Extracto
El p53 y las vías de NF-kB juegan un papel importante en diversas funciones celulares, incluyendo el crecimiento celular, la apoptosis y la tumorigénesis. Las mutaciones que inactivan el gen p53 y la activación de NF-kB constitutiva son acontecimientos comunes en los cánceres humanos. A pesar de que muchos fármacos se están desarrollando que activan selectivamente p53 o inhibe NF-kB, hay pocos candidatos a fármacos que pueden hacer ambas cosas. Por lo tanto, la activación simultánea de p53 y la inhibición de la ruta de NF-kB es un objetivo primordial para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer. Este estudio es el primer informe de un enfoque de alto rendimiento con compuestos de masas que se dirigen simultáneamente ambas vías. El uso de un ensayo de selección basado en células y una biblioteca de 200.000 compuestos sintéticos, se identificaron 9 pequeñas moléculas que inhiben simultáneamente NF-kappa B y activan p53. Uno de estos compuestos, N-2, el aumento de la expresión de genes diana de p53, incluyendo p21 y GADD45a. Además, N-2 inhibe la actividad transcripcional de NF-kappa B, reprimiendo de forma concomitante la interleucina-6 y proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1) expresión. Cuando se trataron líneas celulares derivadas de una amplia gama de cánceres
in vitro
con N-2, se observó el aumento de muerte celular. N-2 también inhibió significativamente el crecimiento de aloinjerto en modelos murinos de melanoma y carcinoma de pulmón. Nuestros hallazgos sugieren que la N-2 puede actuar como un agente anti-cáncer bivalente través de la modulación simultánea de las actividades de p53 NF-kB y
Visto:. Hwang SG, J Parque, Parque JY, Parque CH, Lee KH, cho JW, et al. (2012) actividad anticancerígena de un nuevo compuesto pequeña molécula que activa simultáneamente p53 e inhibe la señalización NF-kB. PLoS ONE 7 (9): e44259. doi: 10.1371 /journal.pone.0044259
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: 31 de julio de 2012; Publicado: 13 Septiembre 2012
Copyright: © Hwang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por SK biofarmacéuticos Co., Ltd., y donaciones (2011K00277) del Centro de Investigación del cerebro del Programa de Investigación siglo 21 Frontier. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SGH, CHP, KHL, JYP y JWC son empleados de SK biofarmacéuticos Co., Ltd. (Daejeon, Corea del Sur), uno de los patrocinadores de este estudio. SK biofarmacéuticos Co., Ltd., está desarrollando fármacos de moléculas pequeñas para enfermedades como trastornos del SNC y diversos tipos de cáncer. No hay patentes, otros productos en desarrollo o productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El NF-kB y p53 vías de señalización función en casi todos los tipos de células y se activan en respuesta a numerosos estímulos biológicos. NF-kB es un jugador clave en diversas funciones celulares [1], [2]. Aunque primero identificado como un factor de transcripción implicado en la respuesta inflamatoria, la evidencia experimental sugiere que NF-kappa B también regula el crecimiento celular, la supervivencia y la apoptosis [3]. I? B proteínas inhiben la función de NF-kB mediante la prevención de NF-kB de unión al ADN. La activación de NF-kappa B implica la fosforilación de residuos específicos de serina I? B por quinasas I? B (IKK) que conducen a la degradación mediada por proteasoma de I? B. Tras la degradación de I? B, el complejo de NF-kappa B es entonces libre para entrar en el núcleo donde se puede regular la expresión de genes específicos relacionados con respuestas inflamatorias o inmunes, respuestas de supervivencia celular, y la proliferación celular [4]. La proteína p53 supresor de tumores es un factor de transcripción de unión a ADN que juega un papel importante en la vigilancia de la célula en respuesta a diversas señales de estrés [5]. p53 activada induce la expresión de varios genes relacionados con la detención del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia, la traducción, y la reparación del ADN. La fosforilación de p53 en los residuos de serina particulares implica su propia actividad. Por ejemplo, la fosforilación de las serinas 9 y 46 se relaciona con la inducción de la apoptosis y daño en el DNA [6], [7]. La fosforilación en las serinas 15 y 20 conduce a una interacción reducida con su regulador negativo, murino doble 2 minutos (MDM2). MDM2 inhibe la acumulación de p53 por la orientación para la degradación mediada por el proteosoma [8], [9].
La activación constitutiva de NF-kB se observa con frecuencia en los cánceres humanos de diversos orígenes, incluyendo de pulmón, melanoma y el cáncer colorrectal , y se asocia con la angiogénesis, la resistencia a la quimioterapia, y la supervivencia de las células madre del cáncer [10], [11], [12], [13]. Tumor de células asociadas a NF-kappa B y sus genes regulados, tales como la citocina IL-6, se han relacionado con el desarrollo de quimiorresistencia en varios tipos de cáncer [14], [15]. Por ejemplo, IL-6 está elevado en el suero y ascitis de pacientes con cáncer de ovario y el aumento de IL-6 concentraciones se correlacionan con un mal pronóstico y la quimiorresistencia [16]. Tal resistencia a la quimioterapia puede afectar gravemente a la eficacia de los agentes anti-cáncer. La ruta de NF-kappa B ha ganado más atención como una diana terapéutica emergente en las células cancerosas que albergan mutaciones en la familia de genes Ras, una de las familias de genes más frecuentemente mutado en los cánceres humanos. Se sabe que aproximadamente el 20 al 30% de los pacientes con cáncer de pulmón no de células pequeñas (aproximadamente el 85% de todos los cánceres de pulmón) tienen mutaciones oncogénicas en k-Ras [17]. La inhibición de la señalización de NF-kappa B deteriora la transformación celular y sensibiliza las células cancerosas Ras mutado para someterse a apoptosis [11], [18], [19], [20], [21]. Por tanto, esta inhibición podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de tumores que tienen mutaciones Ras y otros cánceres que expresan Ras constitutivamente activo.
Las mutaciones en el gen p53 son más comunes en los tumores que mutaciones en la familia de genes Ras. De hecho, p53 está mutado directamente en aproximadamente el 50% de los tumores humanos [22]. por lo tanto, restauración de la función de p53 puede proporcionar una estrategia terapéutica atractiva para dirigir células del cáncer y, por tanto, moléculas pequeñas tales como el MDM2 antagonista Nutlin-3 [23], la molécula de unión p53-RITA [24], y el ácido gambogic MDM2 down-regulador [ ,,,0],25], se han desarrollado. Sin embargo, la restauración de la función de p53 no es suficiente para la pérdida de células completa del tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión de p53 no tuvo efecto sobre el desarrollo de lesiones de bajo grado, como adenomas y p53 no causa pérdida de células completa del tumor en lesiones de alto grado, tales como carcinomas [26], [27], [28].
Muchos estudios han investigado el papel del NF-kB y p53 vías en condiciones patológicas, en particular el cáncer [4], [29]. La activación de la ruta de NF-kappa B y la inactivación de la vía de p53 se detectó en diversos tipos de cáncer. Sin embargo, es poco probable que un agente de dirección sólo una de estas vías puede ser eficaz para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, dada la complejidad de la tumorigénesis. Varios agentes quimioterapéuticos p53 inductor se han reportado para inducir p53, así como NF-kappa B en diferentes tipos de células [30]. A pesar de la apoptosis inducida por p53, la activación de NF-kappa B es capaz de promover la resistencia a la apoptosis. la activación de NF-kappa B constitutiva ha sido reportada en diversos cánceres humanos y también está relacionado con la resistencia a los medicamentos [11].
Estos resultados sugieren fuertemente que los compuestos con la capacidad de reprimir la función de la vía NF-kB al mismo tiempo que la activación de la p53 vía podría poseer una mayor eficacia anti-cáncer. De hecho, la quinasa dependiente de ciclina (CDK) seliciclib inhibidor (R-roscovitina) [31] y la quinacrina fármaco contra la malaria (QC), un 9-aminoacridina (9AA) -derivative [32], poseer esta doble actividad y están actualmente en fase de ensayos clínicos II como agentes anti-cáncer. Control de calidad y seliciclib se reportan para inhibir NF-kB mediante la inhibición de la Ser-536 fosforilación de la subunidad p65 de NF-kB [31], [32]. Ser-536 fosforilación de la subunidad p65 es esencial para la actividad de NF-kB y la desfosforilación de este sitio convierte NF-kappa B en una forma no activa. Además de esta actividad, QC es capaz de activar la vía de p53 y inducir la muerte de las células tumorales a través de la proteína asociada a Bcl-2 X (BAX) [33] y seliciclib p53 activate mediante la inhibición de MDM2 mediada por la degradación de p53 [34]. Por lo tanto, estos fármacos presentan una oportunidad prometedora para el tratamiento de cánceres en los que ambas vías están desreguladas y Ras es constitutivamente activa.
En el presente estudio, hemos identificado compuestos de moléculas pequeñas que a la vez activan p53 e inhibe NF-kB utilizando un enfoque genético químico hacia adelante. De estos compuestos, N-2 indujo la muerte de diversos tipos de células de cáncer a través de la inhibición de NF-kappa B y la inducción de p53. N-2 también inhibió el crecimiento tumoral en el melanoma B16F10 y modelos de aloinjertos de pulmón murino LLC carcinoma. Por lo tanto, N-2 podría representar un potencial fármaco quimioterapéutico con la posibilidad de dirigir una amplia gama de tumores malignos.
Resultados
Identificación de pequeñas moléculas que activan simultáneamente p53 e inhiben NF-kappa B
la biblioteca se cribó para identificar compuestos que modulan simultáneamente la p53 y las vías de NF-kB. Para evaluar la sensibilidad y la robustez del ensayo basado en células antes de HTS escénicas, confirmamos perfiles de dosis-respuesta en el formato HTS usando el parthenolide control positivo que bloquea LPS inducido por la actividad de NF-kappa B (Fig. 1A). El IC
50 parthenolide valor de 7,2 M, que está de acuerdo con un informe anterior [35], [36]. La optimización y la miniaturización de HTS se realizaron para conseguir formatos de placas de 384 pocillos. Los valores de las placas de cultivo celular de la Z 'eran & gt;. 0.6
C6 células derivadas de glioma de rata llevar a p53 de tipo salvaje se utilizaron para rastrear la biblioteca. (A) La respuesta dependiente de la dosis del gen reportero NF-kappa B con concentraciones crecientes de parthenolide. (B) El cribado de compuestos que inhiben el gen reportero NF-kB mediante la biblioteca de 200.000 compuestos. Los compuestos que inhibieron 100 ng ml actividad de reportero /inducida por LPS más de 80% fueron seleccionados como accesos primarios (n = 797). (C) El cribado de los compuestos de golpe primarios para la activación del gen reportero de p53. Los compuestos que activan el reportero p53 más de 3 veces fueron seleccionados como los golpes finales (n = 9). (D) Resumen de los procedimientos HTS. La relación total de éxito fue de aproximadamente 0,0045%.
La primera ronda de HTS utilizando el gen reportero de NF-kB identificó 797 accesos primarios, lo que equivale a una tasa de aciertos 0,4% (fig. 1B). luego un segundo HTS se realizó para evaluar la capacidad de estos 797 compuestos para activar el gen informador de p53. Esta pantalla identifica 9 compuestos que cumplían los criterios del estudio (Fig. 1C). La proporción de aciertos total del proceso de selección fue 0,0045% (Fig. 1D).
Clasificación de pequeña molécula bivalente compuestos
Los 9 compuestos finales identificados después de dos rondas de HTS se agruparon por su composición química estructura (Fig. 2). Grupo D incluido 9AA-derivados, tales como 9AA y control de calidad. Los 9AA derivados 9AA-1 y 9AA-2 se han reportado para activar p53 pero la inhibición de NF-kappa B no se ha informado [33], [37]. La mitad de los afectados fueron compuestos derivados de estos compuestos 9AA y mostró una buena correlación entre la inhibición de NF-kB y p53 potencial de activación (R
2 = 0,85, figuras complementarias. S1 A y B).
Los compuestos que inducen la reportero p53 más de 3 veces y simultáneamente inhibe el reportero NF-kB en más de un 80% se incluyeron en los análisis (n = 9). Además, se incluyeron 8 derivados menos activos de estructura similar para la estructura: Evaluación relación actividad. Los valores entre paréntesis corresponden a la máxima inducción reportero sensible a p53 en las células tratadas durante 8 h con cada compuesto (0,4 a 25 mM). la inhibición de NF-kB relativa se presenta como el porcentaje de inhibición de la reportero NF-kappa B en presencia de 10 mM de cada compuesto. Los 17 compuestos se agruparon de acuerdo a la similitud estructural (Grupos A-D).
El piperlongumine compuesto del Grupo A (PIP) ha informado de matar selectivamente las células cancerosas en base a las características específicas de cáncer y este compuesto se proyectó previamente usando un ensayo de indicador sensible a p53 en células de osteosarcoma U2OS [38]. Curiosamente, en nuestra pantalla, encontramos que el PIP no sólo se activa p53 sino que también es un fuerte inhibidor de la actividad de NF-kB (Fig. 2).
Entre los nuevos compuestos de golpe, N-2 (5-Ehyl- -phenanthridinium 3-metil-6- (1-methly-1H-pryidin-2-ilidenmetil), C
23H
23N
2, PM = 327,5) mostró el perfil más prometedor. N-2 inducida por el reportero de p53 más de 10 veces y la actividad de NF-kB inhibió fuertemente en comparación con otros nuevos éxitos en los Grupos A a la D. Por lo tanto, elegimos este compuesto para otros análisis. QC, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer de próstata resistente a taxanos refractario a las hormonas, y 9AA fueron seleccionados como compuestos de control.
N-2 inhibe NF-kappa B y sus genes diana aguas abajo de IL-6 , MCP-1, y de la óxido nítrico
en comparación con 9AA y QC, N-2 mostraron una mayor inhibición de la reportero NF-kB en las células C6 cuando se añade simultáneamente con LPS 100 ng /ml. El IC valores
50 de 9AA, control de calidad, y N-2 para el gen indicador de NF-B fueron de 23,8 M, 50,4 mM y 5,9 mM, respectivamente (Fig. 3A). LPS estimula la producción de óxido nítrico mediada por NF-kB así como la expresión de citocinas y quimiocinas, tales como IL-6 y MCP-1 [39]. El tratamiento de macrófagos RAW 264.7 murinos con N-2 producción de óxido nítrico inducida por LPS inhibió fuertemente; la IC valores
50 de la producción de óxido nítrico por 9AA, QC, y N-2 eran 7,8 M, 33,7 m, y 0,64 M, respectivamente (Fig. 3B). También se evaluó la inhibición de LPS inducido por IL-6 y MCP-1 en las células RAW 264.7. N-2 y la parthenolide control positivo, inhibió la IL-6 y MCP-1 la producción de proteínas (Fig. 3C). El tratamiento con N-2 (1 M) inhibió la fosforilación inducida por LPS de Ser-536 de la subunidad p65 de NF-kappa B, similar a 20 M de 9AA (Fig. 3D). Juntos, N-2 inhibió fuertemente el reportero NF-kB y su citoquina aguas abajo IL-6 (Figs. 3B y C), una propiedad que proporciona una base para la terapia del cáncer quimiorresistente usando N-2.
(A ) La dependencia de la dosis de la actividad luciferasa gen indicador de NF-B se determinó en células C6 con concentraciones crecientes de 9AA, control de calidad, y N-2 (media ± desviación estándar de tres experimentos independientes). (B) La inhibición dependiente de la dosis de óxido nítrico (NO) se determinó con concentraciones crecientes de 9AA, QC, y N-2 en células RAW 264.7. Los resultados mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos. (C) Los niveles de IL-6 y MCP-1 en células RAW 264.7 después del tratamiento con parthenolide (Par) o N-2 en presencia de LPS. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de cuatro ensayos. * P & lt; 0,01 mediante la prueba t de Student pareada. (D) Análisis de Ser536 fosforilación de la subunidad p65 de NF-kappa B en células RAW 264.7 después del tratamiento de 1 h con 20 mM de QC o 1 M de N-2 en presencia de LPS. β-actina se utilizó como control de carga.
N-2 activa p53 en células de cáncer de origen diverso
N-2 aumenta la expresión de proteína p53 endógena total y la expresión de su objetivo p21 gen en células de cáncer de pulmón humano A549 y B16F10 células de melanoma murino en un tiempo y manera dependiente de la dosis (Figs. 4A y 4B). La activación de p53 endógeno y p21 alcanzó niveles máximos de 8 h después del tratamiento con N-2 en las células A549 y 16 h en las células B16F10. N-2 induce el gen informador de p53 y p21 su gen diana endógeno en las células HCT116 con mayor eficacia que QC (Figs. 4C y 4D). La activación del informador sensible a p53 por 1 M de N-2 mostró una cinética similar a 10 M de control de calidad o 1 M Dox (Fig. 4E). El efecto máximo de Dox, N-2 y de control de calidad sobre la activación de p53 reportero se observó a los 12 a 20 h después del tratamiento, mientras que 3 M de taxol muestra actividad de reportero p53 pico después de 40 h (Fig. 4E). 9AA, QC, y N-2 activa el gen indicador de p53 en diversas líneas de células, incluyendo C6, HCT116, A549, y B16F10 (Fig. 4F). se observó una actividad máxima reportero sensible a p53 en las células tratadas con cada compuesto con la gama de 0,4 a 25 mM. (Fig. 4F). No hay un aumento en la expresión del ARNm de p53 se encontró en respuesta a tratamiento con N-2 (datos no mostrados). En lugar de ello, el tratamiento de células A549 con 1 mM N-2 durante 12 h inducidas fosforilación de p53 en Ser9, Ser20, Ser46 y (Fig. 4G). Sin embargo, N-2 no fue capaz de inducir la fosforilación de Ser-392 que se fosforiló después 9AA o el tratamiento de control de calidad. Para evaluar si la N-2 provoca daños en el ADN, se analizó la fosforilación de γ-H2AX en Ser139. N-2 y Dox aumento de los niveles de fosforilados γ-H2AX (Fig. 4G y. Complementario Fig S2). No encontramos tal actividad por 9AA y control de calidad como se informó anteriormente [32]. Por lo tanto, es probable que la N-2 se estabiliza p53 a través de la fosforilación de ADN mediada por el daño de p53.
(A) Los niveles de las proteínas p53 y p21 endógenos se evaluaron después del tratamiento de A549 y las células B16F10 con 1 M de N-2. (B) Dosis dependencia de N-2 en las proteínas p53 y p21 endógenos. (C) Dosis dependencia de N-2 y de control de calidad en las proteínas p53 y p21 endógenos en células HCT116. (D) La actividad del indicador sensible a p53 en las células HCT116 tratadas durante 12 h con 9AA, QC, doxorubicina (DOX) o N-2 en un intervalo de concentraciones (0,4 a 25,0 mM). (E) cinética de la activación de la actividad de reportero sensible a p53 en las células HCT116 tratadas durante 2-40 h con 3 M de N-2, 3 M de taxol, 1 M de Dox o 10 M de QC. (F) La actividad de reportero p53 en C6, HCT116, A549 o células B16F10 tratados durante 12 h con 9AA, QC, o N-2 en un intervalo de concentraciones (0,4 a 25 mM). Los datos se muestran como la inducción veces en relación del gen informador p53 a la concentración más eficaz de cada compuesto. Los resultados mostrados son la media de tres experimentos; las barras indican la desviación estándar (D-F). (G) La fosforilación de p53 en varios residuos de serina y de la histona fosforilada γ-H2AX en células A549 tratadas durante 12 h con QC (10 mM), 9AA (5 M), Dox (1 M) o N-2 (1 M).
N-2 tiene efectos antitumorales
in vivo
a continuación comparó la actividad anti-proliferativa de 9AA, control de calidad, y N-2 en diferentes tipos de células cancerosas. Se determinó la LD
50 de concentración para cada tipo de células después del tratamiento durante 48 h con 9AA, QC, y N-2 en varios de tipo salvaje y las células mutantes de p53. N-2 mostró una eficacia relativamente mayor que 9AA y QC en todas las líneas celulares ensayadas (Fig. 5A). En particular, N-2 mostró el más potente eficacia en células LLC (LD
50 = 80 nM). Por lo tanto, se seleccionaron células LLC para más
in vivo
pruebas. Además, hemos examinado
in vivo
efecto de la N-2 en las células de melanoma de ratón B16F10 (LD
50 = 600 nm) como el melanoma y el cáncer de pulmón son dos de las mayoría de los tipos de tumores resistentes a los fármacos.
(A) Comparación de la IC
50 de 9AA, control de calidad, y N-2 en diferente tipo salvaje y líneas de células mutantes p53. Cada punto representa la IC
50 de un tipo particular de célula, que se agrupan de la siguiente manera: (
i
) círculos, líneas celulares de p53 de tipo salvaje (A549, H460, HCT116, C6, SH- SY5Y, y B16F19); y (
ii
) triángulos, líneas de células mutantes p53 (H2009, SW480, Jurkat, U937, y LLC). (B) Evolución temporal de los cambios en el peso corporal después del tratamiento con N2. Las barras de error representan la desviación estándar. (C) La actividad anti-tumor de N-2 y de control de calidad en los aloinjertos B16F10. se muestran el volumen tumoral y un melanoma extirpado representante en día 15. (D) La actividad anti-tumor de N-2 en LLC aloinjertos. El volumen del tumor, la apariencia de los aloinjertos y los tumores LLC extirpados en día 14 se muestran. Las barras de error representan la SD (C-D). * Indica que el significado en comparación con el control, p & lt; 0,05,
#p & lt; 0,01 con ANOVA. (E) Efecto de la N-2 crecimiento independiente de anclaje en las células A549. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres ensayos. * P & lt; 0,05,
#p. & Lt; 0,01 mediante la prueba t de Student pareada
Se evaluó si N-2 tuvo efectos antitumorales en B16F10 ratón (melanoma) y los modelos de aloinjertos LLC. Activadores de p53 han demostrado ser prometedores en el tratamiento del melanoma uveal primaria y modelos murinos de aloinjertos de células de melanoma B16F10 ocular [40]. QC y N-2 inhibieron el crecimiento de los aloinjertos de tumores formados por la inyección intraperitoneal de células B16F10 melanoma en ratones C57 /BL6. N-2 (1 mg /kg) mostró efectos antitumorales similares como 30 mg /kg QC sin pérdida de peso significativa (hasta 20% a 3 mg /kg el tratamiento de N-2; Figs 5B y C).. Adicionalmente, N-2 mostró una gran eficacia en un
in vivo
LLC aloinjerto modelo (Fig. 5D). Los resultados del aloinjerto LLC corresponden con el más potente
vitro
LD
50 valor en de N-2 en células LLC. La media de peso y volumen de los tumores primarios en ratones tratados con N-2 fueron significativamente más bajos que los ratones tratados con vehículo.
La inhibición de la señalización NF-kB apoptosis en células de cáncer de pulmón p53 nula y ratón inhibió inducida el desarrollo del pulmón adenocarcinoma [19], [41], [42]. Para evaluar el efecto de la N-2 en el cáncer de pulmón humano, se utilizó ensayos de formación de colonias en agar. NF-kB juega un papel importante en el crecimiento independiente de anclaje, la metástasis, y la formación de tumores en células de carcinoma de pulmón, incluyendo las células A549 [43]. La formación de colonias
in vitro
generalmente se correlaciona con la tumorigenicidad
in vivo
[44]. N-2 de formación de colonias inhibió de una manera dependiente de la dosis y su eficacia es mucho mayor que 9AA y QC en ensayos de formación de colonia de A549 (Fig. 5E).
N-2 induce genes de respuesta al estrés
visualizamos red de interacción molecular mediante el análisis de relación de los genes diana expresados diferencialmente se muestran en microarrays de ensayo. La red global revela varias interacciones interesantes que pueden conectarse a p53 o NF-KB. tratamiento con N-2 disminuyó la expresión de genes relacionados con el ciclo celular, la replicación del ADN, y la reparación, pero el aumento de expresión de apoptosis y los genes relacionados con el estrés celular (Fig. 6A y el cuadro complementario S1 y S2). Estos resultados se verificaron mediante RT-PCR. tratamiento con N-2 indujo claramente los genes relacionados con el estrés, tales como DDIT3, DDIT4, SENS2, y GADD45 concomitante con baja regulación de la PCNA proliferativa marcador, CDK1 (CDC2), y el CCND3 gen diana NF-kappa B (ciclina D3; la figura . 6B).
(A) Interacción mapa de DEGs. general de la red revela muchas interacciones interesantes que se pueden conectar a la p53 o NF-kB. El color nodo representa el cambio veces (verde, regulación a la baja; rojo, la regulación positiva). (B) N-2 hasta regula los niveles de mRNA de los genes de respuesta al estrés (DDIT3, DDIT4, SESN2, y Gadd45a) y regula a la baja el nivel de mRNA de los genes asociados con la proliferación (PCNA y CCND3). El nivel de transcripción de genes seleccionados se confirmó con RT-PCR. * P & lt; 0,01, ** p & lt;. 0.001
Discusión
El p53 y factores de transcripción NF-kB son dos proteínas críticas que están desregulados en diversos cánceres humanos. Un enfoque multi-objetivo puede ser el futuro de la terapia contra el cáncer en el que la resistencia a fármacos es un problema. A la luz de esto, nuevas moléculas que regulan dualmente NF-kB y la señalización de p53 pueden ser particularmente importantes para evaluar el potencial uso terapéutico de los fármacos bivalentes en diversos tipos de cáncer [29].
Nuestra pantalla de 200.000 compuestos identificados N- 2, una molécula bivalente con el potencial para modular tanto NF-kappa B y la señalización de p53. En comparación con los fármacos bi-orientado se informó anteriormente, 9AA y QC, N-2 mostró una eficacia mayor en diversas líneas de células tumorales. La fuerte eficacia de la N-2 se exhibe por el IC
50 valores para la producción mediada por NF-KB de óxido nítrico por 9AA, QC, y N-2 (7,8 M, 33,7 m, y 0,64 M, respectivamente) . N-2 también indujo p53 y sus genes diana a concentraciones más bajas que QC. la activación de p53 También se ha informado de inhibir inducida por LPS activación de NF-kappa B [45]. Curiosamente, el IC
50 de la N-2 por las células de cáncer era independiente del estado genético de p53 en las mismas condiciones (Tabla S3 y la Fig. S4). Curaxins, QC y anteriormente conocido PIP activador p53 (Grupo A) también causan la muerte apoptótica independiente de p53 de las células del cáncer [46], [47]. La inhibición de la señalización de NF-kB por sí solo podría ser eficaz para el tratamiento de los cánceres de pulmón que tienen mutaciones Ras [19], [41], [48]. 9AA y QC también mostraron ninguna diferencia significativa en LD
50 valores entre los de tipo salvaje y las células de cáncer de p53 mutante (Fig. 5A y el cuadro complementario S3), lo que indica que la apoptosis dependiente de p53 no es el único mecanismo de N-2- mediada por la muerte de células tumorales. En particular, el resultado en la Fig. S4 sugiere que ROS probablemente actúa como las moléculas de señal para la muerte celular inducida por la N-2 y este proceso es todavía funcional, incluso en ausencia de p53. Por lo tanto, la inducción de ROS pueden proporcionar un posible mecanismo para la N-2 indujo la muerte celular en las células cancerosas-p53 de tipo salvaje y p53 mutante.
En este estudio, se encontró que los activadores de p53 previamente conocidos PIP , inducida por LPS 9AA-1, y 9AA-2 también inhibe la activación de NF-kappa B (Fig. 2). La propiedad anti-inflamatoria de la seliciclib fármaco bivalente anteriormente identificado (roscovitina) podría explicarse por la inhibición de NF-kappa B [31]. En futuros estudios, será necesario evaluar la eficacia antiinflamatoria de estos compuestos de golpe con mayor detalle
.
El mundial de perfiles de expresión génica resultados mostraron una inducción distintivo de los genes relacionados con el estrés, tales como ATF3, DDIT3 , DDIT4, SENS2, y GADD45 (Fig. 6). Se ha informado de que varios tipos de estrés celular, incluyendo el retículo endoplásmico, genotóxico, y el estrés especies reactivas del oxígeno, pueden estabilizar la proteína p53. inductor eficaz de p53 RITA también estimuló los genes de estrés tales como ATF3, DDIT3, DDIT4 y GADD45 como N-2 [49]. El gen DDIT3 /CHOP es un componente de la respuesta al estrés retículo endoplásmico, DDIT4 /REDD1 y SENS2 son inhibidores de la vía de supervivencia mTOR, y GADD45 es un sensor de tensión crítica de la muerte celular apoptótica por medicamentos de quimioterapia-preventiva. Por otra parte, ATF3, DDIT3, DDIT4, GADD45 y SESN2 son también los genes regulados por p53 [50], [51], [52], [53]. En particular, N-2 indujo la expresión de los inhibidores de mTOR DDIT4 y SESN2 y la fosforilación inhibe de Ser536 de la subunidad p65 de NF-kappa B, que es fosforilada por AKT [54]. El mecanismo de acción N-2 podría implicar la inhibición de la AKT /mTOR y las vías de AKT /NF-kB. mTOR se ha convertido en un nodo de control de crecimiento crítico recibir señales estimuladoras de Ras y fosfatidilinositol-3-OH quinasa [55]. Los resultados de nuestro de perfiles de expresión génica global sugieren que la inducción de daño en el ADN, la producción de ROS y la regulación de genes relacionados con el estrés por N-2 es probable que participan en la estabilización de p53, junto con la inhibición de la AKT /mTOR o AKT /NF -κB vías de supervivencia.
El tratamiento con N-2 fosforilación de p53 inducida en Ser9, Ser20, Ser46 y en las células A549. La fosforilación de estos sitios se relaciona con la inducción de la apoptosis, daño en el ADN, y la estabilidad de p53 [6], [7], [8]. Especialmente, la fosforilación de p53 en Ser20 se produce sobre todo en respuesta al daño del ADN y la inducción de ROS [56]. Se confirmó el daño del ADN por N-2 a través de la inducción de la fosforilación de la histona H2AX γ-. Se determinó el efecto de la N-2 sobre la producción de ROS en células A549 usando 2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA). El tratamiento de N-2 aumentó significativamente los niveles de ROS en células A549, pero 9AA no lo hizo. Control positivo miristato acetato de forbol también causó un aumento de ROS, pero N-2- mejorada ROS fue mucho mayor que otros compuestos (Complementario. Fig S3). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la fuerte eficacia de la N-2 en diversos tipos de células del cáncer se debe a la combinación de muchos factores que se dirigen a dos vías principales en las células tumorales. Las similitudes y diferencias entre QC, 9AA, Dox, RITA, Nurtlin-3, β-feniletil-isotiocianato (PEIC) y N-2 se resumen en la figura complementaria. S5.
En resumen, la novela pequeña molécula N-2 es un agente contra el cáncer bivalente que tiene una eficacia más fuerte que otras moléculas pequeñas identificadas previamente. N-2 tiene el potencial para el tratamiento de diversos cánceres, incluyendo aquellos que son resistentes a las terapias actuales. Este estudio también proporciona información mecanicista sobre el mecanismo molecular de acción de otros inductores de p53 conocidos, tales como PIP, 9AA-1, y 9AA-2 y destaca el posible uso de estos compuestos como agentes anti-inflamatorios.
Materiales Métodos y
cultivo celular, transfections y ensayos de luciferasa
HCT116, C6, B16F10, A549, U937 y carcinoma pulmonar de Lewis se obtuvieron células (LLC) de la American Type Culture Collection y nula HCT116 Las células fueron un generoso regalo del Dr. Bert Vogelstein [57]. células H460, H2009, SW480, Jurkat y SH-SY5Y se obtuvieron del banco línea celular de Corea (Seúl, Corea). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 120 mg /ml de penicilina, y 200 mg /ml de estreptomicina y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Las transfecciones se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para la expresión estable de pNF-B-Luc y pp53-Luc vectores (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.), el mismo método que se utilizó la transfección transitoria excepto las células fueron co-transfectadas con pcDNA3.1 (+) a una molar relación de 10:01. colonias estables se seleccionaron con 1000 ng /ml de G418 (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) y las colonias individuales fueron transferidas a una placa de 24 pocillos. Para examinar NF-kappa B mediada o actividades transcripcionales de p53 mediada, células transfectadas de forma transitoria y los clones positivos fueron evaluados usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa de Promega según las instrucciones del fabricante (Promega, West Virginia, EE.UU.). Los clones positivos se mantuvieron en presencia de 500 ng /ml de G418. señales de luciferasa se detectó usando un luminómetro (Victor 5, Perkin Elmer Wallac, Waltham, MA, EE.UU.).
basado en células cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar pequeñas moléculas que activan simultáneamente p53 e inhibir NF kappa B
para la detección de pequeñas moléculas que modulan simultáneamente el p53 y vías de NF-kB, que generó un reportero línea celular C6 (derivado de glioma de rata llevar a p53 de tipo salvaje) transfectadas de forma estable con el que responde a p53 y NF-kB -responsive genes informadores de luciferasa. La biblioteca de compuestos consistió en 200.000 productos químicos proporcionados por el ChemBridge (San Diego, CA, EE.UU.), ChemDiv (San Diego, CA, EE.UU.), y las bibliotecas químicas Asinex (Moscú, Rusia). A la pantalla estos productos químicos, 1 × 10
4 células reportero NF-kB se sembraron en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 384 pocillos de plástico en 40 l de medios DMEM que contenía 10% de FBS. Después de la incubación durante la noche, 0,1 l de los compuestos en DMSO y 10 lipopolisacáridos (LPS; l en DMEM) se añadieron a cada pocillo para una concentración final de 10 mM y compuesto de 100 ng /ml LPS. Igual cantidad de DMSO y parthenolide se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente.