Extracto
Las actividades contra el cáncer de berberina (BBR) se han reportado ampliamente en diversas líneas celulares de cáncer. Sin embargo, las concentraciones mínimas inhibitorias de BBR variaban mucho entre las diferentes líneas celulares y se han dedicado muy pocos estudios para aclarar este aspecto. En este estudio, se emplearon tres líneas celulares de cáncer, HepG2, HeLa y SY5Y, para comparar el transporte y distribución de BBR. resultados de HPLC demostraron que BBR era capaz de penetrar en todas las líneas celulares, mientras que las concentraciones acumuladas fueron significativamente diferentes. células HepG2 acumulan mayor nivel de BBR para duración más larga que las otras dos líneas celulares. estudios de acoplamiento molecular reveló el sitio de unión BBR el 1 de P-glicoproteína (P-gp). Además, hemos dilucidado que BBR regulada P-gp, tanto en los niveles de proteína y ARNm. BBR induce la transcripción y traducción de la P-gp en células HeLa y SY5Y, mientras BBR inhibe la expresión de P-gp en células HepG2. El estudio adicional demostró que BBR regula la expresión de P-gp en función de diferentes mecanismos (o afectada por diferentes factores) en diferentes líneas celulares. En resumen, nuestro estudio ha puesto de manifiesto varios aspectos mecánicos de regulación BBR en la P-gp en diferentes líneas celulares de cáncer y podría arrojar algunas ideas útiles sobre el uso de BBR en el desarrollo de fármacos contra el cáncer
Visto:. Pang YN, Liang YW, Feng TS, Zhao S, Wu H, Chai YS, et al. (2014) Transporte de berberina en HepG2, HeLa y células SY5Y: Una correlación a su efecto anti-cáncer. PLoS ONE 9 (11): e112937. doi: 10.1371 /journal.pone.0112937
Editor: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Universidad de Creta, Grecia
Recibido: 21 de junio de 2014; Aceptado: 17 de octubre de 2014; Publicado: 17 Noviembre 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación: Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81374006 y 81073092) y el Nacional de S & amp; T Proyecto Especial Mayor de Nuevo Fármaco R & amp; D del Programa de. China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008 y 2011ZX09101-002-11). Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. Wu Hao es empleado por NGM biofarmacéuticos, Inc. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La berberina (BBR), un alcaloide de isoquinolina , se pueden aislar a partir de plantas medicinales como
Rhizoma Coptidis
,
Scutellaria baicalensis
y
felodendron amurense
. A pesar de que se utiliza principalmente para el tratamiento de enfermedades infecciosas en la práctica médica tradicional, BBR recientemente ha sido explorado por la disminución de lípidos, contra la diabetes, la modulación inmune, la protección del miocardio isquémico, anti-hipertensión, antiarrítmico y efectos anticancerígenos en varios estudios [1], [2].
El efecto anti-cáncer de BBR ha informado en muchas líneas celulares de cáncer, incluyendo células PC12 [3], las células de melanoma [4], células de cáncer de mama [5] , células de cáncer de colon humano [6], adipocitos 3T3-L1 [7], no pequeñas células de cáncer de células de pulmón humano [8], las células de cáncer de próstata [9], las células de cáncer de hígado [10], células de cáncer cervical [11], etc. se ha informado de que la concentración inhibitoria mínima de BBR varió significativamente entre las diferentes líneas celulares de cáncer, a partir de 10 nM (3,73 ng /ml) en células de carcinoma de colon a 400 mu M (149,2 mg /ml) en células MHCC97-L, a través de una mecanismo desconocido [12], [13]. Estudios anteriores también demostraron que BBR, una clase de alcaloides intercaladores de ADN, se importó a través de un transportador catiónico. Sin embargo, la distribución intracelular de BBR todavía no está claro [14]. P-gp, el miembro más estudiado de ATP casete (ABC) de la membrana de unión a transportadores de salida, ha sido identificado como un principal transportador responsable de la flujo de salida de BBR. Se encontró que la inhibición de P-gp para aumentar la concentración intracelular de BBR [15]. Estudios recientes informaron que BBR regula la P-gp en diferentes extiende en diferentes líneas celulares [16]. Sin embargo, la regulación de la P-gp a mRNA y los niveles de proteína por BBR no se ha informado todavía.
En este estudio hemos elegido tres líneas celulares de cáncer ampliamente usados, HepG2, HeLa y SY5Y para evaluar el transporte intracelular, distribución y flujo de salida de RBB, con el objetivo de comprender el mecanismo que subyace a las diferentes respuestas a BBR entre las diferentes líneas celulares.
Materiales y Métodos
células HepG2
cultivo de células y la citotoxicidad de ensayo
eran proporcionada por el Dr. Li Cao, Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales (IMPLAD). células HeLa fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC) (Rockvill, Maryland, EE.UU.). Ambas líneas celulares se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). SY5Y fueron proporcionados por el Banco de Células del Instituto de Medicina Fundamental de la Academia China de Ciencias Médicas (Pekín, China), cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Las células se cultivaron a 37 ° C bajo 5% de CO
2 y 90% de humedad. El IACUC (Institucional Cuidado de Animales y el empleo), de la Universidad de Tsinghua aprobó todos los protocolos utilizados en este estudio (ID aprobación: 2013-DuLJBBR001).
La citotoxicidad de BBR en las tres líneas celulares fueron evaluados por un MTT ( 3- (4,5-dimetil-lthiazol-2-il) bromuro) de ensayo -2,5-difeniltetrazolio. El ensayo MTT se realizó de acuerdo con el método descrito por Chai et al. [17].
microscopía confocal
Las células se trataron con BBR (0,5 mg /ml en agua) o agua sola después de alcanzar 70% de confluencia [14]. Después de tratamiento con fármacos durante 12 h, las células se utilizaron para obtener imágenes de microscopía. La fluorescencia intracelular de BBR se observó con excitación a 405 nm y emisión a 520 nm. Las imágenes fueron tomadas bajo un Zeiss LSM 710 Meta microscopio confocal equipado con argón y helio-neón láser (Carl Zeiss, Alemania) y analizados por otros Zen Software 2011.
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
un sistema de HPLC que contiene un 1,260 sistema Agilent HPLC (1260 Quat bomba, 1260 DAD, 1260 ALS) y una columna de HPLC C-18 (150 mm x 3,9 mm, 5 micras de sílice de tamaño de partícula, Waters, Irlanda) se utilizó para determinar la concentración intracelular de BBR. Una fase móvil que consiste en acetonitrilo /agua (28/72, v /v) que contiene 0,5% de trietilamina se bombeó a través de la columna a 0,8 ml /min. BBR se detectó mediante absorbancia de UV a una longitud de onda de 347 nm [18]. En estas condiciones, el tiempo de retención de BBR fue 6,8 min. El intervalo lineal cuantitativa era 0-5000.0 ng /ml para BBR. Las curvas de calibración de BBR se extrajeron utilizando regresión lineal ponderada de los valores de relación de área de pico de los patrones de calibración. El coeficiente de correlación (R
2) fue de 0.999.
Líquido espectrómetro de cromatografía de masas (LC /MS) de ensayo
Un Agilent 1200/6340 LC /MS se utilizó para cuantificar intracelular BBR . Intracelular BBR se extrajo usando metanol y fluía a través de una columna de HPLC C-18 (150 mm x 3,9 mm, 5 micras de tamaño de partícula de sílice, Waters, Irlanda) a una velocidad de 0,2 ml /min a 25 ° C. La fase móvil consistió en un disolvente (acetato de amonio 10 mM, ácido metanoico 0,1% en agua y ajustar el pH a 3) y el disolvente B (acetonitrilo) se utilizó para equilibrar la columna en el siguiente gradiente: 15% de disolvente B durante 2 min, 30% de disolvente B durante 11 min, 90% de disolvente B durante 12 min y finalmente B disolvente 15% durante 5 min. En estas condiciones, el tiempo de retención de BBR fue 12,6 min. BBR se controló a relación masa /carga (m /z) de 336,0.
Estudio de acoplamiento a base de ordenador
La estructura cristalina informado de la P-gp, descargado de proteína página web del Banco de Datos (código PDB : 2YL2, http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2YL2) fue elegido como la plantilla de acoplamiento. Los datos de densidad de electrones fue adquirido desde el sitio web de electrones densidad del servidor (http://eds.bmc.uu.se/cgi-bin/eds/uusfs?pdbCode=2YL2). Los archivos de estructura de la molécula de proteína y se analizaron por BBR autodocktools-1.5.4. La celda de la malla incluye todo el dominio transmembrana.
manipulación de nucleótidos y la transformación
La construcción de promotor de la expresión de GFP fusionado P-gp (P-gp-promotor GFP) se generó usando técnica molecular en general . Para reemplazar el
Spel
y
XbaI
fragmento del vector pEGFP-N1, un promotor de P-gp 1 kb se amplificó por PCR a partir de una PCR inversa HepG2 células [19]. Los cebadores utilizados fueron: 1 KB-Asel-F: 5'-TTTATTAATCTGCAGAAAAATTTCTCCTAG y 1 Kb-BamHI-R:. 5'-CGCGGATCCCTGCAGGGGCTTTCCT
Esta construcción GFP fusionado promotor P-gp se verificó mediante secuenciación y se sometió a transfectar en células HepG2 , HeLa y SY5Y células por electroporación por separado. Las células en medio libre de suero que contiene 20 g de ADN se sometieron a electroporación en un electroporador (Modelo ECM 630, BTX). Los parámetros establecidos de electroporación fueron 250 V de voltaje (modelo de baja tensión), la resistencia 1575 Ω y 1000 mF capacitancia. Las células se pulsaron dos veces con intervalo de 1 min. Después de la electroporación, las células se transfirieron a placas de 10 ml con 10% de suero y se recuperaron durante 24 h, seguido de tratamientos con fármacos [20].
RT-PCR cuantitativa
Se determinaron los niveles de mRNA utilizando SYBR verde basada kit de PCR cuantitativa (Tiangen, china). El ARN total se aisló mediante Trizol ARN total equipo de aislamiento (Tiangen, China). muestra de ARN de 50 ng fue transcripción inversa utilizando M-MLV la primera cadena de cDNA de síntesis Kit (transgén, China). Los productos de ADNc se confirmaron por electroforesis en gel de ADN. PCR cuantitativa se realizó como se describió anteriormente [21]. Los cebadores utilizados fueron 5'-GCTGGATGTTTCCGGTTTGG y 5'-TTCCGTGCTGTAGCTGTCAA para P-gp, 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC y 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT para
β-actina
. 5'-GCAGAAGAACGGCATCAAGG y 5'-CGGACTGGGTGCTCAGGTAG para GFP. Las condiciones de los ciclos fueron: 94 ° C durante 3 min; 40 ciclos de 94 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 10 seg, 72 ° C durante 20 s; 72 ° C durante 10 min y se enfrió a 4 ° C. Los datos fueron procesados con el programa de software II LC-480 (Roche, EE.UU.).
Western blot
Las muestras de proteína se prepararon y utilizaron para el Western Blot como se describe anteriormente [22]. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad. Las muestras de proteína se resolvieron en 8% en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche seca no grasa en TBST (tampón TBS que contiene 0,05% de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con el anticuerpo primario diluido con leche 3% en TBST a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos primarios utilizados fueron monoclonal de ratón anti-P-gp (1:500, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), GFP (1:3000, Abmart, Shanghai, China) y β-actina (1:2000, Tecnología Biológica Boster , Wuhan, china). El anticuerpo utilizado en segundo lugar fue de cabra anti-ratón HRP anticuerpo (1:1000, ZSGB-BIO, China), seguido por quimioluminiscencia como se describe [21].
El análisis estadístico
Todos los datos fueron representado como media ± SD y estadísticamente analizados usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). La prueba F se llevó a cabo utilizando el software Excel para Office 2007 (Microsoft, EE.UU.). Después de la prueba F,
se realizó del estudiante t-test
entre los dos grupos. ANOVA de una vía
t-test
fue empleado para analizar las diferencias entre los conjuntos de datos utilizando el software Graph Pad Prism 5.0 (Graph Pad, San Diego, EE.UU.).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La captación celular de BBR
La distribución intracelular de BBR es importante para entender el papel de BBR como un medicamento contra el cáncer. Empleamos tres líneas celulares representativas: HepG2, HeLa y SY5Y para analizar la distribución BBR [23] - [26]. Se utilizó una dosis no tóxica de BBR (0,5 g /ml) a lo largo de todo el estudio sobre la base de los resultados de ensayo de citotoxicidad y las curvas de letalidad (Figs. 1A-F). El microscopio confocal representa la distribución de BBR en las células vivas (Fig. 2A), revelando que BBR puede entrar en las células HepG2, HeLa y SY5Y dentro de 1 h después del tratamiento de drogas (Figs. 2B, C). La mayoría de BBR fue en el citoplasma y no se observó ninguna entrada nuclear obvio. Los informes anteriores han demostrado BBR entrar núcleo y competir con TBP (de TATA Box proteína de unión) de la caja TATA en células PC12 [14]. Sin embargo no hemos podido observar la distribución núcleo de BBR en estas tres líneas celulares de cáncer.
(A-F) La citotoxicidad y la letalidad de BBR utilizando el ensayo MTT. (A, B) HepG2, (C, D) HeLa. (E, F) SY5Y. *
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01, ***
P
& lt; 0,005, la significación estadística de BBR grupos en relación con los grupos de control tratados. Los datos se presentan como media ± S.D. a partir de seis experimentos independientes (n = 6).
(A-I) Imágenes de la localización subcelular de BBR en las células antes y después de 0,5 g de administración /ml BBR por 1 h. (A-C) células HepG2; células (D-F) HeLa; células (G-I) SY5Y. La fluorescencia de BBR se muestra en verde, contraste de interferencia diferencial (DIC) cifras representan la escala de las células y la barra de escala es de 10 micras.
A continuación, utiliza HPLC y LC /MS para analizar cuantitativamente el intracelular concentración de BBR en las células HepG2, HeLa y SY5Y después de la entrada celular. Los resultados mostraron que BBR puede separarse y detectarse usando HPLC en las condiciones indicadas (Figs. 3A-C) de manera efectiva. Las curvas estándar de BBR demostrado una fuerte relación señal-ruido y una buena relación lineal (R
2 = 0,999) entre el área del pico y la concentración de BBR (Fig. 3D). No hubo diferencias en la absorción de BBR entre las tres líneas celulares. El ensayo de HPLC mostró que en las células HepG2, concentración máxima BBR (C
max) estaba en alrededor de 2188,8 pmol /mg en aproximadamente 12 h después del tratamiento (Fig. 3E). El C
máximo de BBR en HeLa y SY5Y fueron 357,8 pmol /mg y 65,5 pmol /mg, respectivamente (Fig. 3F, G). Después de tres horas, las concentraciones de BBR en células HeLa y SY5Y descendieron. Se muestra que BBR se acumuló a un nivel superior en las células HepG2 que los otros.
(A-C) cromatogramas de HPLC. (A) Estándar BBR; (B) de la muestra en blanco de BBR células tratadas; (C) Las muestras de células con la administración BBR para 12 h. (D) Las curvas de calibración de concentración BBR verso intensidad AU utilizando ensayo de HPLC. (E-G) el comportamiento cinético de BBR en las células en la parcela con el tiempo de administración en 24 h. (E) HepG2; (F) HeLa; células (G) SY5Y. (H, I) LC /MS cromatogramas de BBR en las células HepG2 después de la administración de 24 h. (H) el espectro de masas de BBR; (I) del cromatograma de BBR. Estándar BBR se muestra en verde; la muestra se muestra en color púrpura. Los datos se presentan como media ± S.D. a partir de seis experimentos independientes (n = 6).
Además, para entender si la concentración BBR mayor en las células HepG2 se debió al papel de HepG2 en la metabolización activa BBR, hemos creado LC /MS para analizar los productos de metabolitos de BBR en las células. Como se informó, hay productos de metabolitos de BBR Después de la absorción oral o la inyección en ratas [27]. Sin embargo, no detectamos ninguna de ellas en las células HepG2 (Fig. 3H, Me), lo que sugiere BBR se mantuvo intacta en las células HepG2 [28].
P-gp es un importante transportador de eflujo de BBR
se empleó
Para validar el papel de P-gp en el flujo de salida de BBR en HepG2, HeLa y células SY5Y, un inhibidor selectivo de la P-gp, Zosuquidar (LY335979, Selleckchem, EE.UU.) [29], [30]. Como se muestra en la Fig. 4, Zosuquidar aumentó de manera eficiente la concentración de BBR en las células HepG2, HeLa y SY5Y, lo que sugiere que P-gp es un importante transportador de eflujo de BBR en estas células. Estos resultados están en buen acuerdo con estudios anteriores [28], [31].
Las células fueron tratadas con 0,5 mg BBR /ml y 0,3 mol Zosuquidar, el inhibidor de la actividad de P-gp, durante 12 h. Las concentraciones intracelulares de BBR se determinaron por ensayo de HPLC. Los datos se presentan como media ± S.D. a partir de tres experimentos independientes (n = 3). . *
mf Francia El control,
P Hotel & lt; 0,05. **
vs of the control,
P Hotel & lt; 0,005,
t-test
docking molecular de BBR a P-gp.
además, se analizó la interacción de P-gp y BBR por ordenador basada acoplamiento molecular. La estructura cristalina de la P-gp humana ha sido identificada a partir de la base de datos del NCBI. Por lo tanto, hemos utilizado la misma estructura que el receptor para llevar a cabo acoplamiento molecular de BBR. Los resultados sugieren que BBR fue capaz de unirse a la droga vinculante bolsillo de la P-gp (Figs. 5A, B). El sitio de unión de BBR se encuentra en la parte "inferior" del bolsillo de unión (Fig. 5C, D). La energía de planeo es -9.1 kcal /mol, lo que sugiere la alta afinidad de unión de BBR a P-gp.
(A) lateral y (B) vista desde arriba del bolsillo de unión BBR de la P-gp. (C, D) de conexión para las vistas generales de BBR en el bolsillo de unión de la P-gp. malla azul: Mapa de isodensidad de electrones de la proteína alrededor del sitio de unión. La proteína se representan como dibujos animados (transparencia = 20%), moléculas pequeñas y aminoácidos importantes (como la etiqueta) se representan como líneas (blanco y verde, de carbono. Rojo, oxígeno. Azul, nitrógeno). línea discontinua de color amarillo, enlace de hidrógeno.
BBR afecta a la expresión de P-gp
Para dilucidar si BBR regula la expresión de P-gp, se analizó el mRNA y los niveles de expresión de proteínas de P-gp en las células HepG2, HeLa y SY5Y después del tratamiento BBR. Los resultados mostraron que el ARNm de P-gp se aumentó en las células HeLa y SY5Y, mientras que la disminución en las células HepG2 de una manera dependiente de la dosis después del tratamiento BBR (Fig. 6A). Además, el análisis de transferencia de Western validado estos resultados, que muestran que BBR aumento de la expresión de P-gp en células HeLa y SY5Y, pero disminuyó la expresión en las células HepG2 (Figs. 6B, C).
(A) las expresiones de ARNm de endógena P-gp usando el ensayo de PCR en tiempo real. (B) Western Blot ensayo mostró cambios en la proteína P-gp con el tratamiento BBR. (C) Los cambios de relación de P-gp en comparación con β-actina. Los datos se presentan como media ± S.D. de 3 experimentos independientes (n = 3). La concentración de BBR fue de 0,5 g /ml. *
mf Francia El control,
P
. & Lt; 0,05; . **
mf Francia El control,
P Hotel & lt; 0,005,
t-test
. Para los paneles en (A) y (C), izquierda, HepG2; Media, HeLa; Derecha, SY5Y.
¿Cómo regula BBR se desconoce la P-gp expresión. Para determinar el efecto de BBR en la iniciación de la transcripción de P-gp, una GFP P-gp 1 kb promotor fusionado fue construido (Fig. 7A) y se transfectó en las tres líneas celulares [19]. Estas células fueron tratadas con o sin BBR y seguido por citometría de flujo de selección y análisis de RT-PCR (Figs. 7B-D). RT-PCR reveló que BBR no tiene ningún papel en la regulación de la actividad del promotor de P-gp. Además, el nivel de expresión de la proteína de GFP no fue afectada por BBR acuerdo con los resultados de transferencia Western de las Figs. 7E-H. Desde GFP fue fusionado con el promotor P-gp en el plasma y no está presente en las células de mamíferos, la proteína GFP expresión de datos demostraron que BBR no podía actuar sobre el promotor P-gp en el nivel de transcripción.
(A ) mapa esquemático de la P-gp 1 kb promotor fusionó GFP (P-gp-promotor GFP) construir. Negro, el promotor P-gp. Marco verde, la lectura de EGFP. (B-D) las expresiones de ARNm de P-gp 1 promotor kb fusionó GFP en presencia o ausencia de BBR por el ensayo de PCR en tiempo real. (B), HepG2; (C), HeLa; (D), SY5Y. (E) Western Blot ensayo mostró cambios de P-gp 1 kb promotor de la proteína GFP fusionada con el tratamiento BBR. (M-H) Los cambios de relación de GFP en comparación con β-actina. Los datos se presentan como media ± S.D. de 3 experimentos independientes (n = 3). "
ns"
supone la ausencia de significación estadística.
Discusión
El objetivo de este estudio es comprender la interacción entre BBR, un compuesto potente contra el cáncer, y P-gp, una amplia distribución del transportador de eflujo de fármaco. Estudios previos revelaron que a una concentración de 0,5 mg /ml BBR fue eficaz en la protección de células neuronales cultivadas a partir de los daños después de privación de oxígeno y glucosa [22] y que verifican que no causa ningún daño a HepG2, HeLa o células SY5Y basado en ensayo MTT . En nuestro presente trabajo, hemos observado la entrada de BBR por microscopio confocal y registró la acumulación dinámica de BBR usando HPLC y LC /MS. Los resultados mostraron diferencias significativas entre las tres líneas celulares, HepG2 acumularon más BBR para la duración más larga que las otras dos líneas celulares. Mediante el ensayo LC /MS, encontramos que no había metabolitos de BBR en células HepG2 después de la administración BBR, que indica la alta concentración de BBR en las células HepG2 es única en sí BBR. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que podría acumular más HepG2 BBR y mantenerlo durante más tiempo en las células.
Según ha informado la literatura [15], P-gp es el principal responsable del flujo de salida de BBR. Por lo tanto hemos empleado un inhibidor específico de la P-gp, que bloquea eficazmente el flujo de salida de RBB y el aumento de la concentración de BBR en las células HepG2. Un bolsillo de unión específica de la P-gp de BBR se revela en la predicción de acoplamiento molecular. Esto explica en parte el sitio a través del cual BBR podría afectar a la capacidad de la P-gp en la mediación de BBR flujo de salida, a través de un mecanismo detallado correlacionar estos dos fenómenos (la unión de BBR y la eficiencia de flujo de salida de la P-gp) es aún desconocido.
Mediante la aplicación de métodos de biología molecular y bioquímica, que mide los niveles de ARNm y proteínas de P-gp en las células después del tratamiento BBR. Los resultados mostraron que BBR indujo la expresión de ARNm y proteínas de P-gp en células HeLa y SY5Y, y por lo tanto promueve el flujo de salida de BBR y la reducción de la concentración intracelular de BBR. Estos resultados podrían explicar la observación de que la concentración intracelular de BBR alcanzó su punto máximo y disminuye muy rápidamente en estas células. Sin embargo, la expresión de P-gp disminuye con concentraciones crecientes de BBR en las células HepG2, que estaba en buen acuerdo con el hecho de que la concentración intracelular de BBR construido de forma continua en las células HepG2.
Como se muestra en la Fig. 6 y Fig. 7, ARNm y proteínas expresión de P-gp en células HeLa y SY5Y son regulados hasta después de la administración BBR, mientras que la expresión de ARNm de P-gp en el promotor transfectadas en las células no fueron reguladas. Para verificar el resultado, se realizó un experimento adicional usando la expresión de la proteína GFP. Los resultados mostraron expresiones de proteína GFP no estaban regulados hasta después de la administración BBR, el apoyo a los datos de expresión de ARNm de P-gp en el promotor transfectadas en células HepG2, HeLa y SY5Y. Puesto que no hay proteína GFP en células de mamífero, GFP datos de expresión de proteínas que apoyan firmemente BBR no actúan sobre el promotor de P-gp.
BBR se informó para aumentar la biodisponibilidad de varios compuestos mediante la inhibición de P- gp en Caco-2 células intestinales [16]. También promovió la expresión de P-gp en la resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas, incluyendo la oral (KB, OC2), gástrico (SC-M1, NUGC-3) y dos puntos (COLO 205, CT 26) células del cáncer [32], [33 ], lo que sugiere la complejidad de las relaciones entre BBR y P-gp en diferentes células
.
Desde BBR no podía entrar en el núcleo, es probable que no BBR tiene ninguna acción sobre las secuencias de ADN /Gene, lo que lleva o ningún efecto de BBR en la P-gp promotor de la transcripción. Se combinan con los diferentes patrones de expresión de P-gp inducidos por BBR, predecimos que el efecto de BBR en la expresión de P-gp debe ocurrir después de la transcripción de genes, por ejemplo ARNm y estabilidad de la proteína, o proteína modificación postranscripcional. Empleo de la función inhibidor de la P-gp drásticamente inhibida de la P-gp de transporte de BBR en las tres líneas celulares, lo que indica que no hay diferencias entre la función de la proteína P-gp en las células. Esto sugiere que puede haber diferentes factores celulares para la expresión de la proteína P-gp en las células y los interactúa entre BBR, P-gp y diversas vías de transducción de señales podrían ser drásticamente diferente en diferentes líneas celulares de cáncer, lo que resulta en la diferente respuesta de tumor células a BBR. Esto requiere un mayor estudio.
Conclusiones
En resumen, este es el primer reporte de cómo las actividades de P-gp BBR regulada entre líneas celulares de cáncer HepG2, HeLa y SY5Y. P-gp se combina con BBR con el fin de cumplir con BBR, y al mismo tiempo BBR interfiere con la expresión de P-gp para regular su propio flujo de salida del citoplasma. BBR indujo la expresión de P-gp en células HeLa y SY5Y, pero inhibe la expresión de P-gp en células HepG2, probablemente causada por distintos patrones de traducción de la proteína P-gp. No había ninguna regulación directa de la P-gp promotor de transcripción, lo que indica diferencias en la regulación y /o mecanismos que existen en las células HepG2 y células HeLa y SY5Y. Las diferencias entre las tres líneas celulares indicadas en este estudio pueden ayudar a entender las capacidades células cancerosas para absorción y el transporte fármacos contra el cáncer, también ayudar en el conocimiento de los posibles mecanismos de resistencia a fármacos.
Reconocimientos
agradecemos a todos los colegas en nuestro laboratorio. Agradecemos al Dr. Yu Tian, el Fondo para el descubrimiento de medicamentos, de la Universidad de Tsinghua, por la ayuda de la detección LC /MS.