Extracto
Antecedentes
La survivina es un inhibidor de la apoptosis y su sobre-expresión se asocia con un mal pronóstico en diversos tumores malignos. Aunque varios estudios han analizado la expresión de survivina en el carcinoma esofágico de células escamosas, pocos se han centrado en el adenocarcinoma de esófago (EAC) y /o epitelio escamoso cáncer adyacente (CASE). El propósito de este estudio fue 1) para determinar el grado de survivin hasta la regulación en muestras de EAC y CASE, 2) evaluar si la expresión de survivina en EAC y CASE se correlaciona con la recurrencia y /o muerte, y 3) para examinar el efecto de la inhibición de la survivina en la apoptosis en células de EAC.
Métodos
muestras congeladas frescas de EAC y la carcasa de un mismo paciente se utilizaron para QRT-PCR y Western blot, y fijado en formalina, parafina se utilizó tejido embebido para inmunohistoquímica. líneas celulares de la CAO, OE19 y OE33, se transfectaron con pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) para derribar la expresión de survivina. Esto fue confirmado por QRT-PCR para la expresión de survivina y el análisis de transferencia Western de PARP escindida, caspasa 3 y survivina escinde. datos de expresión de survivina se correlaciona con el resultado clínico.
Resultados
survivin expresión fue significativamente mayor en muestras de tumores de EAC en comparación con el caso de la misma paciente. Los pacientes con alta expresión de survivina en el tumor EAC tenían un mayor riesgo de muerte. survivin expresión también se observó en CASE y correlaciona con un mayor riesgo de recurrencia distante. Evaluación línea celular demostró que la inhibición de la survivina dio lugar a un aumento de la apoptosis
Conclusión
expresión
Superior de survivina en el tejido tumoral se asoció con un mayor riesgo de muerte.; mientras que la expresión de survivina en caso fue un predictor de recurrencia superiores. La inhibición de la survivina en líneas celulares de EAC mostró además aumento de la apoptosis, el apoyo a los beneficios potenciales de las estrategias terapéuticas dirigidas a este marcador
Visto:. Malhotra T, Zaidi AH, Kosovec JE, Kasi PM, Komatsu Y, Rotoloni CL, et al. (2013) Valor pronóstico y Targeted La inhibición de la survivina expresión en esofágico adenocarcinoma y el cáncer-Adyacente epitelio escamoso. PLoS ONE 8 (11): e78343. doi: 10.1371 /journal.pone.0078343
Editor: Nupur Gangopadhyay, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Julio, 2013; Aceptado: September 13, 2013; Publicado: 4 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Malhotra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. David Gold e Irene Blumenkranz para proporcionar apoyo subvención. los números de subvención y de la URL no están disponibles. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de esófago es actualmente el octavo cáncer más común en todo el mundo; con adenocarcinoma de esófago (EAC) que representa el 50% de los casos de cáncer de esófago [1] - [5]. La supervivencia de cinco años para el cáncer de esófago es inferior al 20% y su incidencia ha aumentado casi tres veces mayor en el hemisferio occidental en los últimos 20 años [6], [7]. La mayoría de los pacientes de EAC son diagnosticadas con enfermedad en estadio avanzado y tienen bajas tasas de supervivencia a largo plazo con los agentes quimioterapéuticos empleados en la actualidad [5], [8], [9]. La eficacia de los regímenes actuales ha alcanzado una meseta y una mayor intensificación de agentes citotóxicos o aumento de la dosis de radiación se ha demostrado que se asocia con efectos secundarios adversos significativos. En consecuencia, se requiere la necesidad para el desarrollo de terapias dirigidas efectivas destinadas al tratamiento de mecanismos específicos de carcinogénesis con el fin de mejorar la supervivencia [2] -. [4], [10], [11]
survivina, también conocido como baculoviral inhibidor de la apoptosis de repetición que contienen 5 o BIRC5, es un inhibidor de la apoptosis o muerte celular programada [10] - [13]. El mecanismo de acción a través de la vía intrínseca es la siguiente: survivin se une e inhibe la caspasa 9, causando la desactivación de la ruta apoptótica; procaspasa 3 no se escinde y por tanto no escindir PARP (polimerasa poli ADP-ribosa); como resultado, PARP permanece activa y continúa con la reparación del ADN, lo que resulta en la inhibición de la apoptosis (Figura 1) [8], [10], [11], [13], [14]. Ordinariamente survivin sólo se encuentra durante el desarrollo embrionario y fetal como un medio para regular la división celular adecuada y el crecimiento y es indetectable en los tejidos normales más terminales diferenciadas [15]. Algunos tejidos normales adultos con expresión de survivina persistente incluyen células madre hematopoyéticas [16], timocitos [17], [18] melanocitos, mucosa gástrica [19] y el epitelio del colon [19]. Estudios han informado de aumento de la expresión de survivina en una serie de tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, pulmón, melanoma, leucemia, linfoma, colon, páncreas, y etc. [15]. La evidencia también es compatible con más de expresión de survivina en el carcinoma esofágico de células escamosas y su asociación con un mal pronóstico [3], [4], [8], [10], [11], [20]. Debido a que la survivina no se expresa en la mayoría de los tejidos sanos, representa una diana ideal para el desarrollo de nuevos agentes de cáncer [3], [4], [8], [10], [11], [13], [20 ], [21]. En agentes informativas dirigidas a survivina se encuentran actualmente en fase I y fase II de ensayos clínicos en pacientes con cáncer avanzado donde los métodos incluyen la inhibición de oligonucleótidos antisentido (ASO), represores de la transcripción, y la inmunoterapia [10], [14], [22]. Algunos de estos agentes han demostrado resultados iniciales prometedores, sin embargo ninguno de ellos ha mejorado la supervivencia global [3], [4], [7], [10], [11], [14], [22] - [24].
survivina se une e inhibe la caspasa 9, caspasa 9 es incapaz de escindir la caspasa 3, caspasa 3 no es capaz de escindir PARP, PARP promueve la reparación del ADN y no induce apoptosis.
Aunque hay ha habido muchos informes que analizan el papel de la survivina en el carcinoma de células escamosas de esófago (SCC), muy pocos estudios han abordado su papel en el adenocarcinoma de esófago (EAC) [3], [4], [7] - [9], [21] , [25], [26]. En la expresión de adición de este gen anti-apoptótica en el epitelio escamoso cáncer adyacente (CASE) no ha sido estudiada. El objetivo de nuestro estudio, por lo tanto, era 1) para determinar el grado de survivin hasta la regulación en muestras de pacientes de EAC y la caja, 2) evaluar la recurrencia y la supervivencia con la expresión de survivina en EAC y el tejido CASO, y 3) para examinar el efecto la inhibición de la survivina en la apoptosis en líneas celulares de EAC.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El estudio se realizó después de obtener la aprobación de la Universidad de Pittsburgh Junta de Revisión Institucional. Se tomaron muestras del Centro de Cáncer UPMC - Registro de Riesgo de Cáncer de esófago, Universidad de Pittsburgh IRB Número de Estudio 98-122 con el URL: http://www.upmccancercenter.com/trials/trialDisplay.cfm?id=2277&type=D. Como parte del estudio, todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con consentimiento por escrito completo.
Líneas Celulares
Las líneas de células OE19 EAC (JROECL19) y OE33 (JROECL33) se obtuvieron a través de Sigma-Alderich (St. Louis, MO). Ambos fueron mantenidos en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1.640 medios de crecimiento celular (Life Technologies, Carlsbad, CA, 21870076), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, 26140079), 1% L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25030081), 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, 15070063). Todas las células se almacenan en 25 cm
2 frascos y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 aire humedecido. se utilizó tripsina-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25200072) para cosechar las células de su matraz y preparar una suspensión de células individuales para el análisis de Western blot y la transcripción inversa -. polimerasa reacción en cadena (RT-PCR)
siRNA transfección
OE33 y OE19 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 4 × 10
5 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con cualquiera de los dos pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) o sin tratar. Las categorías utilizadas siRNA incluyen survivin siRNA, o un control negativo (scramble) (Dharmacon, Lafayette, CO, D-001810-10-05). Cada solución se diluyó siRNA de la Bolsa de 100 mM a 5 mM en RNasa libre de H
2O, después se diluyó a 0,25 M en Opti-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, 31985062). Simultáneamente, 2 l de reactivo de transfección 4 (Dharmacon, Lafayette, CO, T-2004) por reacción se diluyó con 98 l de Opti-MEM. Las soluciones se incubaron por separado durante 5 minutos a temperatura ambiente, mezclados entre sí, y se incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente. La solución siRNA final se diluyó a 1 ml por reacción con Opti-MEM para una concentración final de 25 ηM. Las células se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 aire humidificado, con un cambio de medio RPMI después de 24 horas. lisado de células enteras se recogió a las 48 horas para el análisis de ARN o 72 horas para el análisis de proteínas.
Pacientes y Preparación del tejido
El estudio se llevó a cabo después de obtener la aprobación de la Universidad de Pittsburgh Junta de Revisión Institucional. Los pacientes que fueron sometidos a esofagectomía para el adenocarcinoma de esófago localizado desde principios de 2008 hasta finales de 2010, fueron incluidos en el estudio. Cuarenta y siete muestras fueron seleccionadas y después de excluir el carcinoma de células escamosas, cáncer adenoescamosa, y los bloques de tejido con menos del 70% del tumor, se analizaron un total de 37 muestras de pacientes para este estudio. Los datos clínicos como la edad, el sexo, la etnia, el estadio clínico, el estado vital, historia de tabaquismo, la supervivencia global y el tiempo hasta la recurrencia se obtuvo de la base de datos clínicos Departamento de Cirugía Cardiotorácica. Para garantizar la confidencialidad del paciente, un sistema intermediario honesto se utiliza para proporcionar el conjunto de datos clínicos des-identificada ligada a muestras de tejidos [27]. tejido fresco congelado embebido en OCT se utilizó para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) y análisis de transferencia Western. Fijado en formalina, se utilizó (FFPE) tejido incluido en parafina para inmunohistoquímica.
Análisis Western Blot
La proteína se recogió de cada grupo de tratamiento línea celular mediante la adición de tampón de lisis (tampón RIPA que contenía 0,1% proteasa mezcla cóctel inhibidor, 0,1% Halt fosfatasa mezcla cóctel inhibidor y 1% PMSF) y el uso de un elevador de célula. La solución se hizo girar durante una hora a 4 ° C para lisar completamente las células, entonces se centrifugaron a 12.000 g a 4 ° C durante 20 minutos para separar la proteína. Se recogió el sobrenadante que contiene la proteína y se cuantificó usando BCA Pierce Ensayo (ThermoFisher, Rockford, IL, 23227). Treinta y cinco g de proteína de cada muestra se desnaturalizó y se resolvieron por electroforesis en gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% (Bio-Rad, Hercules, CA, 161-1159), luego a electrotransferencia a una membrana Immobilon-P PVDF de nitrocelulosa (Millipore Corporation , Billerica MA, IPVH08100). La membrana se bloqueó en leche en polvo 5% sin grasa en TBS-T a temperatura ambiente durante una hora. El anticuerpo de interés se incubó con la membrana a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación 1,5 horas a temperatura ambiente en el correspondiente peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Señal Celular, Boston MA, 7074 o 7076, 1:3,000) anticuerpo survivina ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Tx, se utilizó sc-47750) en 1:200, caspasa-3 (señal celular, Boston, MA, 9665) en 1:1,000, escindido con PARP (señal celular, Boston, MA, 9546) en 1:2,000 y β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A1978) en 1:30,000 se utilizó como control de carga. Las señales fueron desarrollados usando un reactivo de quimioluminiscencia (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 509049324)
cuantitativa transcripción reversa -. Reacción en Cadena de la Polimerasa (QRT-PCR)
El ARN total se purificó a partir de líneas celulares usando el Kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA, 74004). Brevemente, los pellets que contienen 1 × 10
6 células se agitaron con vórtex en tampón de lisis RLT y se extrajo el ARN siguiendo el protocolo del fabricante usando un volumen de elución de 14 ul. El uso de un espectrofotómetro ND-2000 (NanoDrop Technologies, Inc, Wilmington, DE), la calidad y la cantidad de ARN se evaluó mediante OD
260/280. ADN complementario (ADNc) fue transcrito inverso a partir de 3 ug de ARN total usando RNA a cDNA premezcla ECODRY en un volumen total de 20 ul (Clontech, Mountain View, CA, 639547) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las condiciones de reacción fueron 42 ° C durante 60 minutos, seguido de 70 ° C durante 10 minutos utilizando termociclador ABI Prism 7900HT PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). PCR se realizó en un volumen total de 20 ul utilizando 600 ng de ADNc, 1 × Taqman PCR Mastermix universal (Invitrogen, Grand Island, NY, 4.304.437), y 1 × survivina o cebador GAPDH (Applied Biosystems, Carlsbad, CA hs03043576_m1 y hs99999905_m1) para cada reacción. Los parámetros de ciclación fueron: un ciclo de 95 ° C durante diez minutos, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, y 60 ° C durante un minuto en un sistema StepOne Plus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado técnicas.
Extracción de ARN total a partir de tejido fresco congelado se realizó utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA 74104). En resumen, 10 micras secciones de OCT se cortaron en tampón RLT, se lisaron usando una aguja de extremo romo de calibre 20 y se extrajo el ARN según las instrucciones del fabricante, utilizando un volumen de elución de 50 ul. QRT-PCR se realizó con el de un solo paso Kit qRT-PCR (Life Technologies, Carlsbad, CA 4310299) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un volumen total de 20 ul utilizando 2 ul de lisado de tejido y 1 × survivina o 1 × imprimación GAPDH ( Life Technologies, Carlsbad, CA hs03043576_m1 y hs99999905_m1) para cada reacción. Las condiciones del ciclo utilizados fueron: 1 ciclo de 50 ° C durante 30 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, y 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 45 segundos utilizando ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Carlsbad, CA). Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado técnicas. gráficas de amplificación de ambas categorías de ejemplo, líneas celulares y tejidos congelados frescos fueron examinados con software StepOne, proporcionado con el sistema StepOne Plus, para determinar el ciclo umbral (CT). GAPDH se utilizó para la normalización de los datos de expresión. El 2 Se utilizó el método
-ΔCT para determinar survivina veces la expresión en el tejido tumoral y CASE.
inmunohistoquímica
FFPE secciones fueron immunostained para mostrar survivin expresión en el tumor de la CAO y pareados muestras epiteliales escamosas . amígdala humana reactiva y suero no inmune se llevaron a cabo en paralelo como controles positivos y negativos, respectivamente. Las muestras de tejido fueron cortadas a 4 micras en portaobjetos cargados y deparaffinized. Los portaobjetos se sumergieron en 0.01% Triton X-100 durante diez minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron en grifo H
2O, entonces sumergido en 10 mM de tampón citrato, pH 6,0 a 95 ° C durante 20 minutos para la recuperación de antígeno. El bloqueo producido por el 3% de H
2O
2, seguido de un lavado con agua del grifo. Después de tres lavados de 1 x solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,001% (TBS-T), los portaobjetos se bloquearon adicionalmente en suero normal de caballo 2,5% (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401). El anticuerpo primario survivina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc47750) se aplicó a las 1:50, durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron tres veces en TBS-T, a continuación, se incubaron en reactivo anti-conejo ImmPress (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401) durante 30 minutos para ayudar en la detección de la expresión de survivina. Una vez más, los portaobjetos se lavaron tres veces en TBS-T, y se desarrollaron usando IMMPACT DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK4105).
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (IBM, Armonk, NY, Version 20). Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Dentro de cada muestra de tejido, los valores medios de los niveles de expresión de ARNm de survivina (determinados por 2
-ΔCT método) fueron evaluados tanto en el tejido tumoral EAC (nivel survivina tumor) y muestras de tejido CASO (nivel survivina normal). Se utilizó la prueba t de Student para comparar medio del tumor y los niveles de survivina normales. Se utilizó el análisis características operativas del receptor (ROC) para determinar si los niveles de survivina podría ser utilizado para definir grupos de alto y bajo riesgo de recurrencia; los umbrales de riesgo de alto riesgo /bajo establecidas en la República de China y los análisis se utilizan para clasificar a los pacientes como de alto riesgo /bajo riesgo para ambos niveles de survivina tejido CASE y los niveles de survivina tejido de la CAO. Se realizaron análisis separados ROC predecir la recurrencia de los niveles de survivina tejido CASE y de los niveles de survivina tejido de la CAO. En ambos casos la inspección visual de las figuras gráficas producidas se utiliza en conjunción con Survivin enumerados puntos de corte de incisiones con sensibilidad y (1 menos) especificidad correspondiente con el fin de determinar los umbrales óptimos para definir grupos de alto y bajo riesgo.
En cuanto el procedimiento ROC para la determinación del umbral, se utilizó el método estándar de la inspección visual de la curva para determinar ese punto a la esquina superior izquierda de la figura ROC más cercano, junto con la inspección de los valores de sensibilidad y especificidad correspondiente a lo largo de los valores disponibles. Esto proporciona un medio para determinar el valor que proporciona el mejor equilibrio entre sensibilidad y especificidad. Tras la inspección de las figuras ROC, esta inspección era relativamente sencillo para caso, sin embargo fue algo menos evidente para los niveles de células tumorales. En ese caso, un valor que se eligió destacó la sensibilidad a expensas de la especificidad, como los falsos negativos fueron juzgados a ser más peligroso que fueron falsos positivos. Esto se basó en mayor medida de los valores de sensibilidad /especificidad calculados como había una AUC no significativa (área bajo la curva) y el punto de corte en consecuencia, no visualmente aparente.
curva de Kaplan-Meier se generó para determinar la supervivencia basada en la alta y los grupos de riesgo de recurrencia baja. Un Mantel-Cox Log Rank Test se llevó a cabo con el fin de comparar la supervivencia general entre los grupos de riesgo. Un modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para evaluar la eficacia de nivel de survivina en ambas muestras de tejido EAC caso y en la predicción de la mortalidad.
Resultados
La sobreexpresión de survivina en líneas celulares de tumores humanos, la CAO y el caso tejido
expresión de ARNm de survivina fue significativamente mayor en las muestras tumorales en comparación con muestras de tejido de caso sobre el análisis de QRT-PCR (Figura 2A). Por término medio, las muestras tumorales demostraron niveles de expresión de survivina 3 × mayor que la del tejido CASE (p & lt;. 0.00001 Figura 2B). La inmunohistoquímica (Figura 3) y el análisis Western Blot (datos no mostrados) también confirmaron la expresión de survivina tanto en tumor EAC, así como CASE
A:. QRT-PCR se realizó para comparar la expresión de survivina entre tumor y epitelial escamosa adyacente tejido. B: En promedio, las muestras tumorales mostró 3 × mayor expresión de survivina que el tejido adyacente emparejado
expresión de survivina se evaluó mediante la tinción IHC, tejido tumoral y el epitelio escamoso adyacentes mostraron presencia de tinción indicativo de la expresión de survivina.. Las flechas representan la tinción positiva.
La inhibición de la survivina en las líneas celulares de la CAO produjo un aumento de la apoptosis
siRNA dirigidos a survivina generado una disminución en la expresión de survivina en OE19 y OE33 líneas celulares en comparación con los controles en QRT-PCR (Figura 4A). Del mismo modo, siRNA de incubación dio como resultado la regulación por disminución de la expresión de survivina en ambas líneas celulares en análisis de Western Blot. La disminución de la expresión de survivina resultó en la regulación positiva de la proteína de apoptosis aguas abajo, PARP escindida. Exfoliados caspasa 3 se consumió a través de la reacción con PARP, lo que resulta en la regulación positiva de PARP escindido (Figura 4B).
líneas de células OE19 y OE33 EAC fueron transfectadas con siRNA y la expresión de survivina se analizó entre el control y las líneas celulares transfectadas. Ambas líneas celulares transfectadas con siRNA mostraron una inhibición clara y regulación a la baja de la expresión de survivina. B: Western blot de la inhibición de siRNA de survivina en la línea celular de EAC. siRNA se incubó con líneas de células OE19 y OE33 para inhibir la expresión de survivina. ß-actina se utilizó como control de carga. Survivina se downregulated, mientras que las proteínas apoptóticas aguas abajo escindidos de caspasa 3 y PARP escindida se upregulated. La regulación al alza de las proteínas apoptóticas aguas abajo indica la apoptosis se produce a través de la incubación con siRNA.
Las implicaciones clínicas de la sobreexpresión de survivina
Treinta y siete pacientes que se sometieron a EAC esofagectomía para el adenocarcinoma de esófago localizado fueron incluidos en el estudio (Tabla 1). Las muestras compuestas treinta hombres (81%) y siete mujeres (19%) con edades comprendidas entre 44 y 90 años (media = 62,76, SD = 10.94). La distribución por etapas de la cohorte del estudio basado en el Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) confirmó la estadificación del cáncer 6 pacientes con enfermedad en estadio I, 13 con estadio II y 18 pacientes con enfermedad en estadio III (Tabla 2). Siete pacientes recibieron terapia neoadyuvante y dieciocho pacientes recibieron quimioterapia adyuvante después de la cirugía. Dos pacientes en el grupo neo-adyuvante recibieron concurrente quimio-radiación y la mayoría de los pacientes recibieron platino /basado fluorouracilo quimioterapia de combinación (Tabla 3). En un seguimiento medio de 12,06 meses, trece pacientes desarrollaron recurrencia, 12 pacientes con recidiva a distancia y 1 paciente para el que no se informó de datos. De los 12 pacientes con recurrencia a distancia, 3 también tuvieron una recidiva local. Diez pacientes (77%) habían muerto en el momento de largo plazo de seguimiento.
ROC análisis indicó que un umbral superior o igual a 2,85 para la survivina media la expresión del ARNm en caso era indicativo de un mayor riesgo de recidiva a distancia con una sensibilidad de 0,77, una especificidad de 0,83, y una AUC de 0,73 (p. & lt; 0,05 PPV = 0,71, VAN = 0,87) (Figura 5). Así, los pacientes que muestran la expresión de survivina media de 2,85 o más en el caso fueron clasificadas en el grupo de alto riesgo y aquellos con niveles de expresión de menos de 2,85 se clasificaron en el grupo de bajo riesgo. A pesar de un aspecto histológico normales, la sobreexpresión de survivina en CASO resultó ser un indicador de la recurrencia distante. survivin expresión en el tejido tumoral no se correlacionó con la recurrencia. Categorización en grupos de alto y bajo riesgo utilizando un umbral
tumor
expresión de survivina de 3,66 no predecir la recurrencia (p = 0,55), pero predijo un aumento en las probabilidades de muerte por EAC (descrito posteriormente).
se determinó la probabilidad de recurrencia a distancia para los niveles de survivina en el tumor EAC humana y los tejidos epiteliales escamosas adyacente. Una concentración elevada de survivina en el tejido epitelial escamosa adyacente se determina que es un factor de riesgo para la recurrencia a distancia (p = 0,02).
Kaplan-Meier de supervivencia se generaron para los grupos de alto y bajo riesgo basado en CASE la expresión de survivina. El grupo de alto riesgo demostró una asociación con una mayor mortalidad, aunque la correlación no fue significativa (p = 0,12, Figura 6). El análisis de Kaplan-Meier para los grupos de alto y bajo riesgo de survivina tumor produjo resultados similares (p = 0,11).
curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se generaron para los grupos de alto y bajo riesgo en base a la expresión de survivina CASO epiteliales escamosas adyacente. El grupo de alto riesgo demostró una asociación con una mayor mortalidad, aunque la correlación no alcanzó significación. El análisis de Kaplan-Meier para los grupos de alto y bajo riesgo de survivina tumor produjo resultados similares (p = 0,11).
Un modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para evaluar la eficacia de nivel de survivina en ambos casos y el tumor de EAC muestras de tejido en la predicción de la mortalidad. Otros factores de riesgo considerados fueron la edad en el momento de la esofagectomía, el consumo de tabaco (en paquetes por año), el consumo de alcohol, y una historia de esófago de Barrett (Tabla 4). El tabaquismo se asocia con una mayor tasa de muerte (p = 0,06) con las probabilidades de mortalidad es mayor de 1,018 para cada paquete por año ahumado. survivin expresión en el tejido tumoral se asoció con un mayor riesgo de muerte (p = 0,05). La probabilidad de un paciente en el grupo de survivina tumor de alto riesgo de experimentar la muerte era 5,23 veces mayor que la de un paciente clasificado en el grupo de bajo riesgo (p & lt; 0,05)
Discusión
.
los estudios han demostrado altos niveles de survivina en el epitelio columnar metaplásico y el epitelio de Barrett displásico comparación con el tejido escamosas apoyando así la hipótesis de que la regulación positiva de este gen es probable un evento temprano anterior desarrollo de adenocarcinoma [12]. Los informes también han apoyado la survivina como un biomarcador potencial en el carcinoma esofágico de células escamosas [28] pero no hay pruebas contradictorias con respecto a su papel pronóstico en el adenocarcinoma de esófago [29]. En un estudio realizado por Rosato y sus colegas, la expresión de survivina carece de valor pronóstico para los pacientes con EAC. [9] El objetivo del presente estudio fue evaluar el papel de este gen anti-apoptótica en mayor profundidad en el adenocarcinoma esofágico y CASE teniendo en la heterogeneidad del tumor consideración, así como la expresión de los cambios genéticos antes de la manifestación histológica del fenotipo tumoral en el epitelio adyacente .
El análisis del tejido humano usando IHC, Western blot, y QRT-PCR confirmó la regulación al alza de survivina en el tejido tumoral en comparación con EAC CASO. Nuestros resultados establecen que el aumento de la expresión de survivina en el tejido tumoral EAC es un factor de riesgo para la muerte; el grupo survivina tumor de alto riesgo 5 veces más probabilidades de morir que las clasificadas en el grupo de bajo riesgo survivina. Es posible que la expresión más alta en el tejido tumoral EAC puede relacionarse con la agresividad del tumor (es decir, el empeoramiento de la desregulación celular), por lo tanto, la correlación con la mortalidad. Sin embargo, con base en el tamaño de nuestra muestra, este estudio es probable poca potencia, y se necesitaría más grandes series de pacientes para estudiar estas asociaciones aún más.
Además expresión de survivina en caso de que no era del todo ausente, como era de esperar para terminales diferenciada epitelio normal escamosas [10], [11]. Teniendo en cuenta pruebas que demuestran la regulación positiva de este gen en metaplásico pre-maligna y el epitelio columnar displásico, nuestros datos sugieren que la sobreexpresión de survivina puede ser un evento genético temprano que ocurre en histológicamente normales que aparecen epitelio escamoso antes del desarrollo de metaplasia y transformación a adenocarcinoma. Aunque la mucosa adyacente al tumor mantiene diferenciación escamosa, alberga la sobreexpresión de este gen anti-apoptótica que podría ser un conductor de potencial de la tumorigénesis. Alternativamente, podría ser postulado que sobre la base de la correlación con la recurrencia, la expresión de survivina en caso podría ser considerado como el equivalente molecular de un margen positivo y /o un factor de predicción de la recurrencia distante. Si los niveles elevados de survivina en caso representa la evidencia molecular que el tejido adyacente está mostrando signos de malignidad, el pronóstico puede ser peor que el previsto por el sistema de clasificación pTNM. Se podría postular que el hecho de que no hubo un aumento de la mortalidad en pacientes con niveles elevados de survivina en caso podría representa un error de tipo II debido al tamaño pequeño de la muestra. Los estudios más grandes pueden ayudar a aclarar estas asociaciones
El hecho de que la expresión de survivina en el tumor no se correlacionó con la recurrencia podría ser el hecho de que estos pacientes habían muerto antes de recurrencia podría haber sido documentada.; Esta suposición se apoya en el hecho de que hubo más pacientes con enfermedad en estadio avanzado en el grupo de la expresión tumoral de alto riesgo. Por otra parte, como se evidencia a partir de estudios anteriores, cada tumor exhibe heterogeneidad significativa con variaciones intra-tumorales en mutaciones somáticas, la composición alélica, supresor de tumor y la desregulación oncogénica [30]. El predominio de múltiples clones únicos en el tejido tumoral muestreado puede conducir a resultados inconsistentes cuando se realiza el perfil molecular de un cáncer determinado. En el presente estudio, el cambio veces en el ARNm de survivina fue muy variable en el tejido tumoral en comparación con el caso y esto puede reflejar la heterogeneidad del tumor y proporcionar una posible explicación para la falta de correlación con la recurrencia del tumor. Caso demostró niveles más consistentes y es quizás un mejor sustrato para la evaluación de la survivina como un marcador de pronóstico en pacientes con EAC. Estos datos ponen de relieve la necesidad de un esfuerzo concertado para depositar y analizar histológicamente los tejidos normales que aparecen con el cáncer adyacente para características moleculares en el EAC y quizás otros tumores.
análisis de la línea celular en el presente estudio confirmó clara inhibición de la survivina mediante transfección con siRNA. La survivina se downregulated eficazmente y se escindió de la caspasa 3 se consume en la reacción que conduce a la regulación positiva de PARP escindida, lo que indica que la inhibición de survivin conduce a la activación de la vía apoptótica. Como survivina no se expresa en el tejido normal, es potencialmente una diana ideal para nuevos agentes [10], [11]. Por lo tanto, la inhibición efectiva a través de siRNA con la activación de la apoptosis aguas abajo apoya la validez de los ensayos clínicos futuros en EAC evaluar la eficacia de un nuevo agente que utiliza siRNA o otras vías inhibidoras [10].
En conclusión, los presentes soportes de estudio regulación al alza de survivina como un cambio genético precoz potencial en EAC producirse al respecto apariencia normal. survivin expresión en el tejido EAC fue un predictor significativo de la mortalidad, mientras que el nivel de expresión de survivina en caso fue un predictor más fiable de la recurrencia del tumor. Además también hemos demostrado que la inhibición de la survivina en líneas celulares de EAC conduce a la regulación positiva de la apoptosis más el apoyo a la evaluación de estrategias terapéuticas dirigidas a este marcador
.
Las limitaciones del estudio incluyen el pequeño tamaño de la muestra y una duración relativamente corta de Seguir. Otros estudios con tamaños de muestra más grandes y un seguimiento más largo puede ayudar a aclarar algunas de las asociaciones observó en los estudios sobre la expresión de survivina en EAC y CASE. Esto también ayudaría control para más factores que afectan a la recurrencia y la supervivencia en pacientes con EAC.
Reconocimientos
Dr. James D. Luketich por su apoyo del estudio.