Extracto
Los estudios recientes han conferido que el
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y
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genes, que codifican para las proteínas esenciales que participan en la recombinación homóloga, son cáncer de ovario (CO) genes de susceptibilidad que pueden explicar los riesgos genéticos en pacientes de alto riesgo. Se realizó un análisis de la mutación en 171 de alto riesgo
BRCA1
y
BRCA2
pacientes OC negativos, para evaluar la frecuencia de los hereditaria
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y
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variantes en la población checa. El análisis incluyó la secuenciación directa, fusión de alta resolución y análisis de la sonda ligadura-dependiente múltiple. Se identificaron dos (1,2%) y tres (1,8%) inactivar las mutaciones germinales en ambos genes respectivos, dos de los cuales (c.379_380insG, p.P127Rfs * 28 en
RAD51C
y c.879delG, p.C294Vfs * 16 en
RAD51D
) fueron novela. Curiosamente, una historia familiar de cáncer indicativa no estaba presente en cuatro compañías. Por otra parte, las edades en los diagnósticos organoclorados en los portadores de mutaciones identificadas fueron sustancialmente inferiores a los reportados en estudios previos (cuatro portadores eran menores de 45 años). Además, también describimos missense variantes raras, dos en
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y uno en
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cuyo significado clínico tiene que ser verificada. Truncamiento de mutaciones y variantes de sentido erróneo raros comprobados en pacientes OC no se detectaron en 1226 muestras de control. Aunque la frecuencia acumulada de
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y
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truncar mutaciones en nuestros pacientes fue inferior a la de los
BRCA1
y
BRCA2
genes, puede OC explicar la susceptibilidad en aproximadamente el 3% de los pacientes de alto riesgo de OC. Por lo tanto, un
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y
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análisis debería ser implementado en la prueba completa de genes múltiples para los pacientes OC alto riesgo, incluidos los pacientes OC de inicio temprano sin una historia familiar de cáncer.
Visto: Janatova M, Soukupova J, J Stribrna, Kleiblova P, M Vocka, Boudova P, et al. (2015) Análisis de la mutación de la
RAD51C
y
RAD51D
Los genes en de alto riesgo del cáncer ovárico Pacientes y Familias de la República Checa. PLoS ONE 10 (6): e0127711. doi: 10.1371 /journal.pone.0127711
Editor Académico: Klaus Brusgaard, Hospital Universitario de Odense, Dinamarca
Recibido: 23 Enero, 2015; Aceptado: April 17, 2015; Publicado: 9 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Janatova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Agencia de subvención interna, Ministerio de Salud, República Checa, NT13343, (http://www.mzcr.cz/Cizinci/) ; PP, Universidad Carolina de Praga, PRVOUK-P27 /LF1 /1, (http://www.cuni.cz/UKEN-1.html); MJ, Universidad Carolina de Praga, la VVS-Reino Unido 3362-2014, (http://www.cuni.cz/UKEN-1.html); PB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (CO) es la neoplasia ginecológica más letal, aunque representa sólo el 3% de los cánceres femeninos en todo el mundo. Su pronóstico desfavorable en relación con un alto porcentaje de diagnóstico de la última etapa ocupa el OC al cuarto lugar entre la causa relacionada con el cáncer más común de muerte en la población femenina [1]. Su incidencia en la República Checa es de 23 /100.000 individuos y las cantidades de mortalidad a 15 /100.000 personas [2].
El factor de riesgo más importante es la historia de una familia de OC. Se ha supuesto que tiene en cuenta la predisposición hereditaria para al menos 10% de los casos de OC [3]. Por lo tanto, la identificación de la mujer que llevan las mutaciones patógenas en los genes de susceptibilidad a OC es una tarea importante que permite a la prevención OC adaptado en población de alto riesgo. La mayoría de OC hereditaria (HOC) de los casos también se asocian con un mayor riesgo de cáncer de mama (CM) y las mutaciones patógenas más frecuentes en la mama y /o ovario hereditario (HBOC) familias con cáncer afectan a la
gen BRCA1
y en menor medida también
BRCA2
[4]. Ambos genes juegan un papel importante en la reparación del ADN de doble filamento se rompe (DDSB). Recientemente, los genes adicionales fueron descritos como asociados con HOC, entre ellos el
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parálogos
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y
RAD51D
.
Ambos genes codifican para proteínas implicadas en el mantenimiento de la estabilidad del genoma y participan en la recombinación homóloga mediada por DDSB reparación [5,6]. Los primeros estudios informaron de la
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gen (MIM: 602774) como otro anemia de Fanconi (FA) gen designado como
FANCO
porque sus mutaciones en la línea germinal bialélicos se encontraron en un paciente con FA-fenotipo como corresponde al grupo de complementación O [7]. El trabajo pionero de Meindl et al. mostró que
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es un gen de susceptibilidad OC con una frecuencia de mutación del 1,3% en los pacientes HBOC [8]. Desde entonces, otros estudios han demostrado el papel de la
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gen en el desarrollo de OC en un máximo de 2,5% de las familias de HBOC de alto riesgo [9,10,11,12] incluyendo grandes reordenamientos genómicos raros [13] .
Un estudio realizado por Loveday et al. informaron que las mutaciones en la línea germinal en el gen
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(MIM: 602954) confieren susceptibilidad a la OC en el 0,9% de las familias de HBOC (predominantemente con más de un caso de OC) y se calculó el riesgo relativo (RR) en el 6,3 por OC y 1,32 para BC [14]. Varios otros estudios han confirmado su papel en la susceptibilidad OC [15,16,17,18]
Mientras que, juntos todos los genes moderada penetrancia raras individualmente pueden contribuir a una proporción significativa de riesgo de OC.; sin embargo, sus frecuencias varían en diferentes poblaciones [19]. El objetivo de nuestro estudio fue determinar la frecuencia de mutaciones germinales en
RAD51C
y
RAD51D Estar entre los pacientes Checa OC alto riesgo dado resultados negativos para
BRCA1
y
BRCA2
mutaciones.
Métodos
Los pacientes
Se analizaron 171 muestras de ADN (obtenidos a partir de sangre periférica) de
BRCA1
y
BRCA2
pacientes OC negativos recogidos en nuestro instituto entre 2000 y 2013. Ellos pertenecían a un grupo familiar (N = 62) o un grupo sin antecedentes familiares de cáncer (N = 109, Tabla 1) [20]. El grupo control consistió en muestras de ADN anónimos obtenidos de 1.226 personas, incluyendo 756 individuos que no tienen cáncer y 470 donantes de sangre, tal como se describe anteriormente [21,22].
Todos los pacientes y controles eran de ascendencia de Europa Central de origen checo de la región de Praga. El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital General Universitario de Praga y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito con el uso de muestras de ADN /ARN almacenado para fines de investigación.
análisis de la mutación
todos los exones codificantes individuales (con límites exón-intrón) separados por grandes regiones intrónicas en el
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gen se amplificó por PCR (cebadores se enumeran en la Tabla S1) y se analizaron mediante un análisis de fusión (GRH) en alta resolución el Light Cycler 480 (Roche) utilizando un HOT FirePol EvaGreen HRM Mix (Solis Biodyne) según las instrucciones del fabricante.
las variantes en las muestras con un perfil de fusión aberrante se confirmaron por secuenciación directa de las reacciones de PCR separadas utilizando el BigDye v3.1 en ABI3130 (Applied Biosystems).
Todos los exones de codificación (incluyendo límites intrón-exón) que se forman cuatro grupos exonic del
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genes fueron amplificados por PCR y se analizaron por secuenciación directa (PCR y secuenciación cebadores se enumeran en la Tabla S1).
Todos los exones con las mutaciones identificadas fueron seleccionados en 1.226 muestras de control por un HRM muestras de análisis y la variante se confirmaron por secuenciación.
Detección de grandes reordenamientos genómicos (LGRS) guía
el kit P260-A1 se utilizó para el análisis multiplex ligadura dependientes de la sonda de amplificación (MLPA) en
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de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los productos amplificados se separaron en ABI3130 y analizados por el software MRC Coffalyser (MRC Holanda). El kit MLPA para
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análisis no estaba disponible de cualquier proveedor en el momento del análisis.
ADNc análisis
Con el fin de determinar el efecto de la variante c intrónica. 1026 + + 5_1026 7delGTA que flanquean al intrón-exón de límites en
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se realizó un análisis basado en el cDNA. El ARN total aislado a partir de sangre venosa se transcribe de forma inversa en el ADNc usando la transcriptasa inversa Superscript III (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. Se amplificó el fragmento de PCR que abarca la región involucrada (cebadores están en S1 Tabla). producto de PCR que contiene de tipo salvaje y fragmentos aberrantes se secuenció con el fin de caracterizar variante de corte y empalme aberrante.
En silico análisis
La patogenicidad de las variantes de cambio de sentido se evaluó mediante la SIFT , herramientas de puntuación PolyPhen, Alinear GVGD, y CADD como se ha descrito anteriormente [21,22]. Las frecuencias de las variantes identificadas fueron comprobados en NHLBI Proyecto de Secuenciación Exoma (ESP; https://esp.gs.washington.edu/drupal/). Bases de datos y 1.000 Genomas (http://www.1000genomes.org/) guía
resultados
mutaciones patógenas que conducen al truncamiento de los productos proteicos fueron identificados en cinco de cada 171 (3%) de los pacientes de alto riesgo de OC, dos (1,2%) en
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y tres ( 1,8%) en
RAD51D gratis (Tabla 2). Dos alteraciones patogénicas fueron novela. Sin LGR fue encontrado en el
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gen, pero que no podía excluir la presencia de LGRS en el gen
RAD51D Windows que no fue analizado debido kit MLPA no estaba disponible en el momento del análisis. Ninguna de las alteraciones identificadas se encontró en los 1.226 controles sin cáncer. La edad al momento del diagnóstico y la historia familiar de cáncer en los portadores de las mutaciones 'se muestran en la Tabla 2.
Una novela c.379_380insG (p.P127Rfs * 28) variante en la
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fue encontrado en un paciente OC joven que murió 12 meses después del diagnóstico de adenocarcinoma mucinoso. Otro
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truncar variante era una alteración empalme de sitio, c.1026 + + 5_1026 7delGTA, identificado en un paciente que desarrolló carcinoma de endometrio siete años después de un diagnóstico de adenocarcinoma seroso de ovario. El potencial patogénico de esta alteración se demostró por el análisis de cDNA que reveló aberrante exón 8 omisión, que dio lugar a desplazamiento de marco y la terminación prematura de producto de traducción (p.R322Sfs * 22; figura 1). Esta variante se había informado anteriormente una vez en un control y un paciente, respectivamente, por Loveday
et al
. y en un estudio realizado por Golmard
et al
. [10,11].
La electroforesis (izquierda) de los productos de amplificación de PCR con cebadores localizados en el exón 5 y 3 'UTR secuencia (S1 Tabla) muestra dos productos en un No.1273 paciente en comparación con un tipo salvaje tipo de control de la muestra (C). Cromatograma de secuenciación del producto de PCR del paciente muestra la presencia de ARNm aberrante empalmada con la omisión de exón 8
La mutación única truncando se describe de forma recurrente en nuestro estudio fue c.694C & gt;. T (p.R232 *) en
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, que se encuentra en dos pacientes no relacionados con OC jóvenes adenocarcinoma seroso y sin antecedentes familiares de cáncer. El paciente diagnosticado anteriormente murió de difusión OC 10 años después del diagnóstico. Esta variante fue descrita previamente en pacientes HBOC españoles y americanos [18,16]. Una novela
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mutación, c.879delG (p.C294Vfs * 16), se encontró en un paciente OC con una hija que sufre de BC y la duplicidad OC.
Además de las variantes de truncar, nos Se han encontrado tres missense variantes raras (Tabla 2). El c.641G & gt; A (p.R214H) mutación en
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fue identificado recientemente en una mujer de origen africano antes de Cristo [12] y se describen como una variante de bajo riesgo en base a su historia familiar que está de acuerdo con predicciones de software. La segunda variante rara de sentido erróneo c.947A & gt; G (p.H316R) era novedoso; Sin embargo, estas dos alteraciones en
RAD51C
se predijo como no patógeno. La única rara c.629C variant- & gt; T (p.A210V) -en
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se describió anteriormente [18] y como se predijo patógena (Tabla 2)
Otras variantes de secuencia detectada. presentado en una base de datos dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) o HGMD (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/start.php) como se enumeran los polimorfismos en la Tabla S3.
Discusión
identificada línea germinal truncar mutaciones en el
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y
RAD51D
genes en el 1,2% y el 1,8% de los analizados alto individuos de riesgo, respectivamente, lo cual es consistente con estudios previos [23,24]. Nuestro estudio proporciona evidencia adicional de que ambos genes confieren una proporción limitada pero clínicamente notable de la susceptibilidad OC.
Los primeros estudios informaron truncando mutaciones deletéreas en el
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y
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genes predominantemente en las familias de HBOC con dos o más casos de OC [8,14]. Sin embargo, encontramos que la mayoría (cuatro de cada cinco mutaciones deletéreas claramente; Tabla 2) en un subgrupo de 109
BRCA1
y
BRCA2
pacientes OC negativos sin antecedentes familiares o BC OC. Esto está de acuerdo con los estudios posteriores que identificó
RAD51C
y
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mutaciones en una población no seleccionada de pacientes OC [25,16]. Estos resultados sugieren que las pruebas genéticas integral de la
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y
RAD51D
genes en pacientes OC no debería limitarse sólo a los pacientes de alto riesgo de OC con un historial familiar aparente, y un análisis de toda OC pacientes deben ser considerados independientemente de la historia familiar de cáncer y la edad de inicio [26].
la edad media de inicio OC para las mujeres con
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y
RAD51D
mutaciones publicados en los estudios anteriores eran de 60 años para
RAD51C gratis (revisado en [23]) y 56,6 años para
RAD51D gratis (Tabla S4). Šopík
et al
. propuso la cirugía preventiva que ser retrasada hasta después de la menopausia natural. Sin embargo, en nuestro estudio la edad media de inicio en OC portadores de variantes de truncar fueron 26,0 años para
RAD51C gratis (25 y 27 años, respectivamente) y de 48,7 años para
RAD51D gratis (37, 43 y 66 años, respectivamente). Mientras que un pequeño número de portadores de la mutación podría influir en esta observación, se supone que el hecho de que cuatro de los cinco portadores de mutaciones patógenas en el
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y
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genes eran mujeres premenopáusicas menores de 45 años podría ser de importancia clínica. Por lo tanto, son necesarios para estimar las recomendaciones clínicas para estudios posteriores de los transportistas en ambos genes de reducción del riesgo salpingo-ooforectomía bilateral (RR-BSO) y, hasta entonces, el inicio más temprano de la CO en la familia debe ser tomado en cuenta. Recientemente, Baker et al. informó RR-BSO en un paciente de 39 años antes de Cristo hembra que
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mutación de la familia con BC múltiple (pero sin OC) de los casos [24].
En nuestro estudio, sólo un caso índice, que lleva el
RAD51C patógena
mutación, se muestra la historia familiar de cáncer que incluía casos de OC y BC. Dado que los estudios anteriores no informó de un aumento de riesgo de CM para los transportistas, estudios posteriores describen algunas
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y
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truncar mutaciones en BC sólo las familias [13,27,28,18,24]. A pesar de estas mutaciones parecen ser muy rara en pacientes con CM, que son probablemente responsables de cierta predisposición antes de Cristo. Las genealogías de los portadores de mutaciones incluyen otros casos de cáncer de endometrio (, leucemia, la tiroides), cuya asociación con las mutaciones deben ser analizados con más detalle.
También se identificaron tres missense alteraciones raras en ambos genes (Tabla 2, S2 Mesa). Sólo el c.629C & gt; T, p.A210V missense variante poco frecuente en el gen
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se prevé que sea nocivo consistentemente en todas las herramientas de predicción de software utilizados. Sin embargo, su patogenicidad no se puede confirmar sin más la segregación y /o análisis funcionales. Por desgracia, no hemos podido realizar un análisis de co-segregación en otros parientes de la familia.
La penetrancia de mutaciones en los genes de penetrancia moderada no es fácil estimar [29]. Inicialmente, Meindl et al. informó una segregación completa de
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mutaciones en familias HBOC [8]. Otros estudios estiman el riesgo relativo (RR) de OC para los portadores de mutaciones en
RAD51C gratis (RR = 5,9) y
RAD51D gratis (RR = 6,3) [10,14]. Pelttari
et al
. descubierto un odds ratio (OR) para las mutaciones fundadoras finlandeses de cada gen en una población no seleccionada para ser 6.3 y 7.1, respectivamente [30,15]. Estos datos sugieren que el riesgo OC excede el umbral para genes penetrancia moderados en
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y
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mutaciones portadores y ambos genes tienen importancia clínica para las pruebas de diagnóstico y medidas preventivas para los transportistas que implican tanto OC y la gestión BC. Otros estudios y meta-análisis de los datos publicados de diversas poblaciones de todo el mundo se requieran para estimar la penetrancia en
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y
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portadores de la mutación convincente.
La utilidad clínica de la identificación de
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y
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portadores de la mutación no se limita a la predicción de la susceptibilidad al cáncer solamente. Ambas proteínas están implicadas en la señalización de daños en el ADN y la reparación DDSB funcionalmente cooperando con BRCA1 y BRCA2 en los procesos de recombinación homóloga (HR). Un fracaso de esta vía de reparación que podría esperarse en pacientes con cáncer que lleva la línea germinal mutaciones patógenas en
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y
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sensibiliza a las células cancerosas a los inhibidores de PARP; Por lo tanto, los pacientes portadores de la línea germinal
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y
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mutaciones pueden beneficiarse de este tratamiento [14].
En conclusión, describimos nuevas variantes patógenas en
RAD51C
y
RAD51D Opiniones y mostraron que truncar las mutaciones en ambos genes se podrían encontrar en el 3% de los pacientes OC Checa de alto riesgo. Nuestros resultados indican que el inicio de la CO en los portadores de mutaciones podría ser menor de lo esperado. Proponemos que el análisis de mutaciones de
RAD51C
y
RAD51D
debería ser implementado en la prueba de panel de genes múltiples integral en pacientes de alto riesgo de OC. Sin embargo, otros estudios en diferentes poblaciones pueden ayudar a mejorar las estimaciones del impacto clínico para los portadores de mutaciones en la línea germinal y permitir la determinación de un examen adecuado, seguimiento, prevención o estrategias.
Información de Apoyo
S1 Tabla . . PCR primer secuencias de
Resumen de los cebadores de PCR utilizados para la secuenciación, análisis de ADNc y la gestión de recursos humanos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0127711.s001 gratis (DOCX)
S2 tabla.
in silico
predicción para las variantes de cambio de sentido. Predicción del análisis Red de missense variantes raras identificadas en el
RAD51C
y
RAD51D
genes y la frecuencia de estas variantes en la secuenciación del exoma . y 1000 genomas proyectos
doi: 10.1371 /journal.pone.0127711.s002 gratis (DOCX)
S3 Tabla.
RAD51C
y
variantes RAD51D
secuencia descrita anteriormente
alteraciones (polimorfismos, variantes intrónicas) encontrado en nuestro estudio
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0127711.s003
(DOCX)
S4 Tabla. Características de los pacientes portadores de
RAD51D
patógena mutación
Edad de inicio de 21 pacientes y 15 pacientes OC BC llevan
RAD51D
mutaciones en los estudios publicados hasta el momento
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0127711.s004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Dedicado a la memoria de nuestro compañero y amigo, Petr Pohlreich, que falleció cuando el manuscrito estaba siendo escrito.
queremos agradecer a Marie Epsteinova y Marketa Dostálová por su excelente apoyo y pacientes técnica y sus familias para contribuir en este estudio.