Extracto
CD47 es una proteína de la superficie celular ampliamente expresado que funciona como un regulador de la fagocitosis mediada por células de la sistema inmune innato, tales como macrófagos y células dendríticas. CD47 sirve como el ligando para un receptor en estas células inmunes innatas, SIRP-alfa, que a su vez suministra una señal inhibidora para la fagocitosis. Hemos encontrado previamente el aumento de expresión de CD47 en la leucemia mieloide aguda humana primaria (AML) las células madre, y se demostró que el bloqueo de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 activar la fagocitosis y la eliminación de AML, linfoma no Hodgkin (NHL), y muchos tumores sólidos en xenoinjerto modelos. Aquí, se presenta el desarrollo de un anticuerpo anti-CD47 humanizado con una potente eficacia y propiedades favorables toxicocinéticos como un candidato terapéutico. Un nuevo anticuerpo CD47 anti-humano monoclonal, 5F9, se generó, y la humanización de anticuerpos se llevó a cabo mediante el injerto de su regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en un formato de IgG4 humana. El anticuerpo 5F9 humanizado resultante (Hu5F9-G4) obligado CD47 humana monomérica con una afinidad 8 nM. Hu5F9-G4 inducida potente fagocitosis mediada por macrófagos de las células de AML humanas primarias in vitro y completamente erradicada AML humano in vivo, que conduce a la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo de xenoinjertos derivados del paciente. Por otra parte, Hu5F9-G4 sinérgica con rituximab para eliminar NHL injerto y curar ratones xenoinjertados. Finalmente, los estudios toxicocinéticos en primates no humanos mostraron que Hu5F9-G4 podría administrarse de forma segura por vía intravenosa a dosis capaces de alcanzar niveles séricos potencialmente terapéuticos. Por lo tanto, Hu5F9-G4 está siendo activamente desarrollado para y se ha entrado en ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos y AML (ClinicalTrials.gov identificador: NCT02216409).
Visto: Liu J, L Wang, Zhao M, Tseng S, Narayanan C, Shura L, et al. Desarrollo (2015) pre-clínica de un anticuerpo anti-CD47 de anticuerpos con potencial terapéutico contra el cáncer. PLoS ONE 10 (9): e0137345. doi: 10.1371 /journal.pone.0137345
Editor: Kevin D. Bunting, Universidad de Emory, Estados Unidos |
Recibido: 2 de Junio, 2015; Aceptado: August 14, 2015; Publicado: 21 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California y de la financiación del Fondo Ludwig Virginia y DK para la Investigación del cáncer
Conflicto de intereses: JL, RM, y ILW han presentado solicitud de patente internacional WO 2011/143624 A2 titulado 'Los anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos a CD47. JL, RM, ILW, SW, JV, MH, y SP han presentado la solicitud de patente EE.UU. PCT /US2014 /018743 titulada "Métodos para alcanzar dosis terapéuticamente eficaces de los agentes anti-CD47. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El desarrollo del cáncer requiere células normales para adquirir métodos para dysregulate proliferación, evitar la muerte celular programada, y adquirir muchas de las otras características del cáncer [1]. Además, las células cancerosas deben evadir la eliminación celular programada, que es la eliminación fagocítica de células aberrantes por las células del sistema inmune innato, incluyendo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos y [2]. La estimulación de eliminación celular programada utiliza un número de señales pro-fagocíticas, muchos de los cuales no se caracterizan molecularmente, sino que puede incluir señales de proteínas tales como calreticulin [3], fosfolípidos como la fosfatidilserina, y la glicosilación anormal. Sin embargo, la inhibición de la eliminación celular programada se inhibe principalmente por una molécula dominante individual, CD47. Todos los cánceres humanos estudiados hasta la fecha, incluyendo tanto tumores sólidos y leucemia, CD47 expresa CD47, lo que hace un objetivo universal en el cáncer humano.
leucemia mieloide aguda humana (AML) es una malignidad agresiva de progenitores de médula ósea, que se caracteriza por un aumento en los glóbulos blancos inmaduros y fallo de la médula ósea. La LMA es el tipo más común de leucemia que afecta a los adultos agudas, con un mal pronóstico y pocas opciones terapéuticas. tratamiento de referencia actual para pacientes con LMA en buen estado físico consiste en quimioterapia de dosis alta, a menudo incluyendo el trasplante alogénico de células hematopoyéticas. Incluso con estos tratamientos agresivos, que causan morbilidad y mortalidad significativas, la recaída es común y la supervivencia global a los cinco años es sólo del 30-40%. Por otra parte, la mayoría de los pacientes es mayor de 65 años y no son candidatos para la quimioterapia de dosis alta, dando lugar a una supervivencia global a cinco años de 5.10% en este grupo [4,5].
Recientes los estudios han demostrado que la LMA se organiza como una jerarquía celular iniciada y mantenida por las células madre de la leucemia (LSC) que poseen las propiedades de células madre canónicas de auto-renovación y la capacidad de generar un gran número de células progenitoras leucémicas y explosiones [6,7]. Una consecuencia clave de este modelo de células madre del cáncer es que LSC debe ser eliminado para la curación; Sin embargo, LSC han demostrado resistencia a la quimioterapia estándar y el tratamiento de radiación [8,9]. Identificación de moléculas de superficie celular expresados preferentemente en las células madre de AML clínicamente relevantes ofrece una estrategia atractiva para el desarrollo de nuevas terapias de AML, ya que estas moléculas de superficie celular pueden servir como dianas potenciales para la terapia de anticuerpo monoclonal. Se han identificado un número de moléculas de superficie celular expresados preferentemente en AML LSC en comparación con las células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas normales, incluyendo CD47 [10].
CD47 posee una región variable de inmunoglobulina sencillo (IGV) -como dominio extracelular y regula múltiples procesos celulares implicados en la respuesta inmune [11]. Se expresa ampliamente en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas; Sin embargo, nos encontramos con anterioridad que CD47 fue más altamente expresado en la LMA LSC que sus contrapartes normales, y que el aumento de la expresión de CD47 en la LMA se asocia con pobres resultados clínicos [6,7,12]. CD47 hace una serie de interacciones proteína-proteína incluyendo
en cis
con integrinas y
en trans
con dos ligandos, trombospondina-1 (TSP-1) y la señal de regulación de proteínas alfa (SIRPα). SIRPα codifica un receptor de Ig-superfamilia cuya región citoplásmica contiene inmunorreceptoras motivos de inhibición basado en tirosina (ITIM) y se expresa en los macrófagos, células dendríticas, y las neuronas [13-18]. Tras la unión a CD47, SIRPα inicia una cascada de transducción de la señal inhibidora a través de la contratación de la homología src-2 de dominio que contiene la proteína tirosina fosfatasas SHP-1 y SHP-2, que a su vez entregar señales inhibidoras para la fagocitosis [19-22]. En la fisiología normal, CD47 se descubrió que era un marcador de la edad sobre los eritrocitos de ratón, que muestran una disminución progresiva expresión de CD47 probable que conduce a su eventual eliminación de fagocitosis por macrófagos sinusoidales del bazo, lo que sugiere que los glóbulos rojos más años de edad es probable que sean de mayor riesgo extravascular para la fagocitosis por los anticuerpos de bloqueo de CD47 [17,18,23].
el complejo proceso de fagocitosis depende del equilibrio relativo de los insumos pro-fagocíticas y anti-fagocíticas [2]. Sobre la base de estas observaciones, hemos propuesto un modelo en el que las células leucémicas se acumulan señales pro-fagocíticas, muchos de los cuales no están caracterizadas molecularmente. Como consecuencia, las células de leucemia expresan altos niveles de CD47 son probablemente seleccionan para contrarrestar señales pro-fagocíticas. De esta manera, las células de leucemia son dependientes de la expresión CD47 para evitar la eliminación de fagocitosis por las células inmunes innatas [24]
.
A partir de este modelo, que predijo que el bloqueo de la interacción CD47-SIRPα daría lugar a la dominación de pro- señales resultantes fagocíticas en la fagocitosis de las células de leucemia. Hemos validado esta hipótesis mediante la demostración de que un anticuerpo CD47 anti-humano de ratón de bloqueo disponible, B6H12, estimula la fagocitosis y la reducción de la carga de la AML injerto en modelos de xenoinjertos humanos primarios [6]. También la hipótesis de que un anticuerpo anti-CD47 bloqueo sería sinergia con un segundo anticuerpo capaz de unirse a receptores de Fc y entregar una señal pro-fagocítica potente. En consonancia con esta idea, se encontró que B6H12 y rituximab potentemente sinergía en la erradicación de la NHL en modelos de xenoinjertos [25]. Por último, se detectó la expresión de CD47 en las células de cáncer de muchos tumores sólidos y hematológicos, y encontramos que B6H12 activar la fagocitosis de las células de cáncer humanas primarias in vitro, inhibió el crecimiento de tumores humanos ortotópicamente xenotransplantado, evitando la metástasis de células tumorales humanas [ ,,,0],26-30].
en conjunto, estos estudios sugieren que un anticuerpo anti-CD47 humanizado de bloqueo puede ser un anti-cáncer eficaz terapéutica tanto como monoterapia y en combinaciones. En el presente estudio, se presenta el desarrollo de un nuevo anticuerpo CD47 anti-humano humanizado, designado Hu5F9-G4, generada por región determinante de complementariedad (CDR) injerto sobre un andamio IgG4 humana para minimizar el reclutamiento de funciones efectoras Fc dependiente de anticuerpos. Hu5F9-G4 inducida potente fagocitosis mediada por macrófagos de las células de AML humanas primarias in vitro y completamente erradicada AML humano in vivo, que conduce a la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo de xenoinjertos derivados del paciente. Por otra parte, Hu5F9-G4 sinérgica con rituximab para eliminar NHL injerto y curar ratones xenoinjertados. Finalmente, los estudios toxicocinéticos en primates no humanos mostraron que Hu5F9-G4 podría administrarse de forma segura por vía intravenosa a dosis capaces de alcanzar niveles séricos potencialmente terapéuticos. Por lo tanto, Hu5F9-G4 está siendo activamente desarrollado para ensayos clínicos en la LMA humana y tumores sólidos.
Materiales y Métodos
generación de anticuerpos
Un fragmento de ADNc de CD47 humano que codifica la dominio extracelular se clonó a partir de un humano de longitud completa CD47 cDNA (Open Biosystems) y se fusionó a Fc de ratón para generar una proteína de fusión CD47 /MFC, que fue utilizado para inmunizar ratones para producir anticuerpos CD47 anti-humano de ratón monoclonal. Los hibridomas se generan usando protocolos estándar. En resumen, los ratones Balb /c de 4-6 semanas de edad fueron inmunizados con proteína de fusión huCD47 /MFC recombinante purificada dos veces a la semana para un total de 4 semanas. Los títulos se evalúan a partir de entonces y las células del bazo se fusionaron con células SP2 /0. Se seleccionaron los hibridomas y los sobrenadantes de los clones resultantes se seleccionaron por la enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) y de células activadas por fluorescencia (FACS).
V del anticuerpo clonación y secuenciación
La estrategia de clonación utilizada aquí involucrado un aislamiento de ARN inicial a partir de células de hibridoma (Qiagen). Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 5F9 se obtuvieron utilizando técnicas 5 'RACE-PCR (Clontech) y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de DNA estándar.
Modelización molecular y la humanización de anticuerpos
Humanización de anticuerpos anti-CD47 5F9 de ratón se llevó a cabo mediante la instalación de residuos de CDR de anticuerpo de ratón en un marco humano de línea germinal (FR) [31]. Brevemente, ratón 5F9 se humanizó por el reclutamiento juicioso de residuos de CDR correspondiente. Las diferencias entre el ratón 5F9 y los residuos de FR humanos se modelaron de forma individual para investigar su posible influencia en la conformación de CDR. Humanizados genes VH y VL fueron sintetizados por McLab (South San Francisco, CA).
Transfección de células
293F células se cultivaron bajo FreeStyle ™ Expresión 293 Medio (Invitrogen). La transfección transitoria se realizó por co-transfección de vectores de expresión que codifican anticuerpos de cadena pesada y la cadena ligera usando 293fectin reactivo de transfección (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuatro a cinco días más tarde, los sobrenadantes de las células transfectadas se recogieron y se ensayaron para la secreción de anticuerpos por ELISA. Brevemente, placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con anticuerpo gamma 1 mg /ml de cabra anti-Fc humana en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 horas a 4 ° C. Después de bloquear durante 1 hora con 0,4% de BSA en PBS a temperatura ambiente, se añadieron sobrenadantes aislados en 1/3 de diluciones secuenciales, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron posteriormente lavadas tres veces y se incubaron con anticuerpo-kappa específico anti-humano de cabra conjugado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con OPT. La reacción se detuvo con 2M H
2SO
4, y OD se midió a 490 nM.
Purificación de anticuerpos y la caracterización
El sobrenadante de cultivo se aplicó a columnas de proteína A Sepharose (GE Healthcare). La columna se lavó con PBS, y después la proteína se eluyó con tampón (tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 3,0) eluyendo. Las fracciones recogidas se neutralizaron con 1 M Tris pH 9,0. Finalmente, las muestras purificadas se dializaron frente a PBS. La pureza de la fracción de anticuerpo eluido se analizó por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en 10% de geles en condiciones reductoras o no reductoras. Las bandas se visualizaron por tinción con azul brillante de Coomassie.
superficie celular de unión a antígeno de ensayo
YB2 /0 células que habían sido transfectadas de manera estable con CD47 humana se incubaron con 10 g /ml de Hu5F9-G4 o HuIgG4 a 4 ° C durante 1 hora. Entonces, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de incabation con 10 g /ml marcado con PE anti-humano Fc gamma anticuerpo específico (eBiosciences, San Diego, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante 1 hr. La unión se midió utilizando un FACSCanto (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). YB2 transfectadas-Un /0 células se utilizaron como un control negativo.
Competición ELISA
A ensayo de unión competitiva se utilizó para evaluar la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo anti-CD47 mAbs. Brevemente, placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con la proteína 1 mg /ml huCD47 /MFC fusión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 horas a 4 ° C. Después de bloquear durante 1 hora con 0,4% de BSA en PBS a temperatura ambiente, 10 g /ml marcado con biotina ratón 5F9 se añadió a las placas en presencia de diversas concentraciones de no marcado Hu5F9-G4 a temperatura ambiente durante 1 hr. Las placas se lavaron posteriormente tres veces y se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con OPT. La reacción se detuvo con 2M H
2SO
4, y OD se midió a 490 nM.
afinidad de anticuerpos medición
A cynomolgus CD47 cDNA se clonó a partir de la biblioteca de ADNc de bazo cynomolgus (BioChain, china). El dominio extracelular de CD47 cynomolgus fue clonado y fusionado a Fc de ratón para generar una proteína de fusión cynoCD47 /MFC, que fue utilizado en la medición de afinidad. CD47 humano /MFC se hizo mediante la fusión del dominio extracelular de CD47 de ADNc humano (Open Biosystems) con Fc de ratón como se describe anteriormente y se utiliza para medir la afinidad de unión diméricos a Hu5F9-G4. Además, CD47 humana /su proteína de fusión se hizo mediante la fusión del dominio extracelular de CD47 humano a la etiqueta de His y se utiliza para medir la afinidad de unión monomérica a Hu5F9-G4. Los estudios de unión se realizaron utilizando un Biacore 2000 (GE). tampón de ejecución fue de 10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% de Tween-20. Los datos fueron recolectados a 25 ° C. Cada muestra de mAb se acopló la amina a un chip sensor CM4 mediante la activación NHS /EDC estándar (7 minutos). Cada anticuerpo se diluyó a 10 ug /ml en 10 mM acetato de Na pH 5,0 y se inyecta hasta que se obtuvo el nivel deseado de inmovilización. Después, cada superficie fue bloqueada con 1 M de etanolamina durante 7 minutos. Cada muestra se ensayó por duplicado.
CD47-SIRPα interacción ensayo de bloqueo
placas
96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con 1 g /ml de proteína de fusión SIRPα /Fc humana en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 horas a 4 ° C. Después de bloquear durante 1 hora con 0,4% de BSA en PBS a temperatura ambiente, se añadió 1μg /ml de la proteína CD47 /Fc de ratón, ya sea en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de Hu5F9-G4 a temperatura ambiente durante 1 hr. Las placas se lavaron posteriormente tres veces y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón Fc durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con OPT. La reacción se detuvo con 2M H
2SO
4, y OD se midió a 490 nM. Cada muestra se analizó por triplicado.
in vitro
fagocitosis ensayo
ensayos in vitro de la fagocitosis en se realizaron como se ha descrito anteriormente. Brevemente, las células de AML humanas primarias de diferentes pacientes HL-60 o se CFSE-etiquetados y se incubaron con los macrófagos derivados de la sangre periférica humana en presencia de diferentes concentraciones de 5F9 de ratón, Hu5F9-G4, o un anticuerpo de control de isotipo durante 2 horas a 37 DO. Las células se lavaron con medio libre de suero IMDM y se resuspendieron en 200 l de medios. Entonces, las células se analizaron por microscopía de fluorescencia para determinar el índice de fagocitosis (número de células ingeridas por 100 macrófagos). El análisis estadístico usando la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism.
dependiente de anticuerpos citotoxicidad mediada por células (ADCC) de ensayo
ADCC se realizó de acuerdo a las instrucciones de kit ACELLA-TOX ™ bioluminiscencia citotoxicidad (Cell Technology). En resumen, las PBMC humana se incubaron durante la noche a 10
6 células /ml en medio completo IMDM humano con 400 unidades /ml de IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). El día siguiente, activado PBMC se utilizaron como células efectoras. 5 x 10
se añadieron 3 HL60 células en 25 l de IMDM medio humano completo por pocillo en una placa de fondo en U 96. Después, se añadieron 25 l de medio completo IMDM humano que contengan diversos anticuerpos a las concentraciones deseadas a cada pocillo. Después de 5 minutos de incubación a 37 ° C, 2,5 x10
5 PBMC en 25 l de IMDM se añadió medio completo humano a cada pocillo para dar una relación de células efectoras a células diana de 50: 1. Las mezclas se incubaron a 37 ° C durante 4 horas, seguido de la detección usando reactivos suministrados por los kits. Los ensayos se repitieron tres veces y figuras representativas se muestran aquí.
citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de ensayo
5 x 10
4 células diana en 50 l de IMDM + 10% FBS + Pen /Strep se añadieron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U. se añadieron 50 l de anticuerpos a diversas concentraciones (diluido con medio), a partir de 10 mg /ml a 10
-5 g /ml, con intervalos de 100 x dilución. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y después se añadieron 50 l de suero del complemento humano a cada pocillo, se mezcló y la placa se incubó a 37 ° C. Después de 2 horas de incubación, a 50 l de Alamar azul (AbD Serotec) se añadió en cada pocillo, se mezcló y la placa se incubó a 37 ° C durante la noche. En el día siguiente, la placa se enfrió a temperatura ambiente durante 15 minutos y leído por un lector de placas SpectraMax M3 para las señales de fluorescencia a la longitud de onda de excitación de 530 nm de longitud de onda y la emisión de 590 nm. unidad de fluorescencia relativa (RFU) se utiliza para indicar la cantidad relativa de células vivas después del ensayo. Los ensayos se repitieron tres veces y figuras representativas se muestran aquí.
receptor CD47 ensayo de ocupación
CD47 curva estándar en las células de AML de unión se realiza mediante el uso AF488 conjugado Hu5F9-G4 a diversas concentraciones. la ocupación del receptor se midió mediante la incubación de las células diana con no marcado Hu5F9-G4 en diferentes concentraciones, y a continuación, las células se sometió a ensayo, ya sea en
in vitro
fagocitosis o incubó con una concentración de saturación de AF488-Hu5F9-G4 basado en el curva estándar y se analizaron para la unión mediante citometría de flujo. la ocupación del receptor se calculó como sigue:
Apoptosis ensayo
células de AML primarias humanas se descongelaron y las células mononucleares viables se aislaron por centrifugación en gradiente sobre Ficoll utilizando protocolos estándar. Las células viables se resuspendieron a 1x10
6 por 50 ul en IMDM + 5% de SFB. Se añadió 10 ug /ml Hu5F9-G4 o control de isotipo de anticuerpos y las células se incubaron a 37 ° C durante 3 hr. La estaurosporina se utilizó como control positivo. Las células apoptóticas se identificaron mediante tinción con anexina V (BD Biosciences, Cat.#556547) según las instrucciones del fabricante y se analizaron por citometría de flujo.
In vivo
tratamiento con anticuerpos de AML humano ratones injertados
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional (Stanford APLAC#22264) y en la adhesión a los Institutos nacionales de la Salud
Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio
. Todos los ratones en este estudio fueron adquiridos de The Jackson Laboratory y se crían en casa. Cualquier animal que exhibe la pérdida de peso, letargo, postura encorvada, o pelaje rizado que no mejora en 1 semana de tratamiento con fluidos Nutrical y fue sacrificado. Nos sacrificados los animales cuando mórbida por protocolos institucionales
Hubo dos grupos de ratones en los estudios:. El grupo de control tratado con IgG de ratón y el grupo experimental tratado con anticuerpo Hu5F9-G4. Se espera que las muertes en el grupo de control debido a la insuficiencia de la médula ósea de leucemia fulminante. El grupo experimental sobrevivió bien y se sacrificó al final del estudio.
células crioconservadas de SU028 humano muestra, SU048, y SU266 se descongelaron en 10 ml de medio (IMDM + 10% FBS + estreptomicina glutamax + penicilina) y 100 g de DNasa I (StemCell) para realizar la depleción de células T. Brevemente, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón Robosep. Se selecciona el programa 18051-CD3 alta recuperación selección positiva humana y después de la finalización del programa, se recogió la fracción CD3, contó, y se prepara para la inyección intravenosa en HBSS (Life Technology) + 2% de tampón de FBS (Omega Ciencia). modelo de xenoinjerto LMA primaria humana se estableció en ratones NOD /SCID /IL-2Rgnull (NSG) ratones hembra de 8-10 semanas de edad. Los ratones se acondicionaron con 200 rads usando un irradiador gamma Faxitron CP-160 hasta 24 horas antes de la inyección intravenosa. 100 l de 5 x 10
6 células de AML primarias fueron inyectadas en ratones NSG por vena de la cola con una aguja de 29 G Terumo. A los 5 semanas después del trasplante, las células de médula ósea fueron aspirados de fémur usando agujas BD 27G y se tiñeron con el ratón anti-ratón CD45.1 PECy7 (eBiosciences, San Diego, CA, EE.UU.), de rata anti-ratón Ter119 PECy5 (eBiosciences , San Diego, CA, EE.UU.), ratón CD45 PB anti-humano (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.), de ratón anti-CD3 humano APC-Cy7 (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.), anti-ratón humano CD33 PE (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.), y el ratón anti-CD19 humano APC (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). El porcentaje de células CD33 + AML CD45 + humanas se determinó por citometría de flujo. Basado en el nivel de injerto de células AML humana, cinco ratones trasplantados con cada SU028 o SU048 muestra fueron asignados a uno de dos grupos de tratamiento: control de IgG de ratón o Hu5F9-G4 a 100 mg al día mediante inyección intraperitoneal. El tratamiento comenzó el día 1 y se prolongó durante 14 días consecutivos. El suero se recogió en el pretratamiento y 2 horas post-tratamiento después de la 1ª, 5ª, 8ª, 12ª, 14ª y la dosis para el análisis de FC. células de médula ósea fueron aspirados a diferentes puntos de tiempo para analizar AML injerto. Un conteo sanguíneo completo se analizó una vez al mes, utilizando HemaTrue analizador hematológico. En el día 159, se quitaron los ratones supervivientes para el análisis histológico de los huesos de la tibia. Para el tratamiento de ratones transplantados con SU266, cuatro o cinco fueron asignados a uno de tres grupos de tratamiento: ratón de control IgG, Hu5F9-G4 a 100 mg diariamente, y Hu5F9-G4 a 500 mg dos veces a la semana. El tratamiento comenzó el día 1 y se prolongó durante 14 días. Se recogió el suero en el tratamiento previo y 2 horas post-tratamiento para análisis PK. células de médula ósea fueron aspirados a diferentes puntos de tiempo para analizar AML injerto. Todos los ratones fueron seguidos para la supervivencia global, y el valor p de la supervivencia en los grupos tratados Hu5F9-G4 se comparó con los grupos de control de IgG de ratón. Al final del estudio, los ratones fueron sacrificados por el uso de CO2 para la eutanasia de roedores.
Sinergia de Hu5F9-G4 y rituximab en Raji Luc-EGFP ratones injertados GSN
Los ratones fueron injertados con Raji Luc-EGFP en una concentración en 1 millón de células /ratón a través de la inyección en vena de cola. Se obtuvieron imágenes de
in vivo
para determinar el nivel de injerto siete días después del injerto. El tratamiento comenzó el mismo día durante 21 días consecutivos. Todos los ratones fueron inyectados a través de inyección intraperitoneal. Los ratones fueron imágenes
in vivo
a través del sistema de imágenes IVIS Spectrum en los siguientes puntos de tiempo: Pre-tratamiento en el día 7 de injerto, Pon siete dosis en el día 14 de injerto, Pon catorce dosis en el día 21 de injerto, Post veintiún dosis en el Día 28 y una semana después del tratamiento en el día 35. evaluación de supervivencia se realizó en el día 217. en el final del estudio, los ratones fueron sacrificados por el uso de CO2 para la eutanasia de roedores.
estudio de toxicidad en primates no humanos
Todos los experimentos con primates no humanos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional (Stanford APLAC#26070) y en la adhesión a los Institutos nacionales de la Salud
Guía para el Cuidado y uso de Animales de Laboratorio
. Los monos fueron alojados socialmente (actualización de 3 animales del mismo sexo y grupo de dosificación juntos) en jaulas de metal, equipados con un piso de malla de acero inoxidable y una válvula de riego automático. Todos los recintos primarios fueron de acuerdo con lo especificado en la Ley de USDA Bienestar de los Animales (9 CFR, Partes 1, 2 y 3) y como se describe en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo de Investigación. Guía Nacional de Atención y uso de Animales de laboratorio Washington, DC:.. National Academy Press edición actual). Cada jaula estaba claramente marcado con un marcador que indica jaula de estudio, el grupo, número del animal, y el sexo. Temperatura: 64 ° F a 84 ° F (18 ° C a 29 ° C); Humedad: 30% a 70%; Ciclo de luz: 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (excepto durante los procedimientos designados); Ventilación: Diez o más cambios de aire por hora, con aire fresco 100% (sin recirculación)
Para el estudio de escalada de dosis, dos hembras se inscribieron y se dosificaron a intervalos de una semana:. NHP uno se administró una sola dosis de EPO (17.000 U /kg) 5 días antes de la primera dosis de Hu5F9-G4 (3, 10, 30, 100, y 300 mg /kg), y se administró una NHP Hu5F9-G4 (1, 3, 10 , 30, y 100 mg /kg) sin pre-tratamiento de la EPO. Se recogieron muestras de sangre para la medición del recuento sanguíneo completo, incluyendo la hemoglobina y el nivel sérico Hu5F9-G4.
En estudios separados PHN, monos cynomolgus hembra se les administró una sola infusión intravenosa de 1 hora de 0,1, 0,3, 1, 3, 10 o 30 mg /kg de Hu5F9-G4 o vehículo PBS como grupo de control (un animal por grupo) en el día 1, o una dosis de cebado (PD) en el Día 1 a dosis de 1 o 3 mg /kg, seguido por dosis semanales de mantenimiento (MD) de 10 o 30 mg /kg Hu5F9-G4 hasta el Día 43. las muestras recogidas en los diferentes estudios fueron los siguientes:
Hematología. Dosis única: se extrajo sangre dos veces antes de las inyecciones ya los 3, 6, 10 y 14 días después de la administración. PD /MD dosis: se extrajo sangre dos veces antes de las inyecciones ya los 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 29, 36, y 43 días después de la administración
Química clínica.. Dosis única: se extrajo sangre dos veces antes de las inyecciones ya los 6 y los 14 días siguientes a la administración. PD /MD dosis: se extrajo sangre dos veces antes de las inyecciones ya los 6, 13, 20, 29, 36, y 43 días después de la administración
Análisis de orina.. Dosis única: se recogieron hasta 14 ml de orina dos veces antes de la inyección y en el 3 y el 10 día después de la inyección. PD /MD dosis: hasta 14 ml de orina se recogió dos veces antes de la inyección y a los 3, 10, 17, y 24 día después de la inyección
El análisis farmacocinético.. La sangre se recogió por punción venosa en tubos con anticoagulante no en diferentes puntos de tiempo, como se indica en la figura 4B y 4D. nivel sérico de Hu5F9-G4 se midió por ELISA como se ha descrito anteriormente usando la proteína de fusión CD47 /Fc de ratón como reactivo de recubrimiento, seguido por la detección con un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-kappa humana.
Todos los animales fueron controlados dos veces al día para la mortalidad y moribundity cheques. Los pesos corporales se midieron al menos una vez antes del estudio y después semanalmente comenzando el día 7.
Resultados
Generación de anticuerpos monoclonales contra CD47 humano
Un fragmento de ADNc de CD47 humana que codifica el dominio extracelular se fusionó a Fc de ratón para generar una proteína de fusión hCD47 /MFC, que fue utilizado para inmunizar ratones para producir anticuerpos CD47 anti-humano de ratón monoclonal. La especificidad de los clones de hibridomas seleccionados se examinó mediante FACS se unen a las células YB2 0 rata CD47 transfectadas con cualquiera de los padres o humanos /. Uno de los clones positivos se obtuvo y que se denominan 5F9. El uso de cebadores universales de anticuerpos, las regiones variables de cadena pesada y ligera de 5F9 se clonaron con éxito. Múltiples clones de cada producto de gen V se secuenciaron para controlar los errores inducidos por PCR, y las secuencias de aminoácidos de VH y VL de 5F9 se determinaron (Fig 1A y 1B). análisis de la secuencia de ADN demostró que la cadena pesada de 5F9 utiliza un segmento V de la familia IGHV1, y que la cadena ligera pertenece al subgrupo IGKV1
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(AB) Comparación de ratón y humanizado 5F9 pesada variable (A) y la luz (B) regiones. CDRs se marcan como se indica. (C) de rata YB2 /0 células transfectadas de manera estable con CD47 humana y YB2 parental /0 células fueron teñidas con control de isotipo IgG4 humano o Hu5F9-G4 y se analizaron para unión a la superficie por citometría de flujo. (D) biotinilado de ratón 5F9 la unión a CD47 humano /MFC se detectó por ELISA en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de no marcado Hu5F9-G4 o control de isotipo. Cada muestra se ensayó por duplicado y los valores se presentan SEM. p-valores indicados se determinaron mediante ANOVA de dos factores en comparación. (E) La unión de Hu5F9-G4 a monomérica o dimérica CD47 fue analizada por resonancia de plasmón superficial produciendo las trazas indicadas y las constantes de unión. Los datos se procesaron restando las respuestas de la superficie de referencia, así como un promedio de las inyecciones de tampón. Las respuestas fueron globalmente en forma de una mezcla 1: modelo de interacción 1, que incluye un término para el transporte de masa. El número entre paréntesis representa el error estándar en el último informe dígitos.
El modelado molecular y la humanización de anticuerpos 5F9
Con el fin de humanizar 5F9, varios modelos en 3D de la Fv de la anticuerpo diana se construye a partir de combinaciones de estructuras conocidas. 2PCP y 2JEL exhibir 93% y 95% de identidad con 5F9, respectivamente, se utilizaron para el modelado VL. 2PCP y 1CIC exhibir 70% y 78% de identidad con 5F9, respectivamente, se utilizaron para el modelado de VH. Para seleccionar regiones estructurales de anticuerpos humanos (FR) para ser utilizados como plantillas para el injerto de CDR, las regiones VL y VH 5F9 de ratón se compararon con los de las secuencias de la línea germinal humana.