Extracto
restos de cáncer de páncreas (CP) la cuarta causa principal de muerte por cáncer con una supervivencia inaceptable que ha permanecido relativamente sin cambios durante los últimos 25 años. La presencia de metástasis ocultas o clínicas en el momento del diagnóstico, junto con la falta de quimioterapias eficaces suponen una gran necesidad de diseñar nuevas y específicas entregables terapéuticos que favorecen el resultado clínico. En este documento, se investigó el potencial anti-tumorigénico de polifenoles de cinco brown-algas diferente en células PC humanos (MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 y Panc-3.27). La capacidad total antioxidante (TAC) en el análisis de polifenoles separaciones por etapas con polaridad creciente (hexano-DCM-EA-metanol) altos niveles identificados de TAC en DCM y EA a través de todas las extracciones algas evaluados. Todo DCM y EA separados polifenoles indujo inhibición y sostenido dependiente de la dosis (independiente del tiempo) de la proliferación celular y la viabilidad. Además, estos polifenoles profundamente mejoran el daño del ADN (naranja de acridina /bromuro de etidio tinción y la fragmentación del ADN) en todas las líneas celulares investigadas. Más importante aún, el ensayo de indicador de luciferasa reveló una inhibición significativa de la transcripción NFkB en las células tratadas con polifenoles. Curiosamente, QPCR análisis identificó un diferencial sin embargo la regulación definitiva de EGFR pro-tumorigénicos, VEGFA, AKT, hTERT, Kras, Bcl2, FGFα y PDGFα la transcripción en células tratadas con DCM y EA polifenoles. Inmunotransferencia valida el potencial inhibidor de los polifenoles de algas en la fosforilación de EGFR, KRAS, AurKβ y STAT3. En conjunto, estos datos sugieren que las fracciones base de polaridad intermedia de polifenoles de algas marinas pueden potenciar significativamente la muerte celular del tumor y pueden servir como potencial entregable fármaco para la curación PC. Más Estudios de la disección de los componentes activos en las fracciones potentes, mecanismos de acción y la sinergia, en su caso, están garantizados y se encuentran actualmente en proceso de
Visto:. Aravindan S, CR Delma, Thirugnanasambandan SS, Herman TS, N Aravindan (2013) anti-cáncer pancreático entregables del mar de primera mano de pruebas sobre la eficacia, Objetivos moleculares y modo de acción de múltiples polifenoles de cinco diferentes Brown-algas. PLoS ONE 8 (4): e61977. doi: 10.1371 /journal.pone.0061977
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de diciembre de 2012; Aceptado: March 15, 2013; Publicado: 16 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Aravindan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores son apoyados por los fondos de desarrollo de investigación del Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Oklahoma Centro de Ciencias de la Salud a N. Aravindan y, Gobierno de la India, Departamento de Ciencia y Tecnología (DBT Sanción Nº de pedido & amp; Fecha: BT /PR11535 /AAQ /03/431/2008; 17.09.2009) subvención (Evaluación de polifenoles y polisacáridos de feofitas contra el estrés oxidativo y la progresión del cáncer para el Desarrollo de Drogas) a T. Somasundaram. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenga en cuenta que el co-autor Natarajan Aravindan es un miembro del Consejo Editorial PLOS. Esto no altera la adhesión de los autores a todas y cada una de las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
cáncer de páncreas (CP) sigue siendo la cuarta causa principal de muerte por cáncer en Estados Unidos, con una previsión de 43.920 nuevos casos en 2012 [1]. Por desgracia, las tasas de mortalidad de PC se mantuvo relativamente sin cambios desde 1975, con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 5,4% [2]. La presencia de metástasis ocultas o clínicas en el momento de diagnóstico junto con la falta de quimioterapias eficaces contribuye a la alta mortalidad en pacientes con PC. A tal fin, el tratamiento de PC, altamente basan en la mejora de la comprensión de la genética y la biología [3], que pueden estar estrechamente asociada con la tumorigénesis y la formación de metástasis. Además, PC es uno de los tumores más intrínsecamente resistentes a los medicamentos y, resistencia a los agentes quimioterapéuticos es una causa importante de fracaso del tratamiento en PC. A pesar de una amplia investigación sobre muchas terapias dirigidas con excelentes efectos antitumorales en modelos preclínicos, la investigación clínica demostró que las terapias dirigidas individuales y terapias más combinadas no fueron capaces de mejorar el pronóstico de esta enfermedad. Vale la pena mencionar que hay 1344 ensayos clínicos en curso (trials.gov www.clinical accedido el 30 de noviembre de 2012) En la actualidad, muchas dirigidas a dianas moleculares potenciales con una serie de prometedores de canalizaciones de drogas-entregables. A pesar de un intento tan colosal para mitigar la progresión de la PC y la difusión, en tiempo real, nos encontramos en ninguna parte cerca de las tasas de supervivencia aceptables. En parte, esto se atribuye al hecho de que PC puede poseer características y objetivos diferentes en diferentes etapas de la patogénesis, el mantenimiento y la metástasis [4]. Además, la diafonía entre las vías de señalización celular, un fenómeno importante en PC, puede resultar en la supervivencia de células de cáncer y metástasis, a pesar de que algunas vías están bloqueadas por terapia dirigida. Sensibilidad a la terapia también puede variar si hay células cancerosas en diferentes etapas. La estructura única PC con abundante estroma crea un microambiente tumoral con la hipoxia y la tasa de perfusión arterial baja, lo que impide la administración de fármacos a las células cancerosas. Por lo tanto hay una necesidad calamitoso para el diseño de estrategias terapéuticas nuevas y específicas que pueden mejorar el resultado clínico de los pacientes con diagnóstico de PC. En consecuencia, en este documento se investigó el potencial anti-PC de polifenoles de una fuente inusual, algas pardas marinas.
Macro algas (algas marinas) son importantes fuentes de proteínas, yodo, vitaminas y minerales y por lo tanto han demostrado poseer los potenciales de prevención de quimioterapia [5]. Otros estudios han demostrado consistentemente que las algas marinas poseen un alto contenido de polifenoles tales como catequina, epicatequina, galato de epigalocatequina y ácido gálico (véase la revisión [6]). Estos compuestos polifenólicos han demostrado muchas bioactividades de salud beneficiando tales como anti-oxidantes, anti-cáncer, anti-viral, anti-inflamatorio, y una capacidad para inhibir la agregación plaquetaria humana 6,7. Además, los estudios han demostrado una correlación positiva entre el aumento de la ingesta dietética de antioxidantes naturales y la enfermedad coronaria del corazón reducida, la mortalidad por cáncer, así como la esperanza de vida más larga [6], [8]. Una estrecha asociación entre la actividad anti-cancerígena y la actividad antioxidante se ha reportado en modelos de ratón de carcinoma con polifenoles [9] - [12]. Para ese sentido, investigaciones recientes demostraron precisamente los anti-proliferativa, pro-apoptóticos, dañar el ADN, anti-angiogénico, la inhibición del crecimiento, detención del ciclo celular y anti-metastáticos funciones de extractos de algas marinas en una serie de modelos de tumores incluyendo melanoma, nasofaríngeo, carcinoma gástrico, cáncer de mama etc. [13] - [18]. Sin embargo, estos estudios se limitan a polisacáridos y /o extractos crudos, y el beneficio de los polifenoles de algas o de sus componentes activos contra la carcinogénesis pancreática y /o su progresión (si no para cualquier tumor) nunca ha sido investigado. Por otra parte, una visión en profundidad sobre el efecto de los polifenoles de algas en este contexto, su potencial en la regulación de la señalización de las células tumorales, modo de acción (dianas moleculares potenciales aún definidas, en su caso), aún no se ha reconnoitered. Debido al hecho de que los polifenoles se dirigen a las principales vías de señalización celular, se investigó el efecto de los polifenoles a partir de algas pardas de cinco diferente en configuración de PC. Este estudio proporciona evidencia de primera mano sobre las potenciales propiedades antioxidantes, anti-proliferativos celulares y matar de extracciones basadas polaridad de estas algas. Además, este estudio también identifica el potencial de los polifenoles extraídos de las principales dianas moleculares progresión tumoral incluyendo NFkB, EGFR, KRAS, STAT3, VEGF, AKT, de TERT, FGFA, Bcl2 y PDGFA.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
humano Panc-1 (ATCC-CRL1469), Panc-3.27 (ATCC-CRL2549), BxPC-3 (ATCC-CRL1687), y MIA Paca-2 (ATCC-1420) se obtuvieron células del Dr. Daniel J. Brackett (Departamento de cirugía, Universidad de Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK). Cultura y mantenimiento de Panc-1, BxPC-3, y las células MIA PaCa-2 se realizaron como se describe anteriormente [19]. células Panc-3.27 se mantuvieron como cultivos monocapa de paso en serie semanalmente en placas de cultivo de tejidos de 100 mm en alta glucosa del medio RPMI-1640 con 2 mM L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 1,500 mg /bicarbonato de sodio L, 10 unidades /ml de insulina humana recombinante y de suero bovino fetal 15%. Se obtuvieron MCF10A (ATCC-CRL10317), células de músculo liso aórtico humano (ATCC, HASMC-PCS-100-012) y células endoteliales de arteria ilíaca Humano (HIAE, ATCC) las células del Dr. Mohan Natarajan (Universidad de Ciencias de la Salud Centro de Texas en San Antonio, TX). Las células se mantuvieron como cultivos monocapa en un medio 199 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1,500 mg /bicarbonato de sodio L, vitaminas MEM, no aminoácidos esenciales, penicilina /estreptomicina y 10% HIFBS. Para MCF10A el medio se suplementó adicionalmente con Suplemento de crecimiento epitelial mamaria (Life Technologies) y la toxina del cólera (Sigma). Para el paso y para todos los experimentos, las células se separaron usando tripsina (0,25%) /EDTA (1%), se resuspendió en medio completo, se contaron electrónicamente utilizando condesa contador de células automatizado (Carlsbad, CA), y se incubó en un 95% de aire /5% de CO2 incubadora humidificada.
extracción de polifenoles y tratamientos de células
Las células en placas de cultivo de tejidos de 100 mm que contienen 6 ml de medio de cultivo completo se dejaron crecer hasta el 70% y el 80 % de confluencia. Cinco especies de algas pardas,
Dictyota dichotoma gratis (DD),
Hormophysa triquerta gratis (HT),
Spatoglossum asperum gratis (SA),
Stoechospermum marginado
(SM) y
Padina tetrastromatica gratis (PT) se obtuvieron de la costa Mandapam, Golfo de Mannar, costa sur este de la India. Las algas marinas son recogidos como parte del Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India patrocinó el proyecto de DBT, y desde esta colección no se trata de cualquier especie en peligro de extinción o protegidas, no se requerían permisos específicos (Departamento de Bosques, Gobierno de la India exento). Recién algas recogidas se lavaron, secaron al horno y se utilizó su polvo para la extracción secuencial de los polifenoles en gradiente (en aumento) disolventes de polaridad incluyendo hexano (H), diclorometano (DCM), acetato de etilo (EA) y metanol (M). En breve, se shaked 50 g de algas en polvo empapado en tres volúmenes de disolvente específico durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se filtró a través de papel de filtro Whatman seguido de incubación del residuo en el disolvente subsiguiente. Dando como resultado cuatro filtrados se secaron por completo en tubos de centrífuga micro pesadas previamente utilizando SpeedVac (Thermo Scientific, Asheville, Carolina del Norte). Los filtrados secos se pesan y se disuelven en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración madre final de 100 mg /ml. Para el tratamiento de células, polifenol '' Stock '' soluciones se diluyeron adicionalmente en cultivo celular normal (DMEM) medio a una concentración '' trabajo '' de 10 mg /ml. Las células se trataron con diferentes concentraciones (10, 50, 100 mg /ml) de polifenoles y se dejó incubar a 37 ° C durante 3 h y 24 h a menos que se indique lo contrario o en el texto. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo celular era & lt;. 0,0001%
Total análisis de la capacidad antioxidante
Para determinar el potencial antioxidante de la fracción 20 de polifenol que comprende de 4 fracciones característicos de cada uno de algas se llevó a cabo un total de 5 algas, análisis de la capacidad antioxidante total (TCA) como se describe por Prieto y colegas [20]. En resumen, dos partes de cada extracción a diversas concentraciones (100, 250, 500 mg /ml y 1 mg /ml) se mezcló con una parte de reactivo TCA (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sodio 28 mM y molibdato de amonio 4 mM) y se incubaron a 95 ° C durante 90 min. Se midió la absorbancia a 635 nm utilizando Sinergia II lector de micro placa (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT). El ácido gálico (GA) se utilizó como control positivo y también se incluyeron controles negativos con disolventes de fricción. Las fracciones que exhiben altos niveles de capacidad total antioxidante serán utilizados para su posterior análisis (anti-PC).
Viabilidad de las células
Se usó un ensayo de exclusión de azul
tripán para determinar la eficacia de los polifenoles de algas en la regulación de la viabilidad celular PC. Mia-PaCa-2, Panc-1, Panc-3.27 y células BxPC-3 tratados con diferentes concentraciones (10, 20, 50 o 100 mg /ml) de fracciones de diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o fracciones de acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, EA-PT, HT-EA) se examinaron después de 24 h de alteraciones en la viabilidad celular. La evaluación cuantitativa se realizó utilizando el contador de células automatizado condesa como se describe anteriormente [19] y en comparación con los controles no tratados utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc Bonferonii (v4.03 GraphPad Prism, GraphPad Prism Software Inc., La Jolla, CA) . Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
La supervivencia celular
La supervivencia celular se analizó utilizando CyQUANT Ensayo de proliferación celular kit (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregón, EE.UU.) en Panc-. 1 y MIA Paca-2 células tratadas con diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA , HT-EA fracciones) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, las células (5.000 células /pocillo) se siembran en placa de 96 pocillos con 200 l /pocillo medio de cultivo se incubó a 37 ° C durante un período de 24 h. Para las células de estudios de escalado de dosis fueron expuestas a concentraciones crecientes (10, 20, 50 y 100 mg /ml) de polifenoles de algas y se analizaron después de 3 h. Para los estudios de recuperación en función del tiempo, las células fueron tratadas con 100 g /ml de fracciones de polifenol y se examinaron después de 3, 24, 48 o 72 h. Después del tratamiento, el medio de crecimiento fue cuidadosamente y completamente eliminado y las placas se mantuvieron en congelación (-70 ° C) durante 24 h adicionales. Las células congeladas fueron lisadas con tampón CyQUANT® GR tinte /célula-lisis (200 l /pocillo) a temperatura ambiente, protegido de la luz durante 5 minutos y la fluorescencia (480 nm de excitación y 520 nm de emisión) usando Sinergia II lector de micro placa ( BioTek). Todas las muestras se ensayaron por triplicado. Se incluyeron controles negativos sin células. Grupo comparaciones en cuanto se hicieron usando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc Bonferonii (GraphPad PRISM) y un valor de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Además, para determinar si este polifenol (s) impulsada contra la proliferación de células tumorales es selectiva y, para delinear su citotoxicidad celular normal, en su caso, se examinaron sus efectos sobre las células primarias. Para esto, las células MCF10A, HIAE y HASMC tratadas con 100 g /ml de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT- EA o HT-EA se examinaron después de 24 h de alteraciones en la proliferación celular.
La morfología nuclear mediante tinción de doble
Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 y Mia-Paca-2 células (5 × 10
5 células) se cultivan en placa de 4 pocillos (Nunc) se trató con 100 g /ml de diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) se analizaron las fracciones después de 24 h para la morfología nuclear como se describió anteriormente [21].
fragmentación del ADN en geles de agarosa
ensayo de ADN de escalonamiento se utiliza para identificar la eficacia de los polifenoles de algas marinas en la inducción de células PC fragmentación del ADN. En resumen, el ADN de Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 y las células tratadas con DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA 2 Mia-PACA -EA, SM-EA, EA y PT-HT-EA durante 24 h se extrajo con ADN stat-60 (Tel-test Inc., Friendswood, TX, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN (5 g) se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 2% que contiene bromuro de etidio, se visualizaron utilizando ChemiDoc ™ XRS imager (Biorad, Hercules, CA) y se cuantificó usando Cantidad-One software de análisis de imagen (Biorad). Grupo comparaciones en cuanto se hicieron mediante análisis de la varianza con la corrección post-hoc de Tukey. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Preparación de plásmido, transfección de ADN, y luciferasa reportero de ensayo
Las alteraciones en la activación del promotor NFkB en diclorometano (DCM-DD, SA-DCM, SM. -DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, EA-PT, HT-EA) fracciones tratadas Panc-1, BxPC-3 y MiaPaCa-2 células fueron investigado usando el ensayo indicador de luciferasa. El plásmido constructo pNFκB-Luc se amplificó y se purificó como se describe en nuestros estudios anteriores [22], [23]. Los lisados celulares a partir de células tratadas durante 24 h Se analizó la actividad luciferasa según el protocolo del fabricante (Biovision Research Products, Mountain View, CA) y el grupo sabia comparaciones se hicieron usando ANOVA con corrección post-hoc de Tukey. un valor de p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
QPCR
alteraciones de la transcripción de las moléculas clave de progresión del tumor, incluyendo,
Bcl2, EGFR, PDGFA, VEGF, AKT, ter, y KRAS FGF
en diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA ) fracciones tratadas (por 3 h) Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 y MiaPaCa-2 células fueron analizados por QPCR en tiempo real como se describió anteriormente [23]. Se utilizó β
-actina
como un control positivo y un control negativo sin ARN plantilla también se incluyó. Cada experimento se realizó por triplicado, y el
ΔΔ
C
t valores se calcularon mediante la normalización de los niveles de expresión génica para ß
-actina
, y el nivel de expresión relativa se expresa como un factor de cambio.
inmunotransferencia
Panc-1, BxPC-3 y 2 células MiaPaCa expuestos a diclorometano (DCM-DD, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT -DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) se analizaron las fracciones después de 24 h para las alteraciones en la fosforilación de EGFR y los niveles de proteína de Kras, STAT3, EGFR y AURKβ. La extracción total de proteínas e inmunotransferencia se realizaron como se describe en nuestros estudios anteriores [23], [24]. Para este estudio, las membranas de proteínas transferidas se incubaron ya sea con anticuerpos monoclonales anti-conejo pEGFR
(Tyr1068) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE.UU.), Kras (Proteintech Group, Inc. Chicago, IL, EE.UU.), STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU.) o el ratón monoclonal EGFR (Santa Cruz), anticuerpo AURKβ (Proteintech). Los blots fueron despojados y reblotted con anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-tubulina (Santa Cruz) para determinar la igualdad de carga de las muestras. Densitometría análisis se realizó utilizando Cantidad-One (BioRad) y la intensidad de la banda relativa se representó en un histograma usando PRISM 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). sabia comparaciones de grupos se realizaron mediante análisis de la varianza con la corrección post-hoc de Tukey.
Resultados
polifenoles de algas marinas albergan altos niveles de antioxidantes
Para determinar el potencial antioxidante de los polifenoles de algas , hemos examinado la capacidad antioxidante total de fracciones extraídas incluyendo hexano, diclorometano-, etilo-etilo y las fracciones de metano de los cinco algas investigadas. El ácido gálico se utiliza como control positivo y una fracción de polisacárido de algas marinas correspondiente también se examinó para proporcionar un aumento relativo de antioxidantes en polifenoles. TCA reveló niveles significativos de antioxidantes en todas las fracciones de algas de polifenol (Fig. 1). aumento dependiente de la dosis en los niveles de antioxidantes de todas las fracciones investigó valida precisamente disponibilidad antioxidante y la concentración. Relativamente, se observó muy altos niveles de antioxidantes en diclorometano y acetato de etilo fracciones de todas las algas investigados (Fig. 1). Inimitablemente, polifenoles extraídos de
Stoechospermum marginado
mostraron a albergar un máximo de antioxidantes, ~3.5 veces mayor en las fracciones de DCM y EA (Fig. 1). Debido al hecho de que, las fracciones de DCM y EA contiene altas antioxidantes a través de las algas marrones examinado, se utilizó selectivamente estas dos fracciones de cada mala hierba del mar para delinear el potencial anti-PC
.
Los polifenoles se extrajeron de cinco especies de algas pardas,
Dictyota dichotoma gratis (DD),
Hormophysa triquerta gratis (HT),
Spatoglossum asperum gratis (SA),
Stoechospermum marginado gratis ( SM) y
Padina tetrastromatica
(PT) usando disolventes de polaridad de gradiente incluyendo hexano (H), diclorometano (DCM), acetato de etilo (EA) y metanol (M). análisis de la capacidad antioxidante total se realizó con ácido gálico (GA) como control positivo, disolventes claro como controles negativos y fracción de polisacáridos de algas correspondiente como medida relativa.
ricos en antioxidantes polifenólicos fracciones retrasa la viabilidad celular PC
Mia-Paca-2, Panc 3.27, las células Panc 1 y BxPC3 tratados con diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA , se examinaron SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fracciones (10, 20, 50 o 100 mg /ml) para las alteraciones en la viabilidad celular usando el ensayo de exclusión con azul de tripano. Todas las fracciones de polifenoles de DCM y EA mostraron una disminución significativa (P & lt; 0,001) la inhibición de la viabilidad celular tan bajo como concentración 10 mg /ml (Fig 2A.). Con el aumento de las concentraciones de las fracciones de polifenoles, se observó una inhibición dependiente de dosis de la viabilidad celular en MiaPaCa-2 células expuestas a DCM o fracciones de EA (Fig. 2A). Consistentemente, 100 g /ml de toda la fracción (s) DCM y EA viabilidad celular significativamente introvertido (& gt; 60%) en células BxPC3 (Figura 2B.). Sin embargo, HT-EA mostró relativamente menor potencial inhibitorio en esta línea celular. Al igual que a gota, se observó una eficacia inhibidora consistente (~ 50%) de todas las fracciones de DCM en Panc 3.27 células (Fig. 2C). Por otra parte, las fracciones de EA mostraron una pendiente en la eficacia de de baja actividad con DD-EA a una máxima actividad con HT-EA en Panc 3.27 células (Fig. 2C). En Panc 1 células, tanto DCM y fracciones EA marcadamente inhibida la viabilidad celular (Fig. 2D). Relativamente, se observó una inhibición máxima de la viabilidad celular con SM-DCM y DD-EA (& gt; 50%) de fracciones. Estos resultados demuestran que los polifenoles de algas potencialmente inhiben la viabilidad celular PC y además identificar el '
-tipo de células
independiente "(50%) dosis mínima eficaz inhibidora en este entorno.
dosis de la regulación asociada la viabilidad celular por cada fracciones de polifenoles se compararon con los controles no tratados utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc Bonferonii y un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. gráficos de líneas que muestran una inhibición significativa de la viabilidad celular en (B) BxPC-3, (C) Panc-3.27 y (D) células Panc-1 tratados con DCM /o fracciones de EA ml 100 mg.
polifenoles de algas inhibe la proliferación de células PC
Además de fundamentar la capacidad inhibitoria sobre la viabilidad celular de los polifenoles antioxidantes ricos en efecto se traduce en la consecuente regulación de la supervivencia celular, se analizó el potencial anti-proliferativa de las fracciones de DCM y EA. Para lograr esto, se midió el contenido de ADN total (que estrechamente proporcional al número de células) y el grado de proliferación se determinó mediante la comparación de los recuentos de células de drogas tratados MiaPaCa-2 y células Panc-1 con los controles no tratados. En comparación con los controles no tratados, CyQuant-NF análisis reveló una dosis significativa (10, 20, 50 y 100 mg /ml) la inhibición dependiente de la proliferación celular tanto en MiaPaCa-2 y células Panc-1 con cada diclorometano (DD-DCM, fracciones SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) o acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) (Fig.3). Sin embargo, estas fracciones ricas en antioxidantes exhibieron un "tipo celular dependiente 'y /o' disolvente dependiente 'magnitud de la inhibición de la proliferación celular. Evidentemente, todas las cinco fracciones de DCM (100 g /ml) profundamente (~ 50%) inhibió la proliferación de células MiaPaCa-2 con la inhibición máxima (~ 75%) observada después del tratamiento HT-DCM (Fig. 3A). Al igual que a gota, en células Panc-1, DD-DCM, PT-DCM y tratamiento HT-DCM robusta (~ 50%) inhibió la proliferación celular con la máxima inhibición de PT-DCM células (Fig. 3B) tratados. Más importante aún, todas las fracciones de EA también mostraron DCM comparable proliferación celular potencial de inhibición (~ 50%) en MiaPaCa-2 células (Fig. 3C). Evidentemente, el tratamiento PT-EA muestra la inhibición máxima en estas células. Aunque, DD-EA, PT-EA y HT-EA mostraron potencial inhibidor en células Panc-1, relativamente (en lugar de DCM), fracciones de EA producen efecto marginal (Fig. 3D). En segundo lugar, se examinó si el polifenol algas inhibe la supervivencia celular es transitorio (con recuperación dependiente del tiempo) o un efecto causa permanente. MiaPaCa-2 células tratadas con 100 g /ml de fracciones de DCM y EA se sometieron a análisis CyQuant después de 3, 24, 48 y 72 h. En comparación con los controles no tratados, los polifenoles de algas ejerce una significativa (P & lt; 0,001) anti-proliferación tan bajo como 3 h (Fig. 3E). Más importante aún, esta DCM y fracciones EA inducida por la inhibición de la proliferación celular se mantuvo constante después de 24, 48 y 72 h (Fig. 3E). Estos resultados demuestran el potencial antiproliferativo de polifenoles de algas en las células PC-y más pequeña lista las fracciones potenciales en esta configuración.
Las células expuestas a los polifenoles de algas se evaluó la proliferación celular 3 h post-tratamiento. Dosis de inhibición de la proliferación celular asociado para cada fracciones de polifenoles se compararon con los controles no tratados utilizando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc Bonferonii y un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. (E) parcelas de línea de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA y HT-EA expuesto células MiaPaCa-2 muestra (3, 24, 48 y 72 h) inhibición significativa y sostenida de la proliferación celular. (F) parcelas de línea de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA y HT-EA expuesto MCF10A humano normal, células HASMC y HIAE que muestran la supervivencia celular coherente 24 h después del tratamiento. En comparación con los controles no tratados, todas las fracciones de DCM y EA no revelaron una inhibición significativa de la proliferación celular las tres líneas celulares investigadas. Tiempo de línea en las alineaciones de las parcelas muestra las mediciones de la fluorescencia (480 nm de excitación y 520 nm de emisión) de forma continua hasta 60 minutos.
Además de determinar el potencial selectiva del tumor de polifenoles de algas y para delinear la normalidad citotoxicidad celular, en su caso, que examinó los efectos de estas fracciones sobre la supervivencia de las células sanas. Por esta MCF10A, las células HIAE y HASMC tratadas con 100 g /ml de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA o HT-EA fueron examinados después de 24 h para las alteraciones en la proliferación celular. La fluorescencia (480 nm de excitación y 520 nm de emisión) se midió continuamente hasta 60 minutos. En comparación con los controles sin tratar, el análisis CyQuant NF no reveló ninguna inhibición significativa de la supervivencia celular en las células MCF10A. Como a gota, se observó una supervivencia celular coherente tanto en las células HASMC y HIAE tratados con DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA o HT-EA implica ninguna citotoxicidad definitiva de estas fracciones en las células normales.
polifenoles de algas marinas ejerce muerte celular apoptótica en células PC
Para delinear si el potencial anti-PC de polifenoles de algas implican la muerte celular por apoptosis y para identificar la magnitud potencial de las diferentes fracciones caracterizadas, se analizaron las alteraciones asociadas en la fragmentación del ADN. Dado que la evaluación de la apoptosis no se puede confiar en un solo punto final, hemos utilizado tanto cualitativa naranja de acridina /bromuro de etidio tinción y la fragmentación del ADN en gel de agarosa semicuantitativo y Panc-1, Panc 3.27, BxPC3 y MiaPaCa-2 células. En comparación con los controles no tratados, microscopía de fluorescencia reveló que todas las fracciones ricas en polifenoles antioxidantes incluyendo DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT -EA y HT-EA exhibe características apoptóticas (Fig. 4). Evidentemente, se observó magnitudes diferenciales de fragmentación del ADN a través de cuatro líneas celulares PC tratados con estos polifenoles. Consistentemente, en comparación con los controles no tratados, agaorse análisis de la fragmentación de gel de ADN mostró estadísticamente significativa (P & lt; 0,05) la inducción de la fragmentación del ADN en Panc 1, Panc 3,27, BxPC-3 y las células 2 MiaPaCa tratados con polifenoles de algas marinas, a excepción de DD- DCM (Fig. 5). Comparativamente, se observó una (& gt; 2 veces) máxima DNA efecto de todos los polifenoles de algas perjudiciales en Panc-1 y células Panc-3.27. Grado de fragmentación del ADN causado por estos polifenoles demuestra que las algas emplean mata células apoptóticas en el PC
Insertar:. Microfotografías que muestran una gran ampliación de la cromatina con formación de ampollas, la condensación nuclear y la fragmentación que indica las características típicas de apoptosis en las células tratadas con algas polifenoles.
Las muestras de ADN se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio y se cuantificaron utilizando Cantidad Uno.
polifenoles de algas marinas inhibe la activación funcional de NFkB
Además de investigar que los polifenoles de algas marinas inducidas muerte celular por apoptosis consiste en la inhibición de la pro-supervivencia NFkB, hemos examinado la regulación de NFkB promotor de activación con estas fracciones de DCM y EA en las células PC. Para esto, Panc-1, BxPC-3 y MiaPaCa-2 células humanas se transfectaron transitoriamente con un plásmido constructo pNFκB-Luc que expresa el gen indicador de luciferasa de una manera dependiente de NFkB. La unión de NFkB al promotor activa la transcripción, permitiendo que el gen informador Luc a ser expresado. Las células transfectadas se expusieron a DCM y fracciones de EA (individualmente), y el ensayo de informador de luciferasa se realizó después de 24 h. Las células tratadas con DCM algas polifenol y fracciones EA resultaron en profunda inhibición de la actividad de la luciferasa, lo que indica que estas fracciones podrían aliviar específicamente la activación transcripcional de NFkB (Fig. 6). Aunque se encontraron diferencias marginales entre fracciones y entre líneas celulares, en general, los datos de retratos claramente una notable reducción de la actividad de la luciferasa mucho menor que los niveles basales que demuestran su potencial en la atenuación de la transcripción NFkB.
Las células fueron cosechadas en 24 h post-tratamiento. Los datos mostrados representan la media y desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. disminución significativa en la actividad de la luciferasa en polifenoles de algas tratado células PC.
polifenoles de algas marinas regulan las moléculas de progresión del tumor en células PC
Además, para diseccionar el beneficio de antioxidantes polifenoles de algas rico