para suprimir ATF4 y cortar la expresión, lo que permite la supervivencia celular (panel izquierdo). Sin embargo, los altos niveles de trib3 regula a la baja la vía de supervivencia AKT, pero no suprime ATF4 y CHOP, que continúan provocando niveles incontrolados de trib3. Este desequilibrio subvierte las respuestas del examen periódico universal y ER-estrés de un modo de supervivencia hacia la apoptosis (panel derecho).
tapsigargina (Tg), un conocido inductor de estrés ER, puede sensibilizar las células PC-3 tanto a paclitaxel y DTX [11]. Además, el inhibidor de AKT (Akti-IV) puede sensibilizar las líneas celulares HeLa y tanto SKOV3 a cisplatino y etopósido [19]. Sin embargo, estos compuestos experimentales no se pueden utilizar en los pacientes ya que manifiestan significativas
in vivo
toxicidades [11], [19]. Además, la aprobación clínica de nuevos agentes que los objetivos de seguridad AKT y ER-estrés sería un proceso costoso y que consume tiempo. A este respecto, el reposicionamiento de drogas se está convirtiendo en un anticancerígeno muy gratificante y la estrategia quimiosensibilizante [20]. Hemos investigado si dos agentes farmacológicos aprobados, es decir, nelfinavir y curcumina, conocido para orientar las vías ER-estrés y AKT, puede aumentar la eficacia antitumoral de DTX contra las células CRPC.
Nelfinavir (NFR) es una de la primera inhibidores de la VIH-1 proteasa (HPI) para ser aprobados clínicamente [21], [22] y en la actualidad está siendo colocado de nuevo como un agente anti-cáncer, así (ClinicalTrials.gov). Numerosos estudios han demostrado que puede NFR tanto chemosensitize y radiosensibilizar una variedad de diferentes células tumorales [23] - [28]. Sus efectos sensibilizantes se han relacionado con la inducción de ER-estrés y la inhibición de la vía de AKT [28]. De hecho, el ritonavir, otro HPI con mecanismo de acción similar, también fue demostrado para mejorar los efectos anticancerígenos de DTX en una línea celular de CaP altamente agresivo, DU-145 [29]. Sin embargo, los efectos sensibilizadores de NFR solamente se exponen a concentraciones de ≥10 M, que es superior a sus niveles de seguridad y fisiológicamente alcanzables, es decir 4,5-6 M [30], [31]. Por lo tanto, la combinación de NFR con otro compuesto seguro que de igual forma se dirige a ER-estrés y AKT vías puede ser más eficaz.
curcumina (CUR) es el componente activo de
Curcuma longa
, un Medio -indian planta. Este fitoquímico ha conocido propiedades anti-inflamatorias y anti-cáncer y una serie de laboratorios están investigando el mismo de la utilidad como un complemento a la quimioterapia [32]. De hecho, CUR ha demostrado inhibir la vía PI3K /AKT e inducir bajos niveles de ER-estrés específicamente en las células del cáncer [33], [34]. En las células de cáncer de pulmón, CUR exhibió efectos antitumorales sinérgicos cuando se combina con DTX [35]. Recientemente, CUR También se demostró para desencadenar la muerte celular en células de cáncer de colon a través de la autofagia inducida ER-estrés [36]. Sin embargo, similar a NFR, el
in vitro
efectos quimiosensibilizantes de CUR fueron evidentes sólo a altas concentraciones (≥10 M), lo cual es difícil de lograr
in vivo
[37], [38 ]. Por lo tanto, la hipótesis de que CUR y NFR combinación debe aumentar sus capacidades de forma potente quimiosensibilizantes individuales.
Las investigaciones basadas en células C4-2B (una línea celular de CRPC) observó una elevación significativa la eficacia antitumoral de DTX siguiente coexposure para NFR y CUR . Mecánica, esta combinación de 3 fármacos para suprimir sinergizada AKT e inducir ATF4, CHOP y niveles trib3. Tanto nuestros
in vitro
y
in vivo
hallazgos implican claramente el potencial de la terapia adyuvante con concentraciones fisiológicamente alcanzables de NFR y CUR para aumentar la eficacia de DTX en pacientes CRPC.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Las células C4-2B, una sublínea óseo metastásico CRPC derivado de LNCaP, fue una especie de regalo del laboratorio del Dr. Leland Chung (Universidad de Emory) [39] . Estas células se cultivaron en RPMI-1640 (CellGro, Manassas, VA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) de Atlanta Biológicos (Lawrenceville, GA) y 1% de penicilina solución de antibiótico estreptomicina /(CellGro). El celdas 1-RWPE, una línea de próstata humana no tumorigénicos células epiteliales inmortalizadas con el virus del papiloma humano (VPH-18), se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC;#CRL-11609). Se cultivaron estas células en suero de queratinocitos libre de los medios de comunicación (K-SFM) complementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF) y extracto de pituitaria bovina, todos obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). células epiteliales de próstata humana primarias (PrEC) se obtuvieron de ATCC (# PCS-440-010) y se cultivaron en medio basal de células epiteliales de la próstata y suplementos (ATCC;#PCS-440-030 y#PCS-440-040). Las células madre mesenquimales de médula ósea (BM-MSC) se obtuvieron de la facilidad de la base de células madre en la Universidad de Tulane (Nueva Orleans, LA) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 20% de SFB y antibióticos. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C, en un incubador humidificado que contiene 5% de CO
2.
Reactivos
El mesilato de nelfinavir se extrajo (NFR) en polvo y purificados de comprimidos de 250 mg ( productos farmacéuticos; Agouron San Diego, CA). La curcumina (CUR) se obtuvo de Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Docetaxel (DTX) y tapsigargina (Tg) se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) y la AKT-inhibidor (Akti-IV; Catálogo no 124.005.) Se obtuvo de Calbiochem (Billerica, MA). Para
in vitro
estudios, todos los fármacos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Los anticuerpos primarios contra-total AKT y fosfo-AKT, eIF2α total y fosfo-eIF2α, y en contra humana Bip /GRP78, PARP y CHOP, fueron todos adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Los anticuerpos contra trib3 humana y ATF4 eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), anticuerpo contra humano β-actina era de Fisher Scientific (Waltham, MA) y en contra de Ki-67 era de primavera Biosciences (Pleasanton, CA). Todos los anticuerpos secundarios, como de cabra anti-ratón, de cabra anti-conejo y bovino anti-cabra, fueron todos adquiridos de Santa Cruz de la Biotecnología.
viabilidad de las células de ensayo
El MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) fue utilizado -2,5-difeniltetrazolio bromuro] ensayo para determinar la viabilidad celular después de la exposición a los compuestos de ensayo [40]. En resumen, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. concentraciones deseadas de los compuestos, solos o en diferentes combinaciones, se añadieron a las células en 3 pocillos replicados. Después de 24-72 horas de incubación, se añadió MTT (Sigma) a cada pocillo y se incubaron durante 3 hr y los cristales de formazán se detectaron por coloración púrpura. El porcentaje de supervivencia se calculó midiendo la absorbancia a 540 nm usando un lector de placas μQuant de Bio-Tek (Seattle, WA).
fragmentación del ADN de ensayo
El ensayo de fragmentación de ADN se llevó a cabo de acuerdo con anteriores estudios publicados [41]. Brevemente, las células en 10 cm platos de cultivo de tejidos se trataron con las concentraciones deseadas de DTX, NFR y CUR, solos y en combinación. Las células se recogieron después de 24 horas en un tampón de lisis celular {0,2% de Triton-X 100 mM, Tris-Cl 10 (pH 7,4) y EDTA 10 mM (pH 8,0)}, seguido de tratamiento con 100 mg /ml de ARNasa A (Sigma ) y 0,5 mg /ml de proteinasa-K (Sigma). El ADN de bajo peso molecular se extrajeron mediante la adición de volúmenes iguales de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico-(25:24:1) y, además, por cloroformo y alcohol isoamílico (24:1). ADN extraído se precipitó con etanol (300 mM de NaCl y 100% de etanol enfriado en hielo), se redisolvió en 1X TE (Tris /EDTA) tampón y a electroforesis en un gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio (0,1 mg /ml). La fragmentación del ADN se visualizó bajo luz UV utilizando el software Cantidad Uno (Bio-Rad, Hercules, CA).
caspasa-3 ensayo
La caspasa-3 Kit de ensayo de EnzChek (Molecular Probes; Eugene, OR) detecta la apoptosis mediante la medición de la escisión proteolítica de un amino-metil-cumarina (AMC) sustrato fluorescente derivada, Z-DEVD-AMC. Brevemente, las células en 10 cm placas petri fueron tratados con DTX, NFR y CUR, solos y en combinación. Las células se recogieron a las 24 horas, se lisaron, y la caspasa-3 ensayo se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos del fabricante. La media de intensidad de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas FLx800 (BioTek) con longitudes de onda de excitación y emisión fijados en 360 ± 20 nm y 460 ± 20 nm, respectivamente.
inmunodetección WESTERN Hotel
lisados de células enteras fueron recolectadas en diferentes puntos de tiempo (30 minutos a 9 horas) después de la exposición a DTX, NFR y tratamientos CUR mediante el uso de tampón de lisis celular 1X (Cell Signaling Tecnología; Danvers, MA). Las proteínas se cuantificaron utilizando el reactivo de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Aproximadamente 30 g de proteína se fraccionó en geles al 10% de SDS-PAGE de Bio-Rad (Hercules, CA) y se transfirieron a una membrana de PVDF. La unión no específica fue bloqueada por incubando membranas con un bloqueador de quimioluminiscencia Blok-CH (Millipore) y se hibrida con anticuerpos primarios deseados (1:1,000 de dilución) la noche a 4 ° C y luego con los anticuerpos secundarios marcados con HRP (1:5,000 dilución) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron utilizando mayor quimioluminiscencia (ECL) y el sustrato SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software Image-J (NIH) y el valor densitométrico para cada proteína se normalizaron a los correspondientes niveles de beta-actina en cada muestra.
unidades formadoras de colonias ensayo de
C4- 2B células fueron sembradas en 6 cm platos con 200 células /placa. Drugs, solos o en combinación, se añadieron después de 48 horas y los tratamientos se llevaron a cabo en 3 pocillos replicados. Tanto NFR y CUR reponían dos veces a la semana y DTX se repone una vez a la semana junto con el medio de crecimiento fresco. Después de tres semanas, las colonias se fijaron con etanol al 100% y se tiñeron con azul de metileno, y las unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeraron usando el software Cantidad Uno (Bio-Rad).
Estudios de xenoinjertos de tumores
Todos los protocolos experimentales con animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional de la Universidad de Tulane (IACUC; Protocolo#4295). La
in vivo
antitumoral eficacia de DTX, solo o en combinación con NFR y CUR, se determinaron en xenoinjertos de tumores en ratones desnudos atímicos (NCI; Frederick, MD). Para cada ratón (4-semanas de edad), las células C4-2B (2 × 10
6) se resuspendieron en 100 l de medio libre de suero y se inyectaron por vía subcutánea (sc), junto con 100 l de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 50 a 75 mm
3 (~ 2 semanas después de la inyección), los animales fueron asignados al azar para el tratamiento con vehículo, DTX (10 mg /kg), o con DTX (10 mg /kg) + NFR (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) por inyección intraperitoneal (ip). Antes de cada inyección, las drogas eran recién disueltos en sus respectivos vehículos [23], [43], [44]. DTX se administró una vez a la semana, y NFR y CUR se les administró 5 días /semana. tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana usando un calibrador y los volúmenes tumorales Vernier se calcularon utilizando la fórmula, 0,5 x longitud x anchura
2 [45]. Peso de cada ratón se midió y relaciones de tumor-volumen total peso se calcula en cada punto de tiempo. Los tumores fueron extirpados al final del período de tratamiento (4 semanas), incluido en parafina y se seccionaron para la tinción inmunohistoquímica (IHC).
La inmunohistoquímica
Los tumores fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra para 24 h seguido de 70% de etanol y luego se incluyeron en parafina. Secciones (~ 5 micras) fueron cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E). IHC para la expresión Ki-67 se llevó a cabo para determinar el número de células en proliferación. Brevemente, las secciones se desparafinaron, hidratados, y el antígeno recuperar utilizando 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0). Las secciones se bloquearon primero con 3% de H
2O
2 y luego con 1,5% de suero de bloqueo (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories; Burlingame, CA). Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo anti-Ki-67 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado y después con el reactivo de enzima (kit Vectastain ABC; Vector Laboratories). Las secciones fueron teñidas con diaminobencidina (DAB) y contrastados mediante tinción nuclear con hematoxilina (Vector Laboratories;#H-3401). se añadió medio de montaje permanente y Ki-67 tinción se visualizó y capturado utilizando un microscopio Eclipse E-400 (Nikon Instruments, Melville, NY). En cada diapositiva, 5 campos diferentes se visualizaron para Ki-67 células teñidas y se cuantificaron utilizando el software Image J-
ensayo de TUNEL
Este kit de ensayo colorimétrico TUNEL DeadEnd (Promega;. Madison, WI) se utilizó para determinar células apoptóticas en secciones de tumor, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Este ensayo mide la incorporación de nucleótidos biotinilados en el ADN, que a continuación se visualizó mediante estreptavidina marcada con HRP y DAB. La tinción se visualizó por Eclipse E-400 microscopio y las imágenes fueron capturadas a partir de 4 campos diferentes en cada sección del tumor.
Sinergia determinación
Se utilizó el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) para calcular el índice de combinación (CI) basado en el método de Chou-Talalay [46]. Este método se basa en la ecuación del efecto mediano que incluye ecuaciones de Michaelis-Menton, Hill y Henderson-Hasselbalch y proporciona una medición cuantitativa de aditivo (IC = 1), sinérgico (CI & lt; 1) o antagonista (CI & gt; 1) efectos.
el análisis estadístico
los análisis estadísticos se realizaron con el GraphPad Prism versión 4.00-Software (San Diego, CA, EE.UU.). Los resultados se expresan como error estándar de las medias (± SEM). Cambios significativos relativos a los controles se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas y los valores de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
La exposición combinada a tapsigargina y AKT-inhibidor sensibiliza C4. 2B células a DTX-citotoxicidad inducida
para hacer frente a nuestra hipótesis central que la orientación simultánea de ER-estrés y AKT vías resultará en quimiosensibilización de las células CRPC, se analizó en primer lugar si la Tg y coexposure AKTI-IV pueden sensibilizar C4 células 2b a DTX inducida por citotoxicidad (Fig. 2A). Los efectos del aumento de las concentraciones de fármaco y el tiempo de exposición se controlaron primero por MTT-ensayos. A las 72 horas después de la exposición, el IC valores
50 para DTX, Tg y AKTI-IV fueron 35,8 nM, 80,8 nM y 5,5 mM, respectivamente (Tabla S1 S1 en el archivo). Los posibles efectos sinérgicos de la combinación de fármacos a continuación, se investigaron mediante concentraciones inferiores a sus respectivos IC
50 valores. estudios Coexposure mostraron claramente que la combinación de DTX (10 nM), Tg (25 nM) y AKTI-IV (2,5 M) dio como resultado una disminución significativa (p & lt; 0,0005) disminución en la supervivencia de las células C4-2B, en comparación con DTX solo ( la Fig. 2B). Futuros estudios se llevaron a cabo para investigar si coexposure a dos agentes de seguros y aprobados, es decir, NFR y CUR, pueden aumentar de manera similar DTX sensibilización de las células C4-2B.
(A). inducción simultánea de ER-estrés por tapsigargina (Tg) y la supresión de AKT por un Akt-inhibidor (Akt-I) puede hacer que las células cancerosas susceptibles a las acciones citotóxicas de la quimioterapia. (SEGUNDO). Los efectos citotóxicos de DTX, solo o en combinación con Tg y /o Akt-I, sobre la viabilidad celular C4-2B. Coexposure a Tg (25 nM) y Akt-I (2,5 M) mejorada DTX (10 nM) la citotoxicidad inducida a las 72 horas después de la exposición (n = 3). Las barras de error representan los valores ± SEM y las diferencias significativas se muestran como valores de P (***, P & lt; 0,0005).
Coexposure concentraciones fisiológicamente a alcanzables de NFR & amp; CUR sensibiliza a las células C4-2B a DTX-citotoxicidad inducida
El IC valores
50 para DTX, NFR o CUR se calcularon después de la exposición a los fármacos individuales de 24, 48 y 72 h (Tabla S1 S1 en el archivo ). Se observó una concentración y la supresión dependiente del tiempo en la supervivencia celular (MTT-ensayo). En estudios posteriores, la sub-IC
50 concentraciones de fármacos se utilizaron en 2 ó 3 combinaciones de fármacos y la supervivencia celular se controló en diferentes tipos de células, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, ( C) BM-MSC y (D) PrEC (Fig. 3). Aunque a las 24 horas la IC
50 para DTX, NFR y CUR solo mostraron ser 590,5 nM, 30,3 mM y 59 mM, respectivamente, un aumento significativo (p & lt; 0,0005) se observó en C4-2B citotoxicidad cuando DTX era se utiliza en combinación con NFR y CUR. Curiosamente, la rápida citotoxicidad observada en las células C4-2B no fue evidente en las células no tumorigénicas RWPE-1 o en las células primarias, es decir, BM-MSC y PrECs. El análisis del índice de combinación (CI) mostró un valor de 0,045 en células C4-2B, lo que sugiere un fuerte efecto sinérgico de la combinación de 3 fármacos. Sin embargo, se encontraron los valores de CI para células RWPE-1 y BM-MSC a ser mucho mayor, es decir, 0.527 y 0.639, respectivamente. Además, el valor CI en las células PrEC era 2,074, lo que sugiere un efecto antagonista. Estudios similares en otra línea celular CaP agresivo, PC-3, también indicaron significativa (p & lt; 0,0005) aumento de la DTX sensibilización siguiente coexposure tanto para NFR y CUR (Tabla S1 en File S1 y Fig S1A en File S1.). Es interesante sin embargo, a diferencia de en las células C4-2B, la sinergia de drogas en células PC-3 se observó solamente a las 72 horas post-tratamiento. Tomados en conjunto, estos resultados indican claramente que coexposure para NFR y CUR rápidamente y de forma sinérgica puede aumentar la citotoxicidad inducida por DTX en la línea CRPC C4-2B, pero no en la línea de no tumorigénicos, RWPE-1. Por lo tanto, los estudios mecanísticos moleculares se llevaron a cabo para delinear las acciones diferenciales de esta combinación de 3 fármacos en ambas líneas celulares
.
efectos citotóxicos de DTX (10 nM), sola y en combinación con NFR (5 M) y /o CUR (5 M), se muestran en los siguientes cuatro tipos de células, (a) C4-2B, (B) RWPE-1, (C) PREC y (D) BM-MSC. Ensayos de viabilidad celular se realizaron a las 24 horas post-exposición y porcentaje de cambio en la supervivencia celular, en comparación con las células no tratadas (control), se determinaron. Las MTT-ensayos se realizaron en 3 pocillos replicados y todos los experimentos se repitieron al menos tres veces independientes (n = 3). Las barras de error representan ± SEM y las diferencias significativas entre DTX-solamente y el grupo + NFR + CUR DTX se muestran como los valores de p (***, p & lt; 0,0005; **, p & lt; 0,005)
diferenciales de NFR & amp; CUR combinación sobre la apoptosis inducida por DTX en C4-2B y células RWPE-1