Extracto
El cáncer de próstata es el tumor maligno no dermatológica más común en los hombres en el mundo occidental. Recientemente, una aberración cromosómica frecuente fusión de andrógenos regulado
TMPRSS2
promotor y el gen
ERG gratis (
TMPRSS2 /ERG
) fue descubierto en el cáncer de próstata. Varios estudios demostraron la cooperación entre los
TMPRSS2 /ERG
y otras vías defectuosas en la progresión del cáncer. Sin embargo, el descubrimiento de las vías más específicas en las que
TMPRSS2 /ERG
participa, requiere más investigación. El uso de células epiteliales de la próstata inmortalizada hemos sido capaces de demostrar que
TMPRSS2 /ERG
sobre-expresión de las células se someten a un epitelial a mesenquimal transición (EMT), que se manifiesta por la adquisición de la morfología y los marcadores mesenquimales, así como capacidades de migración e invasión. Estos hallazgos fueron corroborados
in vivo
, donde las células de control dieron lugar a nódulos discretos, mientras que el
TMPRSS2 /ERG
ha células formadas tumores malignos, que expresan marcadores de EMT expresando. Para investigar más a fondo el esquema general de transcripción inducida por
TMPRSS2 /ERG
, las células se sometieron a un análisis de microarrays reveló que la expresión de un programa EMT distintas, incluyendo la regulación de los facilitadores de la EMT,
ZEB1
y
ZEB2, España y la baja regulación del marcador epitelial
CDH1 gratis (e-cadherina). Un ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina reveló la unión directa de
TMPRSS2 /ERG
al promotor de
ZEB1
pero no
ZEB2
. Sin embargo,
TMPRSS2 /ERG
fue capaz de obligar a los promotores de los
ZEB2
moduladores,
IL1R2
y
SPINT1
. Este conjunto de experimentos se ilumina aún más el mecanismo por el cual el
TMPRSS2 /ERG sobre Fusion afecta a la progresión del cáncer de próstata y podría ayudar a centrar la
TMPRSS2 /ERG
y de los objetivos en los futuros esfuerzos de diseño de fármacos.
Visto: Lesem O, S Madar, Kogan-Sakin I, Habitaciones Habitación I, Goldstein I, Brosh R, et al. (2011)
TMPRSS2 /ERG
Promueve epitelial a mesenquimal de transición a través de la
ZEB1
/
ZEB2
Eje en un modelo de cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (7): e21650. doi: 10.1371 /journal.pone.0021650
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Enero, 2011; Aceptado: 4 Junio 2011; Publicado: 1 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Lesem et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación el apoyo de una beca del Centro de Excelencia del asistente de vuelo Instituto de Investigación médica (FAMRI), EC FP6-CT-2004-503576 LSHC, el Centro de Abraham Yad para el cáncer de Diagnóstico y Terapia y la Fundación Ridgefield, programa de Grant "Talpiot" para el liderazgo médica en el Centro Médico Sheba, y la Asociación del cáncer de Israel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más frecuentes en los hombres. Se espera que cerca de 30.000 pacientes de morir de la enfermedad en los EE.UU. cada año. Un gran avance en este campo de investigación es un descubrimiento reciente que frecuentan sobre-expresión de E veintiséis (ETS) relacionados con la PI proto-oncogenes pueden ser impulsados por los receptores de andrógenos como consecuencia de reordenamientos genómicos comunes. La forma predominante de las fusiones antes mencionadas con una frecuencia de ~ 85% [1], es la fusión entre el exón 1 de TMPRSS2 y exones 4-9 de la
ERG
gen, que se produce ya sea por una deleción de 3 bases Mega región que separa estos genes [2], o por medio de una translocación interchromosomal [3], [4]. Como esta fusión es ya evidente en la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) [5], la investigación de esta fusión puede ser la clave para comprender los mecanismos implicados en fases tempranas del cáncer de próstata.
Desde su descubrimiento [6], la
TMPRSS2 /ERG sobre fusion ha sido ampliamente estudiado en varios aspectos, incluyendo el diagnóstico precoz, el pronóstico, la contribución a la progresión del cáncer e incluso como un objetivo para la terapia del cáncer [7]. Según los estudios clínicos a largo plazo realizados en una gran cohorte de pacientes, parece que
TMPRSS2 /ERG
expresión se asocia con una forma más agresiva de cáncer de próstata [8], [9]. Otros estudios han demostrado un papel para
TMPRSS2 /ERG sobre Fusion en la tumorigénesis en términos de proliferación, la invasión y la iniciación y progresión del cáncer [10], [11], [12], [13]. En general, parece que la proliferación celular no es necesariamente promovida a través de
TMPRSS2 /ERG
expresión. En cuanto a la tumorigénesis, los datos no son concluyentes. Mientras que golpear hacia abajo endógena de
TMPRSS2 /ERG Hoteles en las células de cáncer de próstata derivadas de VCAP dio lugar a una reducción tanto de la captación tumoral y el volumen [13], [14], los ratones transgénicos que albergan
TMPRSS2 /ERG
en su genoma, ya sea desarrollada PIN [10], [15] o no revelan la presencia histológica de PIN o cáncer invasivo [11], [16]; dependiendo del modelo específico utilizado en el estudio y la interpretación de los datos. A pesar del desacuerdo sobre el papel de
TMPRSS2 /ERG Hoteles en la iniciación del cáncer, la invasión de células se sugirió a ser una consecuencia de
TMPRSS2 /ERG sobre Fusion tanto
in vitro y en
in vivo
[10], [13], [15]. Curiosamente, un
in silico
estudio reveló que
TMPRSS2 /ERG
co-expresada con la histona deacetilasa 1 (HDAC1) está acoplado con la regulación a la baja de su objetivo conocido [17]. Este hallazgo implica que
TMPRSS2 /ERG
se asocia con la reprogramación epigenética. De acuerdo con ello, en un estudio de seguimiento realizado por el mismo grupo, los inhibidores específicos HDACi, y HDAC, comprometidas TMPRSS2
/ERG
expresión o actividad en las células positivas ERG,
in vitro
[17] , [18]. Además, los recientes hallazgos demostraron una cooperación entre la fusión TMPRSS2 /ERG y la actividad desregulada de las vías relacionadas con el cáncer, tales como PTEN [19], PI3-quinasa [16], y AKT o AR [20]. Más recientemente, TMPRSS2 /ERG se demostró para mediar epitelial a mesenquimal transición (EMT) a través de la inducción de la señalización de Wnt componentes [21]. En conjunto, se podría suponer que otro
TMPRSS2 /ERG
vías mediadas, podrían converger en el mismo punto final, a saber, EMT y la invasión; y por lo tanto el descubrimiento de nuevas vías por las que
TMPRSS2 /ERG
ejercer este efecto es de gran importancia. Por lo tanto, la motivación principal de este estudio es desentrañar tales vías
TMPRSS2 /ERG
relacionados en el contexto del cáncer de próstata. En un trabajo anterior hemos establecido un día inmortalizados y células epiteliales de próstata humanas tumorigénicas (PrECs) líneas de constitución genética definida [22]. PrECs Del mismo modo, en el estudio presentado, hemos generado genéticamente modificado para servir como un fondo en el que los efectos de la
TMPRSS2 /ERG sobre Fusion podrían realmente estudiados. Se encontró que TMPRSS2 /ERG ejecuta un programa de EMT expresión distinta que se rige principalmente por una activación directa de los
ZEB1 Opiniones y una inducción indirecta de
ZEB2
través de
SPINT1
y
IL1R2
modulación, dando lugar a un fenotipo EMT
e in vitro
in vivo
.
Resultados
Establecimiento de cultivos PrECs inmortalizadas
con el fin de investigar el impacto de
TMPRSS2 /ERG
en un entorno modificado genéticamente hemos tratado de establecer una cultura PrECs inmortalizado. células epiteliales normales de la próstata se producen a partir de una pieza de prostatectomía humanos y posteriormente se cultivaron en cultivo. Para inducir inmortalización, se introdujeron las células con la telomerasa catalítica hTERT subunidad, y tanto el p53 y vías pRB se perturbados por caída p53 y la sobre expresión de CyclinD /CDK4 quimera, respectivamente, dando lugar a una línea celular inmortal designado como EP (Figura 1A y B). A continuación, las células inmortalizadas se infectaron con retrovirus que codifica ya sea
TMPRSS2 /ERG
o control vacío-vector (Figura 1C). nivel de proteína ERG era comparable con su nivel de expresión ya se ha informado en líneas celulares y muestras de cáncer [23], [24]. Notablemente,
TMPRSS2 /ERG
solo o en combinación con hTERT y /o desmontables p53 no era suficiente para inducir inmortalización (datos no mostrados). Por último, a raíz de un informe anterior de que la combinación de receptor de andrógenos (AR) y altos niveles de ERG promueve el desarrollo de un adenocarcinoma más pobremente diferenciado, invasivo que cualquiera de los genes [20]; AR se introdujo en el
TMPRSS2 /ERG
expresando células, así como en sus controles de vacío en vectores (Figura 1C).
Para inducir la inmortalización, se introdujeron células con la telomerasa catalítica hTERT subunidad y tanto el p53 y pRB vías fueron perturbados usando desmontables p53 y la sobre expresión de cyclinD /CDK4, respectivamente. (B) Primary PrECs, así como hTERT /shp53 /CyclinD-CDK4 - células que sobreexpresan (células EP), se pasaron y se contaron secuencialmente. Duplicaciones de la población (PDL) se calcularon utilizando la fórmula: PDL = log (salida de la célula /cellinput) /log2. Se introdujeron células EP (C) con AR y, o bien
TMPRSS2 /ERG gratis (EP-AR TMPRSS2 /ERG) o un vector vacío (EP-AR). los niveles de proteína de AR y ERG se midieron mediante transferencia Western. Actina se utilizó como control de carga.
El papel de
TMPRSS2 /ERG Hoteles en transición epitelial a mesenquimal
in vitro
La comparación de la la morfología de la EP-AR y EP-AR
TMPRSS2 /ERG
líneas de células bajo un microscopio de luz, se observó que el documento EP-AR
TMPRSS2 /ERG
células de fibroblasto adquirió características similares, ya que demostraron una morfología más alargada y una densidad de esparcido en comparación con sus controles isogénicas, que exhiben un mayor grado de adherencia entre las células vecinas (Figura 2A). Las alteraciones observadas, que son rasgos característicos de la EMT [25], [26], junto con los informes anteriores asociar
TMPRSS2 /ERG Chat con EMT y la invasión [10], [21], nos llevó a examinar si en Además de los cambios morfológicos, también se otorgaron las células con capacidades motilidad y la invasión. Con este fin, las células fueron sembradas en transwells con medio libre de suero y se evaluó su migración hacia los medios suplementado con suero. Como se muestra en la Figura 2B,
TMPRSS2 /ERG
expresando células mostraron una capacidad migratoria mejorada. El mismo experimento se repitió utilizando pozos matrigel recubierto con el fin de examinar la capacidad de las células para penetrar e invadir una superficie densa. Una vez más, la capacidad de invasión fue significativamente más perceptible en las células
TMPRSS2 /ERG
que expresan (Figura 2C). La pérdida de
CDH1 gratis (E-cadherina) es considerado como el evento más importante durante la EMT [27]. Por lo tanto, medimos los niveles de
CDH1
mRNA y proteína usando QRT-PCR y la tinción de inmunofluorescencia, respectivamente. De hecho, el documento EP-AR
TMPRSS2 /ERG
células demostró una marcada reducción en los niveles de
CDH1
mRNA (Figura 2D) y la proteína (Figura 2E). Además,
VIM gratis (vimentina), se encontró un marcador mesenquimal sabe que es elevado en el
TMPRSS2 /ERG
células que expresan (Figura 2E). En resumen, nuestros datos sugieren que
TMPRSS2 /ERG
sobreexpresión provoca una transición epitelial a mesenquimal
in vitro
.
(A) Para la comparación morfológica, las células fueron fotografiados utilizando una microscopio ligero. (B) Las células se sembraron en cultivos polarizados y su capacidad migratoria hacia FCS se midió contando el número de células que migran. (C) La misma configuración que en (B) se utilizó con cultivos polarizados matrigel recubierto con el fin de comparar la invasividad celular. (D) Las células se analizaron para CDH1 (E-Cadhein) expresión usando QRT-PCR. Los resultados se presentan como media ± SD de un triplicado de un experimento representativo. * Indica una expresión diferencial significativa del gen en comparación con el control. (E) Las células se sembraron en portaobjetos y se tiñeron para CDH1 y vimentina. DAPI se utilizó para visualizar los núcleos. (F) Las células se implantan en glándulas de la próstata murinos. Las glándulas se eliminaron 68 días después de la implantación, se seccionaron y tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) o con anticuerpos contra AR humano, CDH1 y vimentina. (X 400 aumentos). Tenga en cuenta que el documento EP-AR (control) de las células formadas nódulos discretos de próstata (flechas azules), que se tiñen positivamente con el anticuerpo anti-AR específica humana (α-HAR). Por el contrario, los tumores derivados ERG-EP-AR TMPRSS2 /, que se tiñen positivamente con el anticuerpo α-Har envolvieron los nódulos murinos a-Har-negativo (puntas de flecha negras).
El efecto de
TMPRSS2 /ERG
en la tumorigénesis
en un intento de extender la observación anterior a un
in vivo
modelo; o nos inyectamos las líneas de células genéticamente modificadas por vía subcutánea o los implantó de forma ortotópica en la próstata de ratones desnudos. Sesenta y ocho días después de la implantación, los tumores se retiraron, se seccionaron y se tiñeron para los marcadores de EMT. La comparación de los sitios de implantación ortotópico de las líneas celulares distintas reveló que hTERT /shp53 /CDK4-inmortalizado PrECs (células EP) no formar tumores (datos no mostrados), mientras que el documento EP-AR formó nódulos discretos intercaladas en la próstata murino (Figura 2F, indicado por las flechas azules). En particular, el documento EP-AR
TMPRSS2 /ERG
células formaron grandes tumores malignos, que rodeaban los nódulos prostáticos murinos normales (Figura 2F, puntas de flecha negras). Por otra parte, los nódulos derivados-EP-AR demostraron una tinción positiva para la CDH1 marcadores epiteliales, y no lograron manchar para el VIM mesenquimales marcador (Figura 2F, flechas azules). Una imagen en el espejo fue evidente en el documento EP-AR
TMPRSS2 /ERG
tumores -derivado, que expresaron altos niveles de VIM y fueron negativos para CDH1, lo que corrobora aún más la
in vitro
observación de que
TMPRSS2 /ERG
induce EMT. La tinción para MKI67 (Ki-67), un conocido marcador de proliferación, reveló una extensa expresión en el documento EP-AR
TMPRSS2 /ERG
tumores (37% ± 2 células positivas) en comparación con los nódulos EP-AR-derivados (8% ± 2). Esto indica que los nódulos derivados de EP-AR son menos proliferativa y puede dar cuenta de su naturaleza latente.
Los resultados descritos hasta el momento sugieren que
TMPRSS2 /ERG
facilita EMT y, en consecuencia, la formación de tumores más agresivos y proliferativas. Varios estudios demostraron que en comparación con lesiones PIN,
TMPRSS2 /ERG
reordenación de frecuencias en los cánceres de próstata localizados invasivos, se duplica [5], [28], [29], [30]. Esta observación implica que
TMPRSS2 /ERG
requiere modificaciones adicionales con el fin de ser seleccionados positivamente medida que la enfermedad progresa. Para probar esta hipótesis, se utilizó un generado previamente, la cultura PrECs transformado-Ras [22]. Estas células albergan hTERT ectópica expresada, los oncogenes virales SV40 antígenos pequeños y grandes, T oncogénico H-RasV12 y del receptor de andrógenos. Un vector vacío o un
TMPRSS2 /ERG
vectores -Encoding se introdujeron en estas células, para generar dos líneas celulares distintas, LHSR y LHSR
TMPRSS2 /ERG
, respectivamente (Figura 3A). De acuerdo con los resultados obtenidos con células EP-AR, CDH1 se había reducido regulado en las células que expresan LHSR
TMPRSS2 /ERG gratis (Figura 3B). A continuación, las células fueron inyectadas de forma ortotópica en próstatas de ratones desnudos, así como por vía subcutánea. Como se esperaba, después de simplemente 28 días, las dos líneas celulares dieron lugar a tumores sin diferencias significativas en el tamaño (la incidencia de tumores se presentan en la Tabla S1). En consecuencia, MKI67 tinción reveló ninguna diferencia entre las líneas celulares en lo que respecta a la tasa de proliferación (datos no mostrados). Curiosamente, los tumores
TMPRSS2 /ERG
que expresan demostraron una marcada regulación de VIM y una notable baja regulación de CDH1 en comparación con los tumores de control (Figura 3C), que valida aún más la facilitación de la EMT por el
TMPRSS2 /ERG Hoteles en un adicional, y un
in vivo
modelo más agresivo. Dado que las líneas celulares LHSR son altamente agresivo, que no son adecuados para estudiar el efecto de
TMPRSS2 /ERG
sobre la formación de metástasis, como los ratones tuvieron que ser sacrificados dentro de un corto período después de las inyecciones. Sin embargo, en un caso,
TMPRSS2 /ERG
expresando tumor con metástasis en el pulmón murino. Como se muestra en la Figura S1, este metástasis originó a partir de la LHSR
TMPRSS2 /ERG
tumor primario, ya que tiñó positiva con el anticuerpo anti-AR-humano específico. Es tentador especular que la EMT inducida por las células
TMPRSS2 /ERG
ha dotado con capacidades migratorias e invasivas y, finalmente, les permitió a casa y proliferan en un sitio distante. Por lo tanto, dado un contexto genético altamente transformado,
TMPRSS2 /ERG
EMT inducida podría facilitar la invasión y la metástasis.
PrECs (A) que expresan ectópica de hTERT, así como antígenos pequeños y grandes SV40 T eran introducido con H-RasV12 y AR. La línea resultante, LHSR (control), se introdujo con TMPRSS2 /ERG para formar la línea LHSR TMPRSS2 /ERG. Un Western blot representa los niveles de proteína de los genes expresados de forma ectópica. (B) Las células se analizaron para la expresión CDH1 usando QRT-PCR. Los resultados se presentan como media ± SD de un triplicado de un experimento representativo. (C) Las células fueron implantadas ortotópicamente en ratones glándulas de la próstata. Las glándulas se retiran un mes después de la implantación, seccionadas y teñidas con H & amp; E o anticuerpos contra la AR, CDH1, y vimentina. Las flechas negras indican los nódulos de ratón con una tinción negativa para la AR. (X 400 aumentos).
EP-AR y LHSR expresar TMPRSS2 /ERG no están contaminados con células mesenquimales de linaje
Para excluir la posibilidad de que la EMT informado se deriva de una contaminación cruzada de cultivos de células mesenquimales se realizó un corto repetir tándem (STR) de huellas dactilares basada. loci STR son elementos de secuencia repetitivos, de 3 a 7 pares de bases de longitud, que se distribuyen en abundancia en todo el genoma humano. STR análisis basado en la PCR es cada vez más utilizado como un medio para la identificación humana para estudios forenses y de la vinculación [31], [32], [33], [34]. Se analizaron las dos culturas y EP LHSR basado en la asignación de alelos para cada uno de los loci STR probado. Se encontraron EP-AR y EP-AR TMPRSS2 /ERG que ser idénticos con respecto a los loci STR 16 (Tabla 1). LHSR y LHSR TMPRSS2 /ERG también se encontró que eran idénticos entre sí, sin embargo no al documento EP-AR o EP-AR TMPRSS2 /ERG. Para corroborar esta observación también se realizaron análisis espectral Karyotying (SKY), con el fin de detectar características cromosómicas recurrentes únicas, que aparece específicamente en los dos cultivos celulares isogénicas. Como se muestra en la Figura S2, EP-AR y EP-AR TMPRSS2 /ERG tienen material adicional en el cromosoma 11, mientras que el LHSR y el Anexo 3 translocaciones cromosómicas específicas LHSR TMPRSS2 /ERG, indicando de nuevo que cada tipo de cultivo, se deriva del mismo origen . Estos resultados sugieren que la EMT reportado en el presente documento es un genuinamente inducida por TMPRSS2 /ERG en lugar de por la contaminación cruzada.
TMPRSS2 /ERG
EMT inducida está mediada por el
ZEB1
/
ZEB2
eje
Numerosas vías se conocen a converger en
CDH1
la represión durante la transición epitelial a mesenquimal [27]. Por lo tanto, hemos tratado de medir los niveles de expresión de varios factores de transcripción que se informaron para facilitar la EMT ya sea directa o indirecta de la represión
CDH1
[27]. Los niveles de expresión de
Snai1 (Caracol), SNAI2 (Slug), FOXC2, GSC (goosecoid), TWIST1, TCF4 (E2.2), TCF3 (E47) y klf8
se midió y se encontró que sea baja o igualmente expresado tanto en EP-AR y EP-AR
TMPRSS2 /ERG
líneas celulares (Figura 4A). Sorprendentemente, la expresión de
ZEB1
y
ZEB2
, dos represores directos conocidos de
CDH1
[27], fueron dramáticamente hasta reguladas en el
TMPRSS2 /ERG
expresando células (Figura 4A).
ZEB1
inducción por
TMPRSS2 /ERG
fue validado a nivel de proteínas mediante inmunotinción (Figura 4B). Para probar si
ZEB1
tiene un papel eficaz en la promoción del proceso de EMT en nuestro modelo, su expresión fue derribado de forma estable usando ARN corto horquilla (shRNA) y el ensayo de migración se realizó. Como se muestra en la Figura 4C,
ZEB1
niveles disminuido dramáticamente después de
ZEB1
desmontables, lo que resulta en una atenuación significativa de la capacidad migratoria de las células
TMPRSS2 /ERG
que expresan ( Figura 4C, panel inferior).
(A) EMT asociada a factores de transcripción expresión. Las células se analizaron para la expresión de los genes específicos mediante QRT-PCR. Los resultados se presentan como media ± SD de un triplicado de un experimento representativo. ND = No detectado. * Denota una significativa expresión diferencial (P-Value & lt; 5 × 10
-4). (B) Las células se sembraron en portaobjetos y se tiñeron con α-
ZEB1
anticuerpo. Los núcleos se visualizaron mediante DAPI. (C) glándulas de próstata fueron inyectados con EP-AR (Control) y EP-AR TMPRSS2 /ERG como se describe, eliminado, se seccionaron y se tiñeron con un α-
ZEB1
anticuerpo. La flecha azul denota un nódulo humano. La flecha indica negro nódulos de ratón con una tinción negativa para la AR. (X 400 aumentos). (D)
ZEB1
se sus niveles de mRNA derribado y se midieron (panel superior). * Denota una expresión diferencial significativa (p-valor = 8 × 10
-4). Las células se sometieron a ensayo de migración como se describe (panel inferior). ** Indica una expresión diferencial significativa (p-valor = 4 × 10
-3).
Tanto
ZEB1
y
ZEB2
regiones promotoras consisten putativa de
TMPRSS2 /ERG
motivos de unión (Figura S3), lo que implica que
TMPRSS2 /ERG
podría unirse directamente a sus promotores y aumentar su expresión. Para probar esta hipótesis, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) utilizando un anticuerpo α-ERG. Curiosamente, tal como se representa en la figura 5A,
TMPRSS2 /ERG
parece unirse directamente
ZEB1
promotor, pero no
ZEB2
. Como control negativo se utilizó una región promotora de
CDH1
, que es una parte de la
ZEB1
/
ZEB2
eje, pero no alberga un sitio de unión ERG. Este resultado implica que
TMPRSS2 /ERG
podría inducir indirectamente
ZEB2
a través de la mediación de
ZEB2
efectores en fases anteriores. Para investigar esta conjetura, y para entender mejor el mecanismo por el cual
TMPRSS2 /ERG
ejecuta el programa de EMT en general; emprendimos un enfoque de todo el genoma y se realizó una comparación basada en micromatrices de expresión entre los
TMPRSS2 /ERG
células EP-AR y EP-AR. Un total de 1215 genes anotados fueron expresados diferencialmente entre las dos líneas celulares (813 hasta reguladas y 402 abajo-regulado), a partir del cual se recuperaron los que ambos estaban asociados con
ZEB1
o
ZEB2
, e implicado en la EMT en la literatura (por el método de filtrado detallada se refieren a la leyenda de la figura 5B). Para verificar la autenticidad de este conjunto de genes que también la validez de sus patrones de expresión diferencial de microarrays derivados mediante QRT-PCR (datos no mostrados). Como se representa en la figura 5B, siete genes coincide con los criterios de filtrado. Dos de ellos,
IL1R2
y
SPINT1 gratis (Figura 5C, validado por QRT-PCR), se informó para codificar los efectores aguas arriba de
ZEB2
expresión; el primero fue demostrado para elevar
ZEB2
niveles de expresión [35], mientras que el segundo atenúa su expresión [36], lo que sugiere que podrían ser los mediadores de
TMPRSS2 /ERG
dependiente de
ZEB2
elevación. Tanto
IL1R2
y
SPINT1
regiones promotoras consisten de putativa
TMPRSS2 /ERG
motivos de unión (Figura S2), y de hecho
TMPRSS2 /ERG
mostraron una significativo unión a sus promotores en un chip de ensayo (Figura 5D). Para corroborar efecto SPINT1 y IL1R2 en
ZEB2
expresión en nuestro sistema, hemos derribado su expresión usando ARN interferente pequeño (siRNA). Como se muestra en la figura 5E,
SPINT1
y
IL1R2
niveles se redujeron efectivamente de que siRNA transfección, lo que resulta en
ZEB2
elevación y reducción, respectivamente. En suma,
TMPRSS2 /ERG
parece unirse directamente y trans-activar
ZEB1
mientras que indirectamente induciendo
ZEB2
a través de trans-activación y trans-represión de sus efectores,
SPINT1
y
IL1R2
.
ensayo (a) de la cromatina-IP se llevó a cabo en las células EP-AR TMPRSS2 /ERG utilizando anticuerpo α-ERG e IgG como control. Los resultados se presentan como media ± SD de un triplicado de un experimento representativo. * Denota valor de p & lt; 3 × 10
-2. (B) La lista de los 1215 genes expresados diferencialmente se cruzó con una lista de genes asociados con
ZEB1
o
ZEB2
, que se obtuvo a partir del software "Genomatix" [47], lo que resulta en 37 genes compartidos. La lista de 37 genes se filtró para los genes asociados con la EMT según la literatura (n = tamaño de la muestra desconocida), dejando a los 7 genes que se enumeran en el cuadro a continuación. (C) Las células se analizaron para
SPINT1
y
IL1R2
expresión usando QRT-PCR. Los resultados se presentan como media ± SD de un triplicado de un experimento representativo. * Denota valor de p & lt; 5 × 10
-4. (D) La misma puesta a punto como (A) se utilizó para
IL1R2
y
SPINT1
promotores (E) paneles de la izquierda: células EP-AR fueron transfectadas con siRNA dirigidos a
SPINT1
y mRNA de los genes designados se midió por QRT-PCR. Los resultados se presentan como media ± SD de dos experimentos utilizando dos oligonucleótidos de ARNsi diferentes. * Denota P-valor = 7 × 10
-4, ** indica P-valor = 1 × 10
-3. paneles de la derecha: la misma disposición experimental se utilizó con siRNA dirigidos a
IL1R2
en el documento EP-AR TMPRSS2 /ERG. * Denota P-valor = 2 × 10
-4, ** indica P-valor = 1 × 10
-2.
Discusión
En este estudio nos proporcionan la prueba sustancial para apoyar la idea de que
TMPRSS2 /ERG
asume un papel activo en la transición epitelial a mesenquimal a través de la activación de la /
CDH1
vía ZEB, tanto
in vitro
y
in vivo
. Estos hallazgos arrojan luz sobre el mecanismo por el cual el
TMPRSS2 /ERG sobre Fusion ejerce su efecto oncogénico.
capacidades EMT y la invasión fueron reportados a ser una consecuencia de
TMPRSS2 /ERG
expresión en varios estudios [10], [13], [15], [21]. Por lo tanto, parece que la EMT y la invasión son procesos generales que son ejecutados por
TMPRSS2 /ERG
en el cáncer de próstata, y que se consiguen por diversos mecanismos. Consistentemente, los componentes de la señalización de Wnt como WNT7A, eran evidentes en nuestro modelo también. EMT es inducido por varias vías de señalización, todo canalizados a la baja regulación de
CDH1
. Estas vías se rigen por aproximadamente 10 principales factores de transcripción, que reprimir
CDH1
expresión, ya sea en forma directa o indirecta de una manera [27]. Uno de estos es la vía Snai1 /2, que regulan
ZEB1
/2 expresión y han sido implicados en el cáncer de próstata [37], [38], [39]. Sin expresión diferencial de Snai1 o SNAI2 fue evidente en nuestro sistema. Sin embargo, como se informó anteriormente [40],
ZEB
genes pueden promover la EMT con independencia de Snail 1/2 de expresión, que alude a activador alternativa, aguas arriba de esta vía en particular. En nuestro sistema,
TMPRSS2 /ERG
parece cumplir los criterios requeridos para este activador ascendente.
AR desempeña un papel crucial en la progresión del cáncer de próstata y se sabe para regular el
TMPRSS2
promotor, que constituye la parte reglamentaria del
TMPRSS2 /ERG sobre fusion. Además, AR ha demostrado recientemente para crear sinergias con
TMPRSS2 /ERG
para promover el desarrollo de adenocarcinoma invasivo [20]. En consecuencia, una fuerte cooperación entre los dos era evidente en nuestro sistema, ya que cada gen no se active e incluso reduce ligeramente
ZEB1 /2
expresión, mientras que la co-expresión produjo una marcada inducción de la transcripción de estos genes (datos no mostrado). Del mismo modo, mientras que las células no crecieron PE
in vivo
siguiendo las células de implantación ortotópica y EP-AR nódulos discretos formados, EP-AR
TMPRSS2 /ERG
células dio lugar a grandes tumores malignos, haciendo hincapié en la la naturaleza sinérgica de su cooperación. Estudios recientes han relacionado AR a EMT en modelos de cáncer de próstata a través de la activación del eje SNAI [41], [42]. En nuestro estudio, AR por sí sola no era suficiente para inducir EMT, tal vez debido a los antecedentes empobrecido en Caracol. Por lo tanto, una vez más, se podría especular que coopera con AR
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a invocar una vía alternativa EMT en ausencia de caracol. El hecho de que la expresión tanto de AR y
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en nuestro sistema se rige por los promotores artificiales, será inadecuado para el estudio de AR inducida
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expresión. Sin embargo, este sistema podría representar la fase refractaria hormonal del cáncer de próstata avanzado en el que AR es sobre-activado. Nuestros datos implica que la cooperación entre AR y
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no está mediada exclusivamente a través de la regulación transcripcional de AR dependiente del ERG. Alternativamente, otros mecanismos, tales como componentes de mediación o interacciones físicas, pueden afectar su cooperación en la progresión del cáncer de próstata. Otros estudios deben centrarse en dilucidar los mecanismos exactos por los que Ar controles
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expresión y función
.
Tanto SPINT1 y IL1R2 fueron previamente implicadas en el cáncer. Se informó IL1R2 ser significativamente elevados en el plasma de pacientes con linfomas de Hodgkin 'en comparación con los controles sanos [43]. Además, la expresión forzada de
IL1R2
en una línea celular urotelial dio lugar a una alteración morfológica, la reorganización de la actina y la adquisición de una capacidad migratoria y
IL1R2
sobreexpresión se asoció con una mayor expresión de
ZEB2 Opiniones y expresión reducida de
CDH1
[35]. Nuestro trabajo corroborada
IL1R2
actividad pro-oncogénica que está mediada por
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trans-activación directa. Recientemente, en un estudio que compara los tejidos y líneas celulares que representan diferentes etapas del cáncer de próstata, Spint1 fue altamente expresado en los tejidos normales en comparación con la hiperplasia prostática benigna (BPH) y el cáncer de grado bajo, con una pérdida progresiva en el aumento de las muestras el grado del tumor [44 ]. En consecuencia,
SPINT1
atenuación en líneas celulares de cáncer de próstata, dio lugar a un fenotipo más agresivo que incluía una mayor motilidad e invasividad [45]. Por último, SPINT1 caída en la línea celular de cáncer pancreático SUIT-2, inducida EMT y la invasión, que estuvieron acompañados por
ZEB2
elevación y
CDH1
reducción [36]. En conjunto, estos datos sugieren que SPINT1 actúa como un supresor de tumores en el cáncer de próstata. Hemos sido capaces de demostrar que SPINT1 ejerce su efecto en parte mediante la reducción de los niveles de
ZEB2
y por lo tanto es reprimida por
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.
Recientemente, los mismos centrados con la colaboración de
TMPRSS2 /ERG Chat con diferentes socios en el proceso canceroso están surgiendo [16], [19], [20]. (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/wt_sensetarget_label_manual.pdf).
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