Extracto
La ciclina B1, una ciclina mitótica, se ha implicado en lesiones malignas. Sin embargo, su contribución a la invasión del cáncer colorrectal y metástasis todavía no se entiende bien. Aquí, hemos demostrado que la invasión y la metástasis de cáncer colorrectal está regulada por la ciclina B1. La sobreexpresión de ciclina B1 se observó en los tejidos de cáncer colorrectal, pero esta expresión elevada se asoció negativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, la etapa de metástasis a distancia, y el estadio TNM. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier demostró que la expresión de ciclina B1 baja se asocia a peor supervivencia global de los pacientes con cáncer colorrectal. La inhibición de la ciclina B1 en células de cáncer colorrectal aumentó la migración celular y la invasión de las tres líneas celulares de cáncer colorrectal diferentes. En el estudio de la posible mecanismo por el cual Ciclina B1 suprime la invasión del cáncer colorrectal y metástasis, se observó que la supresión de la ciclina B1 disminuyó la expresión de nivel de proteína E-cadherina. Nuestros hallazgos sugieren que la ciclina B1 pudo reprimir la invasión y la metástasis de las células del cáncer colorrectal a través de la regulación de la expresión de E-cadherina, que permite el desarrollo de estrategias de intervención potenciales para el cáncer colorrectal
Visto:. Colmillo Y, X Liang, Jiang W, Li J, Xu J, Cai X (2015) suprime la ciclina B1 cáncer colorrectal invasión y metástasis mediante el control de e-cadherina. PLoS ONE 10 (5): e0126875. doi: 10.1371 /journal.pone.0126875
Editor Académico: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 18 Enero, 2015; Aceptado: 8 Abril 2015; Publicado: 11-may 2015
Derechos de Autor © 2015 de Fang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los proyectos científicos y tecnológicos de Cooperación Internacional de china (http://www.istcp.org.cn/) (Grant No. . 2012DFA30410 a Xiujun Cai), y de la Ciencia-tecnología Nacional de Apoyo proyectos del plan de china (http://www.most.gov.cn/) (Grant No. 2012BAI14B06 a Xiujun Cai): perfil
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
a pesar de una mayor conciencia general, el cáncer colorrectal sigue siendo una de las tres principales causas de mortalidad tumores malignos relacionados con el mundo [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal en la etapa temprana (estadio TNM I y II) se puede tratar eficazmente con resección quirúrgica y las tasas de supervivencia a 5 años para las primeras etapas de cáncer es hasta un 95% (fase I) y 60-80 % (etapa II), respectivamente. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico en el estadio avanzado (estadio TNM III y IV) son por lo general refractarios a las terapias existentes y tienen muy mal pronóstico ya que las tasas de supervivencia a 5 años bajan drásticamente al 35% con afectación de los ganglios linfáticos (estadio III ) y al 10% cuando la enfermedad se ha diseminado a órganos distantes (estadio IV) [2-5]. Por lo tanto, la formación de metástasis es el determinante y el evento más letal durante este curso de la enfermedad. De hecho, la metástasis tumoral es un proceso biológico complejo que implica la angiogénesis del tumor primario, invasión de células de cáncer, intravasación vascular /linfático, distante extravasación órgano diana, y el crecimiento de células invadida en microambiente exterior para formar la colonización metastásica [6-8]. Aunque la desregulación de las vías de señalización y la disfunción de muchas moléculas se han identificado en la metástasis del cáncer, no pueden explicar completamente el fenómeno de la metástasis del cáncer de colon [2]. Por lo tanto, es de gran importancia para descubrir los mecanismos biológicos metástasis subyacente en el cáncer colorrectal y formular estrategias para intervenir en este proceso.
epitelial-mesenquimal transición (EMT) se conoce como un mecanismo crucial en la metástasis del cáncer colorrectal y un regulador clave de la formación de órganos distantes [9-11]. Durante el proceso de EMT, derivado del epitelio células tumorales pérdida de la adhesión celular y la polaridad, y el aumento de las propiedades migratorias y invasivos, lo que resulta en que permite que las células tumorales se infiltran en los tejidos circundantes, y la concesión de licencias de este modo estas células para producir metástasis en tejidos distantes [9, 12 ]. A nivel molecular, E-cadherina es el marcador molecular mejor caracterizado de EMT. La pérdida de expresión de E-cadherina se conoce como la característica más predominante de EMT [13-15]. E-cadherina, codificada por el gen CDH1 que se encuentra en el cromosoma 16q22 [16], es una glicoproteína transmembrana confinada a las células epiteliales y es principalmente responsable de las uniones intercelulares de adherencia [17]. Muchos factores de transcripción, como el caracol, ZEB1, ZEB2, FOXC2, Slug, Twist se han demostrado causar directa o indirectamente la represión de la E-cadherina actividad promotora [18-21]. Además, se encontró que la pérdida o reducción de la expresión de E-cadherina para permitir o acelerar la invasión y la metástasis, y por lo tanto sugerido como un posible factor pronóstico en el cáncer colorrectal [22-25].
La ciclina B1, asignada a humanos cromosoma 5q12, se conoce como una ciclina mitótica debido a su papel clave en la modulación de G2 progresión de la fase /M del ciclo celular, y participa en el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, y la metástasis en diversos tipos de cáncer [26-29]. Hasta el momento, el aumento de expresión de la ciclina B1 se ha informado en mama, próstata, esófago, pulmón, colon, y cánceres gástricos [30-36]. En nuestro estudio anterior, también encontramos la sobreexpresión de ciclina B1 promueve la proliferación celular y el crecimiento tumoral en el cáncer colorrectal humano [37]. Sin embargo, la ausencia de relevancia pronóstica o pronóstico favorable de ciclina B1 también se observó en el cáncer colorrectal, linfoma y tumor neuroendocrino de páncreas [35, 38, 39]. Estas discrepancias indican un mayor estudio que se necesita.
En este estudio, para dilucidar si y cómo ciclina B1 participa en la invasión celular y la metástasis en el cáncer colorrectal, que inicialmente se evaluó la expresión de ciclina B1 en 150 pares de cáncer colorrectal y colorrectal tejidos no tumorales adyacentes que concuerden, analizaron su correlación con las características clínico-patológicas. Curiosamente, encontramos que la sobreexpresión de ciclina B1 en el cáncer colorrectal se correlaciona negativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, estadios TNM, y la supervivencia de los pobres. Nuestro estudio también reveló la inhibición de la ciclina B1 suprimió la expresión de E-cadherina, y posteriormente se llevó a la inducción de la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal. Estos hallazgos no sólo asociado de la ciclina B1 con metástasis en el cáncer colorrectal, sino que también proporcionan un objetivo prometedor para el tratamiento de los pacientes en etapas avanzadas de cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
colorrectal tejidos normales adyacentes tumorales y emparejados se obtuvieron de 150 pacientes que se sometieron a cirugía en el hospital Sir Run Run Shaw, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, china), entre abril de 2005 y junio de 2009. en particular, los tejidos normales adyacentes se tomaron & gt; 5 cm lateralmente desde el borde de la región cancerosas. Ninguno de estos pacientes habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la operación. El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético Sir Run Run Shaw Hospital de Investigación y todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado por escrito (S1 figura). Todas las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después de la resección quirúrgica y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
La información clínica de estos pacientes, incluyendo edad, sexo, estado de diferenciación, localización del tumor, el tamaño del tumor, la metástasis de ganglios linfáticos , metástasis a distancia, y el estadio TNM, se recogió y se muestran en la Tabla S1. Los pacientes fueron seguidos una vez cada 3 meses durante al menos 5 años después de la operación. Todos los pacientes fueron contactados por teléfono o cartas cuestionario para comprobar sobre su estado de salud. La muerte de los pacientes se determinó mediante informe de su familia.
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. cDNA fue sintetizado a partir de 2 ug de ARN total usando PrimeScript RT kit de reactivos (Takara) y se amplificó con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara) en el sistema ABI 7500HT (ABI). El cebador de la ciclina B1 se mostró anteriormente [37]. GAPDH se utilizó como control interno. la cuantificación relativa de la expresión del ARNm se calculó con la 2
-ΔCT o 2
-ΔΔCT método.
Cultivo de células y transfección
El humano líneas celulares de cáncer colorrectal p53
+ /+ HCT116, p53
- /- HCT116 y SW480 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. p53
+ /+ HCT116 y p53
- /- células HCT116 se cultivaron en medio completo 5A de McCoy (Gibco). Las células SW480 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS (Gibco). Todas las tres líneas celulares se cultivaron en una cámara humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C.
siRNA contra la ciclina B1 y el control negativo siRNA se sintetizaron por bioneer. Las células fueron transfectadas transitoriamente con siRNA utilizando reactivos de transfección basados en lípidos DharmaFECT1 (Dharmacon) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El nivel de eficiencia de transfección y la transfección de siRNA ciclina B1 se determinó previamente [37].
La migración de células de ensayo
24 h después de la transfección, 1 × 10
5 células cancerosas tratadas en 200 l de medio libre de suero se añadieron a la parte superior de la Transwells (tamaño de poro 8-m; Costar). Las cámaras inferiores se rellenaron con medio suplementado con 10% de FBS y se incubaron a 37 ° C /5% de CO
2 hasta que el tiempo de detección (24h para p53
+ /+ HCT116, 36h para p53
- /- HCT116, y 36h para SW480, respectivamente). Las células en la parte inferior de la membrana se fijaron, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, y se contaron cinco campos microscópicos (independientes con una ampliación de 20 veces). Los ensayos se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces independientes.
invasión de la célula de ensayo
Se utilizó un tamaño de poro de 24 pocillos transwell placa (8-m revestido con matrigel (BD Biosciences) para medir la célula capacidad de invasión. 24 horas después de la transfección, 1 × 10
se resuspendieron 5 células en medio libre de suero y se añadieron a la cámara superior. se utilizó el medio suplementado con 10% de FBS como quimioatrayente a la cámara inferior antes del examen. las células se incubaron a 37 ° C durante el tiempo indicado (30h para p53
+ /+ HCT116, 42h para p53
- /- HCT116, y 48h para SW480, respectivamente). las células de la superficie superior se rasparon con hisopos de algodón y lavados, mientras que se fijaron las células invadidas en la superficie inferior, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 1 h, y se cuantificaron mediante la determinación del número de células en cinco campos visuales randmonly elegidos ensayos fue realizada por duplicado y se repitió tres veces independientes.
análisis de transferencia Western
Las células y se lisaron en tampón RIPA que contiene inhibidor de la proteasa (Pierce). La concentración de proteína se determinó con el kit de ensayo BCA, y la igualdad de cantidad de proteína se sometieron a electroforesis en 10% de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se transfirieron a membrances de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Millipore). Después del bloqueo para la unión no específica, la membrana se incubó con anticuerpos primarios específicos contra la ciclina B1 (1: 2000; Epitomics), E-cadherina (1: 1000; Abcam), y GAPDH (1: 2000; Santa Cruz) durante la noche a 4 ° C, y después se lavó tres veces con solución salina tamponada con Tris y Tween 20, seguido incubaron con el rábano picante apropiada anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP, Dawen Biotec) durante 1 hora a temperatura ambiente. La expresión de la proteína finalmente fue visualizado utilizando detección de quimioluminiscencia (ECL, Biological Industries). Intensidades de las señales de expresión de proteínas se cuantificarán mediante análisis densitométrico con un software Cantidad (Bio-Rad), y los valores resultantes de la proteína se normalizaron a los controles de carga correspondientes.
La inmunohistoquímica
Anti se utilizó anticuerpo -E-cadherina (Epitomics) para IHC tinción de los tumores de xenoinjertos. IHC se llevó a cabo como se describe anteriormente [37].
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión estándar de 21.0 (SPSS Inc) y GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Diferencia entre los grupos en muestras de tejidos fue evaluada por el no paramétrico de Mann-Whitney
T
prueba. Cuantificación relativa de la expresión de ciclina B1 se calculó con la 2
-ΔCT o 2
-ΔΔCT método (Ct = ciclina B1 (CT) -GAPDH (CT); ΔΔCT = Ct (tumor) - Ct (Normal)) , y los datos se presentan como media ± SEM. log-rank pruebas de Kaplan-Meier y se utilizaron para evaluar la supervivencia global del paciente (OS) y para crear curvas de supervivencia en base a los niveles altos y bajos ciclina B1 (como se define por la curva ROC). El análisis de supervivencia univariante y multivariante se realizaron con el modelo de regresión de Cox. Todos los experimentos in vitro se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces. Para la in vitro e in vivo en experimentos con animales, se evaluó la diferencia entre dos grupos de Student utilizando
t-test
, y los datos se presentan como media ± desviación estándar. Valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
ciclina B1 sobreexpresión se correlaciona negativamente con matastasis de los ganglios linfáticos, metástasis a distancia y el estadio TNM avanzada en tejidos de cáncer colorrectal humano
Para identificar el papel potencial de la ciclina B1 en la metástasis del cáncer colorrectal, se examinó la expresión de ciclina B1 en 150 pares de cánceres colorrectales y tejidos no tumorales colorrectales adyacentes emparejados utilizando QRT-PCR. Ciclina B1 mRNA se sobreexpresa en 139/150 (92,7%) pares, con un aumento de la media veces el cambio de 5,30 en tejidos de cáncer. Estamos, además, que la expresión relativa media de ciclina B1 fue mucho menor en los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos que en pacientes sin metástasis (
P = 0,011
) (Figura 1B). En los pacientes con metástasis a distancia, el nivel de ciclina B1 también fue significativamente menor que en los pacientes sin metástasis a distancia (
P
= 0,021) (Fig 1C). Como se muestra en la Tabla 1, la asociación entre el nivel de ciclina B1 y las características clinicopatológicas mostró la expresión de ciclina B1 se correlacionó negativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, y el estadio TNM avanzada (
P
= 0,007) (Figura 1D ) en pacientes con cáncer colorrectal. Sin embargo, no se encontró una asociación significativa entre la expresión de ciclina B1 y otras características clínico-patológicas, tales como la edad del paciente, sexo, localización del tumor, el tamaño del tumor y la diferenciación (todos los
P Hotel & gt; 0,05). Por otra parte, también confirmamos el nivel de proteína de la ciclina B1 en 30 muestras de tejidos clínicos, incluidos los 10 tejidos normales colorrectales, 10 tejidos de cáncer colorrectal sin metástasis, y 10 tejidos de cáncer con metástasis por Western blot. Obtuvimos resultado consistente con el resultado nivel de ARN. proteína ciclina B1 se sobreexpresa en tejidos de cáncer colorrectal sin metástasis, en comparación con los tejidos de colon normales (
P
= 5,51 × 10
-5), mientras que el nivel de proteína ciclina B1 disminuyó significativamente en tejidos de cáncer colorrectal con metástasis, en comparación con aquellos sin metástasis (
P
= 0,012) (Fig 1E). Estos datos ponen de manifiesto que la expresión de ciclina B1 se asoció inversamente con la metástasis del cáncer colorrectal.
expresión (A) La ciclina B1 mRNA fue probada usando QRT-PCR en 150 pares de tejidos de cáncer colorrectal humano y tejidos no tumorales adyacentes. Alteraciones en la expresión se muestran como diagramas de dispersión, con el eje y indica la expresión de ciclina B1. Su expresión se normalizó al nivel de expresión de GAPDH en cada muestra. Los datos se presentan como media ± SEM. ***
P & lt; 0,001
. (B) Análisis de QRT-PCR de la expresión de ciclina B1 en pacientes con cáncer colorrectal con o sin metástasis en los ganglios linfáticos. Los datos se representan como un 2
-ΔΔCT (tumor /normal). *
P Hotel & lt; 0.05. (C) El análisis estadístico de nivel relativo de expresión de ciclina B1 en tejidos de cáncer colorrectal con o sin metástasis a distancia. Los datos se presentan como media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0.05. (D) Evaluación de nivel relativo de expresión de ciclina B1 en tejidos de cáncer colorrectal de estadio TNM I, II, III, y IV. Los datos se presentan como media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; NS: no significativo. (E) de validación de transferencia de Western de la ciclina B1 nivel de proteína en los tejidos normales de colon (N) y tejidos de cáncer colorrectal (CA) con metástasis (M +) y sin (M-). GAPDH se aplicó para la normalización. La intensidad relativa de la proteína ciclina B1 se muestra en los siguientes gráficos de barras. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. ***
P Hotel & lt; 0.001. *
P Hotel & lt; 0.05.
expresión de ciclina B1 se asocia negativamente con la disminución de la supervivencia en el cáncer colorrectal
Para evaluar el potencial pronóstico de la ciclina B1 en el cáncer colorrectal, se analizó la asociación entre la ciclina expresión B1 y duración de la supervivencia mediante el análisis de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank. Inicialmente se trazó la curva de eficacia diagnóstica (ROC) para la ciclina B1 (Figura 2A). De acuerdo con el índice de Youden máxima, el valor de corte óptimo para la expresión de ciclina B1 fue de 3,33 veces en el tumor /no tumoral. A continuación, los 150 pacientes con cáncer colorrectal se dividieron en dos grupos: el grupo expresión B1 alta Ciclina (n = 88) que la ciclina ratio de expresión B1 ≥ 3,33, y el grupo expresión B1 bajo Ciclina (n = 62) que la ciclina ratio de expresión B1 & lt; 3,33, de acuerdo con el nivel de corte (Fig 2B). De Kaplan-Meier análisis de estimación reveló una correlación entre el nivel de expresión de ciclina B1 y los tiempos de supervivencia global. Los pacientes con un bajo nivel de ciclina B1 tenían una tasa de supervivencia obviamente menor que aquellos con un alto nivel de expresión de ciclina B1 (
P
= 0,002) (Figura 2C).
(A) La nivel óptimo de corte de ciclina B1 expresión relativa se determina en base a la mayor de sensibilidad y especificidad por el receptor de funcionamiento característico análisis curva (ROC) para la supervivencia global. Área bajo la curva (AUC) de ROC fue de 0,90. (B) De acuerdo con el valor de corte óptimo (3,33 veces), 150 pacientes con cáncer colorrectal se dividieron en dos grupos: ≥ 3,33 fueron considerados como un grupo elevada expresión de ciclina B1 (n = 88); & Lt; 3,33 fueron considerados como un grupo de baja expresión de ciclina B1 (n = 62). análisis de supervivencia (C) de Kaplan-Meier según la expresión de ciclina B1 en pacientes con cáncer colorrectal (log-rank test). (D) Acumulativo curvas de supervivencia global de los pacientes con altos o bajos niveles de expresión de ciclina B1 mediante análisis multivariante.
Para determinar si la expresión de ciclina B1 es un indicador independiente de survical general para los pacientes con cáncer colorrectal, primero se utiliza un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante para estimar el índice de riesgo individual para todas las características clínico-patológicas. Los resultados revelaron que la supervivencia global fue significally relacionada con el nivel de expresión de ciclina B1 (RR = 2,062; IC del 95%, 1,273-3,340; p = 0,003) y otros cuatro parámetros (tamaño tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, y por etapas TNM ; todo
P Hotel & lt; 0,05). Sin embargo, en el análisis multivariante, la Cox de riesgos proporcionales incluyendo la expresión de ciclina B1, el tamaño del tumor, metástasis ganglionar y metástasis a distancia, el tamaño del tumor identificado, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis distantes como los indicadores pronósticos independientes para la tasa de supervivencia global de los pacientes con cáncer colorrectal (HR: 0,564, P = 0,022; HR: 0,205, P = 2,0 × 10
-8; HR: 0,148, P = 1,0 × 10
-6, respectivamente), pero no la expresión de ciclina B1 (p = 0,45) (Fig 2D). Los valores estadísticos de la expresión de ciclina B1 y otras características clinicopatológicas derivadas del modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se muestran en la Tabla 2.
represión de ciclina B1 facilitó capacidad migratoria en diferentes células de cáncer colorrectal
las anteriores observaciones nos llevó a explorar el potencial de la función biológica de la ciclina B1 desregulación en la progresión del cáncer colorrectal. La capacidad de una célula tumoral a someterse a la migración permitió que cambie la posición dentro de los tejidos, y este proceso permite que las células tumorales salgan de su tumor primario [40]. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la ciclina B1 sobre la migración en las células del cáncer colorrectal mediante ensayo Transwell. Tres líneas celulares de cáncer colorrectal, p53
+ /+ HCT116, p53
- /- HCT116 y SW480 fueron transfectadas con siRNA específico Ciclina B1 o control negativo siRNA, respectivamente, como se informó anteriormente. Los resultados demostraron que la inhibición de la ciclina B1 forma destacada mejora la capacidad migratoria de las células p53
+ /+ HCT116 por 127% (p = 1,45 × 10
-5) (Fig 3A). Del mismo modo, la capacidad de migración de p53
- /- HCT116 también se incrementó notablemente por 193% (p = 3,30 × 10
-8) (Fig 3B) después de la supresión de la expresión de ciclina B1. Por otra parte, la actividad de migración en las células SW480 transfectadas con siRNA Ciclina B1 aumentó significativamente por 155% (p = 2,85 × 10
-6) (figura 3C), en comparación con las células de control. Estos datos indican Ciclina B1 ejerce una función de migración de supresión en células de cáncer colorrectal humano y este efecto es independiente del tipo de células
.
(A, B, C) Transwell ensayos de migración de p53
+ /+ HCT116 , p53
- se llevaron a cabo HCT116 y SW480 células después de transfección con la ciclina B1 o siRNA control negativo, respectivamente - /. Se muestran imágenes representativas de ensayo de migración. En todos los paneles, los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. NC, control negativo siRNA. Los datos representan la media de tres experimentos independientes ± SD. ***
P & lt; 0,001
Desmontables de ciclina B1 promueve la invasión de células de cáncer colorrectal
invasión celular es un proceso celular intrínseca mediante el cual las células responden a extracelular. estímulos para moverse a través y degradan la matriz extracelular (ECM). En el cáncer, la invasión de células de cáncer permite que las células adquieran la capacidad de entrar linfáticos y /o los vasos sanguíneos para su difusión en la circulación, seguido por la invasión a órganos distantes para el crecimiento metastásico [8, 40]. Para investigar el efecto potencial de la ciclina B1 en la invasión de células en células de cáncer colorrectal, se utilizó el ensayo de invasión de Matrigel para la detección. Se encontró que el agotamiento de la ciclina B1 dio lugar a un aumento de 1,82 veces y 1,72 veces en el número de células invasoras en tanto p53
+ /+ HCT116 y p53
- /- células HCT116 (p = 6,88 × 10
-6; p = 6,70 × 10
-6, respectivamente) (Fig 4A y 4B). Del mismo modo, la inhibición de la ciclina B1 también aumentó la actividad de invasión de células SW480 de 4,47 veces (p = 2,07 × 10
-7) (Fig 4C). En conjunto, estos resultados sugieren Ciclina B1 inhibe la invasión de células de cáncer colorrectal.
(A, B, C) El efecto de la ciclina B1 en la invasión de células se detectó en tres líneas celulares de cáncer colorrectal, p53
+ /+ HCT116, p53
- /- HCT116, y células SW480, utilizando transwell ensayos de cámara. Las cámaras se recubrieron con matrigel, que funciona como matriz celular extracelular. se muestran imágenes representativas de células invadidas. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Las barras de error representan SD. ***
P. & Lt; 0,001
La inhibición de la ciclina B1 disminuye el nivel de E-cadherina en líneas celulares de cáncer colorrectal
Dado que la ciclina B1 negativamente correlacionada con la migración de células de cáncer colorrectal mejorada y la invasión, se examinó si la EMT es un mecanismo subyacente. La desregulación de E-cadherina ha sido considerada como la molécula crítica importante en la metástasis de células cancerosas mediada por EMT. Aquí, hemos explorado el papel de la ciclina B1 en la regulación de la expresión de E-cadherina en las tres líneas celulares de cáncer colorrectal anteriores. Fig 5A y 5B tanto mostraron que la ciclina B1 siRNA transfección en p53
+ /+ HCT116 y p53
- /- HCT116 disminuyó fuertemente E-cadherina nivel de expresión de proteína, respectivamente (p = 0,038; p = 0,011, respectivamente) . También, en Ciclina B1 siRNA-tratada SW480 células, expresión de la proteína E-cadherina se redujo obviamente en comparación con la expresión en células negativas de control transfectadas (p = 0,0006) (Fig 5C). Nuestros datos indican que la inhibición mediada por ciclina B1 de la invasión de células se puede producir a través de la regulación de la expresión de E-cadherina.
(A, B, C) 72 horas después de la transfección con 50 nM de la ciclina B1 o siRNA control negativo siRNA, el los niveles de proteína endógenos de cadherina e y la ciclina B1 en p53
+ /+ HCT116, p53
- /- HCT116 y SW480 células se analizaron por Western Blot y cuantificados. Las barras muestran los niveles de proteína relativos que se normalizan a GAPDH. Los datos representan la media de tres experimentos independientes ± SD. *
P & lt; 0,05
; ***
P & lt; 0,001
La inhibición de la ciclina B1 disminuir la expresión de cadherina E in vivo
Para determinar si la ciclina B1 altera la expresión de E-cadherina. in vivo, se evaluó la expresión de E-cadherina en nuestros anteriores modelos de xenoinjertos de tumores [37] por tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en la figura 6A, el nivel de E-cadherina se redujo significativamente en Ciclina B1 de supresión de p53 tumores
+ /+ HCT116, en comparación con los tumores de control no supresora de ciclina B1. Del mismo modo, la proteína E-cadherina fue también obviamente downregulated en ciclina B1-supresión SW480 tumores, en comparación con los tumores de control (Fig 6B). Estos datos sugieren aún más el efecto de la ciclina B1 sobre la expresión de E-cadherina
(A) Imágenes (x200; x400). Que representan la tinción inmunohistoquímica de E-cadherina en p53
+ /+ tumores HCT116 que expresan ciclina B1 shRNA o el control de vectores. (B) Representar imágenes (x200; x400). De E-cadherina en los tumores que expresan SW480 ciclina B1 shRNA o el control de vectores
Discusión
Las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer colorrectal se deben a las complicaciones derivadas de la metástasis. De acuerdo con las estadísticas de cáncer, se espera que aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer colorrectal para desarrollar metástasis. Aunque varios abordaje de la para el tratamiento se han desarrollado recientemente para el cáncer colorrectal, los pacientes con cáncer colorrectal avanzado o metastásico todavía tienen mal pronóstico. En este estudio, hemos demostrado que la ciclina B1 suprime la invasión del cáncer colorrectal y metástasis mediante la regulación de la expresión de E-cadherina.
La regulación de la progresión del ciclo celular ordenado es esencial para las células para mantener la integridad genómica que es vital para la supervivencia celular y controlada la proliferación. Las ciclinas son una familia de proteínas que varían en sus niveles de expresión durante el ciclo celular para activar sus quinasas específicas dependientes de ciclina necesarios para la progresión a través del ciclo celular. Entre ellos, la ciclina B1 es de interés primordial porque se creía originalmente que la ciclina B1 controlado puesto de control de fase G2-M y se regula el inicio correcto de la mitosis, que son ambas esenciales para la síntesis de ADN y la proliferación celular. evidencias acumuladas han mostrado que la ciclina B1 se sobreexpresa en el cáncer de mama, carcinoma de células escamosas de esófago, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer hepatocelular, y otras células del cáncer [31, 32, 41-43]. La evidencia estadística sugiere que la ciclina B1 se relaciona con malignidad del tumor. Además, la sobreexpresión de la ciclina B1 se ha identificado como un pobre marcador pronóstico prometedora en pacientes con cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y de cabeza-cuello carcinoma de células escamosas [32, 34, 43]. Sin embargo, Chae et al. [44] informó de que la expresión de ciclina B1 no tuvo influencia en la supervivencia de pacientes con cáncer de mama. Bjorck et al. [38] informó de que los pacientes con linfoma folicular que expresan un mayor nivel de ciclina B1 mostraron un mejor resultado después de la quimioterapia, en comparación con los pacientes que expresan el nivel inferior de la ciclina B1. Estos resultados discordantes pueden ser explicadas por el patrón de expresión diferente de la ciclina B1 en diferentes tipos de tumores. Hemos determinado anteriormente que la ciclina B1 se sobreexpresa e importante para la proliferación celular y el crecimiento tumoral a través de la promoción de la progresión del ciclo celular y /o la reducción de la apoptosis en células de cáncer de colon [37]. Sin embargo, el papel y el mecanismo de ciclina B1 en la metástasis del cáncer colorrectal no ha sido bien estudiado.
En este estudio, encontramos nivel de expresión de ciclina B1 en tejidos de cáncer colorrectal fue también superior a la de los tejidos nomal en un gran grupo de 150 pacientes, de acuerdo con nuestros datos anteriores. Sin embargo, la sobreexpresión de ciclina B1 se correlacionó negativamente con las características clínico-agresivos, tales como metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, y el estadio TNM. Los pacientes que tenían una baja expresión de la ciclina B1 fueron notablemente pobre supervivencia global en comparación con los pacientes que tenían una alta expresión de ciclina B1. El análisis univariante demostró que la ciclina B1 era un indicador pronóstico para la supervivencia global en pacientes con cáncer colorrectal, aunque el análisis multivariante mostró Cylcin B1 no era un factor pronóstico independiente. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran claramente que el bajo nivel de ciclina B1 se asocia con un mal pronóstico y la evolución clínica desfavorable de cáncer colorrectal. Sin embargo, nuestros resultados no están de acuerdo con otros dos estudios [35, 45]. Heike et al. mostró sobreexpresión de ciclina B1 era ni asocia con las características histopatológicas del tumor ni mal pronóstico en el cáncer colorrectal, mientras que Jia-Qing et al. puesto de manifiesto la sobreexpresión de ciclina B1 se intensificó durante la carcinogénesis, pero disminuyó durante la invasión, y luego volvió a aumentar durante la metástasis en el cáncer colorrectal.
Para apoyar aún más nuestra noción, el papel y el mecanismo de ciclina B1 en la metástasis fueron detectados en diferentes cáncer colorrectal modelos de células, p53
+ /+ HCT116, p53
- /- HCT116 y SW480. Proporcionamos evidencia de que desmontables de la expresión de ciclina B1 inducidos más células se infiltren a través de la matrigel y transwell membrance en las tres líneas celulares de cáncer, lo que demuestra que la ciclina B1 suprime la metástasis del cáncer colorrectal mediante la regulación negativa de migración celular y la invasión. EMT había sido implicado como el paso clave en la progresión de los tumores hacia la invasión y metástasis [9]. E-cadherina era una molécula de adhesión célula-célula conocida, que se formó epiteliales uniones adherentes y secuestrado CTNNB1. En los cambios de la EMT, la supresión de la E-cadherina es un paso crucial en la progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal [15, 46]. Será de especial importancia para explorar el mecanismo subyacente que da lugar a la supresión de la E-cadherina. A pesar de muchas moléculas han sido identificadas para modular la expresión de E-cadherina [17, 47, 48], aún se necesitan más estudios para dilucidar las moléculas de señalización importantes para la regulación de la E-cadherina. Aquí, hemos demostrado que la ciclina B1 participó en la regulación de la expresión de E-cadherina. La inhibición de la ciclina B1 downregulated proteína E-cadherina en p53
+ /+ HCT116, p53
- células HCT116 y SW480 - /.