Extracto
escoparona, un compuesto natural aislado de
Artemisia capillaris
, se ha utilizado en China hierbas medicinales para el tratamiento de la ictericia neonatal. transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) contribuye al crecimiento y la supervivencia de muchos tumores humanos. Este estudio se realizó para investigar la actividad anti-tumor de escoparona contra las células cancerosas de próstata DU145 y para determinar si sus efectos son mediados por la inhibición de la actividad STAT3. Escoparona inhibió la proliferación de las células DU145 mediante la detención del ciclo celular en G
1 fase. Ensayos de transfección transitoria demostraron que escoparona reprime tanto la actividad transcripcional constitutiva e inducida por IL-6 de STAT3. Los análisis de transferencia de Western y cuantitativa en tiempo real PCR demostró que escoparona suprime la transcripción de genes diana STAT3 como la ciclina D
1, c-Myc, survivin, Bcl-2, y Socs3. Consistente con esto, escoparona disminución de la fosforilación y la acumulación nuclear de STAT3, pero no redujo la fosforilación de janus quinasa 2 (JAK2) o Src, las principales quinasas aguas arriba responsables de la activación de STAT3. Además, la actividad transcripcional de un mutante constitutivamente activa de STAT3 (STAT3C) fue inhibida por escoparona, pero no por AG490, un inhibidor de JAK2. Además, el tratamiento escoparona suprimió el crecimiento independiente de anclaje en agar blando y el crecimiento de tumores de xenoinjertos de DU145 en ratones desnudos, concomitante con una reducción en la fosforilación de STAT3. modelado computacional sugirió que podría obligar a la escoparona dominio SH2 de STAT3. Nuestros hallazgos sugieren que escoparona provoca una actividad antitumoral contra las células de cáncer de próstata DU145, en parte, a través de la inhibición de la actividad STAT3.
Visto: Kim J-K, Kim J-Y, Kim H-J, K Parque-G, Harris RA, Cho W-J, et al. (2013) escoparona Ejerce actividad antitumoral contra las células del cáncer de próstata DU145 mediante la inhibición de STAT3 Actividad. PLoS ONE 8 (11): e80391. doi: 10.1371 /journal.pone.0080391
Editor: Michael Muders, Hospital Universitario Carl Gustav Carus de Dresden, Alemania |
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: 2 Octubre de 2013; Publicado: 15 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Su obra fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Investigación [2012R1A2A2A01043867, 2012R1A2A1A03670452, y el Programa básico de Investigación de Ciencias, (2012 a 0.001.350)] financiado por el Ministerio de Ciencia, ICT & amp; Planificación futuro y una subvención de la tecnología de amplificador Corea Salud I +; D Proyecto, Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea (A111345). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
próstata es el segundo cáncer más común y la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres en todo el mundo [1]. Aunque el cáncer de próstata metastásico responde inicialmente a la terapia de privación de andrógenos, la mayoría de los pacientes finalmente progresan a un estado de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [2,3]. Incluso con quimioterapia basada en docetaxel, el tratamiento de pacientes con carcinoma metastásico CRPC sigue siendo un problema clínico importante. En este contexto, el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) vía de señalización ha sido validado como un objetivo terapéutico prometedor en el cáncer de próstata metastásico: esta proteína se activa de forma aberrante en el cáncer de próstata y contribuye a la promoción de la progresión metastásica [4,5 ].
STAT3, uno de los siete factores de transcripción STAT de la familia, funciona como un efector aguas abajo de diversas citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, incluyendo IL-6, factor de crecimiento epidérmico (EGF), y la leptina [6-9]. En respuesta a estímulos extracelulares, STAT3 se activa a través de la fosforilación en Y705 y S727 por tirosina quinasas no receptoras, incluyendo JAK2 y Src, y por proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) [10-12]. proteínas fosforiladas STAT3 forman dímeros que translocate en el núcleo, donde regulan la transcripción de los genes diana. Aunque su fosforilación es transitorio y estrechamente regulado en las células no transformadas normales, STAT3 se activa persistentemente en una variedad de tumores humanos, incluyendo tumores malignos hematológicos (leucemia, mieloma múltiple y linfoma) y tumores sólidos (cabeza y cuello de células escamosas de carcinoma de [HNSCC] , cánceres de melanoma, de colon, de hepatoma, mama, y próstata) [13-17]. Un gran número de estudios han proporcionado evidencia convincente para el papel oncogénico de STAT3 constitutivamente activa [13-20]. la activación persistente de STAT3 promueve diversos procesos tumorigénicos y metastáticos a través de la regulación transcripcional de varios genes implicados en la proliferación celular (ciclina D
1, c-Myc, y p21), la supervivencia (Bcl-2, MCL-1, y survivina), metástasis (MMP-2 y MMP-9), y la angiogénesis (VEGF). Por lo tanto, STAT3 es ahora considerado para representar una diana molecular prometedora para el desarrollo de terapias contra el cáncer utilizando métodos directos e indirectos [13,14,21].
escoparona (6,7-dimetoxicumarina), una de las principales constituyente de la hierba china
Artemisia capillaris gratis (yin barbilla), se ha utilizado para el tratamiento de la ictericia neonatal en Asia [22,23]. El efecto protector de escoparona contra hiperbilirrubinemia está mediada por la activación constitutiva del receptor androstano (CAR), un receptor de hormona nuclear que actúa como un factor de transcripción para regular positivamente la expresión de las enzimas que participan en el aclaramiento de la bilirrubina. Escoparona también posee varias otras propiedades biológicas, incluyendo anti-coagulante, hipolipidémico, vasodilatador, anti-oxidante, y los efectos anti-inflamatorios [24-28]. La inhibición de la actividad transcripcional del factor nuclear-kappaB (NF-kB) parece responsable de su actividad anti-inflamatoria [28]. Sin embargo, el potencial de la actividad anti-tumor de escoparona y sus dianas moleculares distintas de CAR y NF-kappa B no han sido ampliamente investigado. En este estudio, se evaluó la actividad anti-tumor de escoparona contra las células de cáncer de próstata independientes de andrógenos DU145 y se encontró que sus mecanismos moleculares de acción están asociados con la inhibición de la actividad STAT3.
Materiales y Métodos
Reactivos y construcciones de plásmidos
escoparona (6,7-dimetoxicumarina), AG490 (un inhibidor de JAK2), TNF-α, forskolina (FSK), y forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) eran adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). IL-6 se obtuvo de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). El constructo indicador M67-Luc y los vectores de expresión de tipo salvaje STAT3 o una forma constitutivamente activa de STAT3 (STAT3C) [20] fueron regalos de tipo Dr. James E. Darnell (la Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE.UU.) . construcciones de reportero (NF-? B-Luc, AP-1-Luc, CRE-Luc, y Egr-1-Luc) y vector de expresión de Egr-1 se han descrito anteriormente [29]. El indicador de luciferasa pTOPFLASH constructo [30] y el vector de expresión para la mutante activo dominante de β-catenina humana (Delta N-β-catenina) que contiene una deleción en marco N-terminal de los aminoácidos 29 a 48 [31] fueron amablemente donados por El Dr. Hans Clevers (Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos) y el Dr. Frank McCormick (Universidad de California, San Francisco, CA, EE.UU.), respectivamente. Para generar el Vxy Puro-LUC, el ADNc que codifica la luciferasa de luciérnaga se amplificó por PCR y se insertó en el
Bam H1
/Xho
1 sitios de plásmido Vxy-puro [12].
Ética declaración
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales apropiadas para la investigación con animales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Kyungpook (Permiso Número: 2013-0015).
Cultivo de células y transfección transitoria de ensayo
próstata humano líneas celulares de cáncer (DU145 y PC-3), una línea de células epiteliales de próstata humana inmortalizada (RWPE-1), líneas celulares de cáncer de mama humano ( líneas MCF-7 y MDA-MB-231), humanos de carcinoma hepatocelular celulares (HepG2 y Hep3B), una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa), y líneas celulares de cáncer de colon (HT-29, HCT-116 y HCT-15) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). DU145, PC-3, MDA-MB-231, HeLa, HT-29, HCT-116 y HCT-15 células fueron cultivadas en RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS ; Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) y antibióticos. células MCF-7 y Hep 3B se cultivaron en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS y antibióticos. células RWPE-1 se cultivaron en medio completo libre de suero de queratinocitos (K-SFM; Invitrogen) que contiene 50 mg /ml de extracto de pituitaria bovina, 5 ng /ml de EGF humano recombinante, y antibióticos. las células HepG2 se cultivaron en MEM (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS y antibióticos. Para los ensayos de transfección transitoria, HepG2 (8 × 10
4), DU145 (3 × 10
4), y PC-3 (3 × 10
4) las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con el constructo indicador M67-Luc (200 ng /pocillo), con o sin vector de expresión (100 ng /pocillo) durante sea de tipo salvaje o STAT3 mutante constitutivamente activa (STAT3C) utilizando el reactivo de transfección TransIT-LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI, EE.UU.). las células HepG2 también se transfectaron con pTOPFLASH o Egr-1-Luc plásmidos indicadores (200 ng /pocillo) junto con o sin plásmidos de expresión (100 ng /pocillo) para Delta N-β-catenina o Egr-1, respectivamente. plásmido de expresión pSV40-β-galactosidasa se utilizó como control interno. A las 24 h después de la transfección, las células fueron estimuladas con IL-6 (10 ng /ml) durante 24 h, si es necesario, y después se recogieron para ensayos de luciferasa y β-galactosidasa. La actividad de luciferasa se normalizó contra la actividad de β-galactosidasa.
proliferación de las células de ensayo
Ensayos de proliferación celular se realizaron con el kit de ensayo de proliferación celular WST-8, como se describe anteriormente [29]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
3 células /pocillo y se privaron de suero durante 24 h. Las células fueron estimuladas con 10% de FBS en presencia de 0,1% de DMSO (vehículo) o 0,1, 1, 10, 50, 100, 200, 500 o 1.000 mol /L de escoparona de 72 h. Las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 2 h en medio que contenía WST-8 reactivo (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón). La absorbancia a 450 nm se midió para determinar la proliferación celular.
análisis de citometría de flujo del ciclo celular
análisis del ciclo celular por citometría de flujo se llevó a cabo como se describe anteriormente [29]. Brevemente, las células DU145 (4 × 10
5 células /100 mm de plato de cultivo) fueron sincronizados en G
0 /G
1 fase por privación de suero durante 24 h. Sobre la base de un informe anterior [32] que muestra que las células DU145 privadas de suero progresado de G
1 a la fase S del ciclo celular después de 27,5 h de estimulación con suero, las células se estimularon con 10% de FBS en presencia de 0,1% de DMSO o escoparona (0,5 y 1 mmol /L) durante 28 h. Las células se recogieron y, a continuación, se analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Bioscience).
Western blot análisis
Western blot se realizó como se describió anteriormente con modificaciones menores [12,29]. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a Immobilon-P-membrana (Millipore, Billerica, MA). Después del bloqueo, la membrana se incubó con anticuerpos primarios contra la ciclina D
1, fosfo-pRb (ppRb), JAK2, fosfo-JAK2 Tyr1007 /1008 (pJAK2), Src, familia fosfo-Src Tyr416 (pSrc), STAT3, fosfo-STAT3 Tyr705 (pSTAT3 Y705), fosfo-STAT3 Ser727 (pSTAT3 S727), survivina, c-Myc, SOCS3, y Bcl-2 (Señalización celular, Beverly, MA, EE.UU.); Ciclina E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), y β-actina (Sigma-Aldrich). Después del lavado, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) - o IRDye conjugado (IRDye 800CW y IRDye 680LT, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) anticuerpos secundarios, y las señales se detectaron utilizando el sistema de detección de transferencia Western ECL (Amersham , Buckinghamshire, Reino Unido) o del sistema de imágenes por infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.), respectivamente. β-actina se utilizó como control de carga de proteínas. intensidad de la señal se cuantificaron por densitometría usando el software Image J y normalizado contra las señales de beta-actina correspondientes.
PCR (QRT-PCR)
células DU145 cuantitativa en tiempo real se incubaron con escoparona para 1, 3, 6, 12, o 24 h. El ARN total fue extraído utilizando el reactivo de lisis QIAzol (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y 1 g de ARN total fue transcrito invertir utilizando el kit de síntesis RevertAid la primera cadena de ADNc (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) de acuerdo con los fabricantes "instrucciones. Para QRT-PCR, se utilizó 25 a 50 ng de ADNc para la amplificación por PCR (temperatura de hibridación: 60C) usando energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) con el ViiA ™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). Ácido P0 fosfoproteína ribosómica (RPLP0; 36B4) se utilizó como control interno. condición de la PCR y secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.
El análisis de inmunofluorescencia
DU145 células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio y se dejó que se unieran durante 24 h. En base a los resultados de la transferencia Western que muestra la reducción sostenida de la fosforilación de STAT3 2-6 h después del tratamiento escoparona, las células se trataron con escoparona (0,5 mmol /L) durante 4 h. Las células fueron fijadas con 95% de etanol durante 15 min a -20 ° C, y después se incubaron con anticuerpos contra pSTAT3 (Y705) o STAT3 seguido de incubación con Alexa Fluor 488- o Alexa Fluor 568 anticuerpos secundarios marcados con, respectivamente. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI y se obtuvieron imágenes confocales y se fusionaron.
se realizaron independiente del anclaje ensayo de crecimiento
ensayos de colonias de formación de agar blando como se describe previamente con modificaciones menores [12]. DU145 (1 × 10
4) células en 1,5 ml de medio de crecimiento se mezclaron con 1,5 ml de 0,5% de agarosa en medio de cultivo calentado que contiene vehículo (0,1% DMSO) o 50, 100, o 200 mmol /L de escoparona y en capas en la base de agar al 0,5% en placas de cultivo celular de 60 mm. se añadió medio de cultivo que contiene escoparona una sola vez; Posteriormente, se añadió medio sin escoparona cada semana durante 21 días hasta que las colonias grandes fueron evidentes. Las células se tiñeron con cristal violeta para el recuento de colonias.
El modelado molecular y el estudio de acoplamiento
El estudio de modelado y acoplamiento molecular se realizó mediante Surflex-Dock en Sybyl versión 8.1.1 por Tripos Associates (St . Louis, MO, EE.UU.), tal como se describe anteriormente [33]. La estructura cristalina de STAT3 se recupera de la Protein Data Bank (PDB código ID 1BG1) y refinado para el proceso de acoplamiento [34]. La estructura de escoparona se ha creado usando el paquete de SYBYL con longitudes de enlace y ángulos estándar, y reduce al mínimo utilizando el método del gradiente conjugado hasta que el gradiente fue 0,001 kcal /mol con el campo de fuerza Tripos. La carga Gasteiger-Hückel, con una función dieléctrica dependiente de la distancia, se aplica para el proceso de minimización. La imagen de la interacción predicho fue creado con la MOLCAD programa de gráficos moleculares. Después de ejecutar Surflex-Dock, el confórmero con mejor puntuación total fue seleccionado y utilizado para predecir los patrones de unión detallados en la cavidad.
Establecimiento de líneas celulares estables que expresan luciferasa de luciérnaga
Para generar retrovirus que expresa luciferasa de luciérnaga, las células Phoenix a se transfectaron con el Vxy Puro-LUC como se describe anteriormente [12]. células DU145 fueron transducidas con retrovirus que expresan la luciferasa de luciérnaga y seleccionaron con puromicina (1 mg /ml) durante 2 semanas. Se verificaron DU145 seleccionado (DU145-Luc) las células para la actividad de luciferasa y para el efecto anti-proliferativo de escoparona (datos no publicados).
modelo de xenoinjerto de tumor y análisis inmunohistoquímicos
Seis semanas de edad, macho atímicos BALB /c desnudos (nu /nu) (Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japón) Se aclimataron en condiciones controladas condiciones básicas de una semana antes del experimento acuerdo con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio del Instituto Nacional de Salud. DU145-Luc (5 × 10
6) células en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho del área dorsal de ratones desnudos atímicos macho (Balb /c SLC-
nu /nu
, 7 semanas antiguo). El diámetro del tumor se midió con una regla externamente pinza cada 2 días, y (3 mm
) se estimó el volumen del tumor. Después de 7 días, cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 20-25 mm
3, los ratones fueron imágenes en el sistema de formación de imágenes IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE.UU.) 10 minutos después de la inyección i.p. inyección de 100 l XenoLight D-luciferina (30 mg /mL, Caliper). Los animales se dividieron al azar en dos grupos (n = 8 /grupo) y intraperitoneal dado (i.p.) inyecciones de vehículo o escoparona (30 mg /kg) cada 2-3 días durante 18 días. Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (Entobar; Hanlim Pharmaceutical, Yong-In, Corea) y la imagen en el sistema de formación de imágenes IVIS. tumores de xenoinjertos fueron extirpados para medición de volumen y la inmunohistoquímica. Para el análisis inmunohistoquímico, se eliminaron los tejidos tumorales, fijado en formol y embebidos en parafina. secciones de tumor de 4 micras de serie se desparafinaron en xileno, se rehidrataron a través descendente grados de etanol, y, o bien se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) o se sometieron a análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos contra pSTAT3 (Y705) y survivina como se describe anteriormente [29] .
El análisis estadístico
Los datos se expresan como medias ± SEM Los análisis estadísticos se realizaron con el de Student no pareada
t-test
, y un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
escoparona provoca un efecto antiproliferativo sobre las células de cáncer de próstata humano DU145 mediante la inducción de la detención del ciclo celular en G
1 fase
Para evaluar el potencial anticáncer de escoparona en las células de cáncer de próstata
in vitro
, se realizó un ensayo de proliferación celular WST-8 en dos líneas independientes de andrógenos humanos de cáncer de próstata (DU145 celulares y PC-3) y una línea inmortalizada de células epiteliales de próstata humana (RWPE-1). tratamiento escoparona durante 72 h inhibió significativamente la proliferación de células DU145, con una CI
50 valor de 41,3 mmol /L. Sin embargo, el medicamento ejerce poco efecto inhibidor del crecimiento en PC-3 y las células RWPE-3 a esa concentración (Figura 1A). Sin embargo, ambas líneas celulares mostraron reducción de la proliferación a concentraciones más altas del fármaco (& gt; 100 mmol /l), que también se observó para varias otras líneas celulares derivadas de cánceres de mama (MCF-7 y MDA-MB-231), carcinomas hepatocelulares (HepG2 y Hep3B), cáncer de cuello uterino (HeLa), y los cánceres de colon (HCT-15 HCT-116 y HT-29) (Figura 1A y Figura S1), lo que sugiere que escoparona tiene un efecto general anti-proliferativa en las células cancerosas.
A y B. escoparona inhibe la proliferación de líneas celulares de cáncer humano. Las células de cáncer de próstata (DU145 y PC-3), RWPE-1 (una línea de células epiteliales de próstata humana inmortalizada), y las células de cáncer de mama (MCF-7 y MDA-MB-231) fueron suero de hambre durante 24 h. Las células fueron incubadas en medio de crecimiento suplementado con 10% FBS en presencia de vehículo (0,1% DMSO) o las concentraciones indicadas de escoparona durante 72 h, y la proliferación celular se determinó por WST-8 ensayo. Los datos se expresan como porcentajes del control del vehículo (definido como 100%) y representan las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. B. escoparona induce la detención del ciclo celular en G
1 de fase en las células DU145. células DU145 privadas de suero se estimularon con 10% de FBS en presencia de vehículo o escoparona (0,5 y 1 mmol /L) durante 28 h, y después se sometieron a análisis de citometría de flujo del ciclo celular. gráfico de barras que indica el porcentaje de células en G
1 fase. Los datos son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.
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P Hotel & lt; 0,001 frente a control de vehículo;
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P Hotel & lt; 0,005,
##
P Hotel & lt; 0,001 vs. la estimulación con suero. C. Representante de Western Blot análisis de las proteínas relacionadas con el ciclo celular. células DU145 se trataron con escoparona (0,5 mmol /L) durante los tiempos indicados, y después se recogieron para análisis de transferencia Western. D. La cuantificación de los niveles de proteína relativos. intensidad de la señal se cuantificaron por análisis densitométrico y se normalizó a la de la señal de β-actina correspondiente. El nivel de expresión de cada proteína se expresa como una proporción con respecto al nivel en el control en tiempo de 0 h, que se definió como 1. Los datos representan las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes.
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P Hotel & lt; 0,05,
#
P Hotel & lt; 0,005 frente al control del vehículo en cada momento.
A fin de determinar si el efecto antiproliferativo de escoparona se debe a la inhibición de la progresión del ciclo celular o la inducción de la apoptosis, se llevó a cabo una citometría de flujo análisis del ciclo celular en las células DU14, que eran los más sensibles al efecto inhibidor del crecimiento de escoparona. De acuerdo con un informe anterior [32], el porcentaje de células DU145 que progresan en la fase S del ciclo celular se incrementó significativamente después de 28 h de la estimulación con suero. En presencia de escoparona, el aumento estimulada por suero en la población celular de la fase S se redujo, y el número de células en G
1 fase se aumentó al mismo tiempo (Figura 1B). Sin embargo, el sub G
1 pico, indicativo de una población de células apoptóticas no se incrementó por escoparona. Por lo tanto, en las células DU145, escoparona induce la detención del ciclo celular en G
1 fase sin inducción de la apoptosis.
El G
detención del ciclo celular en fase 1 inducida por escoparona fue confirmado mediante el examen de los niveles celulares de las proteínas reguladoras del ciclo celular que promueven el G
1-S transición. Los análisis de transferencia de Western reveló que escoparona incrementó los niveles de proteínas inhibidoras del ciclo celular, tales como p21 y p27, que son inhibidores de la ciclina /Cdk complejo (Figura 1C y D). Por el contrario, se redujo significativamente los niveles de la del ciclo celular promoción de proteínas ciclina D
1 y fosforilados pRb (ppRb), aunque tuvo poco efecto sobre la expresión de la ciclina E. Estos hallazgos demuestran que escoparona induce G
la detención del ciclo celular en fase 1 mediante la alteración de los niveles de proteínas que influyen en la progresión del ciclo celular.
escoparona inhibe constitutiva e IL-6 estimula la actividad transcripcional de STAT3
Para identificar los factores de transcripción que están dirigidos por escoparona, se evaluó su efecto sobre la actividad transcripcional de varios factores de transcripción que desempeñan papeles importantes en la proliferación de células de cáncer. Curiosamente, escoparona fuertemente reprimidas STAT3 estimulada por IL-6 la actividad transcripcional (Figura 2A) y, según lo informado, reprime la actividad transcripcional de NF-kB estimulada por TNF-α. Escoparona también inhibió ligeramente inducida por PMA actividad AP-1 y la actividad de Egr-1, mientras que ejerce poco efecto sobre la transcripción CREB- o β-catenina-dependiente (Figura S2).
A. El efecto de la escoparona en las actividades de los factores de transcripción. Las células HepG2 fueron co-transfectadas transitoriamente con diferentes plásmidos informadores de luciferasa dirigido por promotores sintéticos que contienen sitios de unión para factores de transcripción pertinentes. A las 24 h después de la transfección, las células se trataron con los estimuladores de aguas arriba apropiados y escoparona durante 24 h, y después se recogieron para ensayos de luciferasa y β-galactosidasa. RLU, unidades relativas de luminiscencia. Los datos son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.
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P Hotel & lt; 0,0005,
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P Hotel & lt; 0,005 vs. reportero solo;
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P Hotel & lt; 0,005,
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P Hotel & lt; 0.001,
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P Hotel & lt; 0,01 frente a la estimulación. B. escoparona inhibe tanto la constitutiva y la IL-6-estimuló la actividad transcripcional de STAT3. células DU145 se transfectaron transitoriamente con M67-Luc, un promotor sintético que contiene cuatro copias del sitio de unión de STAT3. las células PC-3 fueron co-transfectadas con M67-LUC y el vector de expresión de tipo silvestre-STAT3. A las 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con IL-6 en presencia de escoparona de 24 h. Los datos son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.
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P Hotel & lt; 0,005,
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P Hotel & lt; 0,05,
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P Hotel & lt; 0.01 vs. reportero solo;
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P Hotel & lt; 0,01,
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P Hotel & lt; 0,005 vs. IL-6 de la estimulación. C y D. QRT-PCR y Western blot análisis de STAT3 genes diana aguas abajo. células DU145 se trataron con escoparona (0,5 mmol /L) durante los tiempos indicados, y después se recogieron por qRT-PCR (C) y Western blot (D) análisis. los niveles de mRNA de STAT3 genes diana se determinaron por análisis de QRT-PCR (C) y normalizado contra el nivel de RPLP0 /36B4. Los datos se expresan como medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado.
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P Hotel & lt; 0,05,
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P Hotel & lt; control del vehículo 0.005 vs. en cada punto de tiempo. los niveles de expresión de la proteína (D) se cuantificaron por análisis densitométrico y se normalizó frente a los correspondientes niveles de β-actina. Los datos se expresan como medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes.
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P Hotel & lt; 0,05,
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P Hotel & lt; 0,005 frente al control del vehículo en cada momento.
Para validar el efecto inhibidor de escoparona en la actividad transcripcional de STAT3, hemos realizado ensayos de transfección transitoria utilizando células DU145 que expresan STAT3 constitutivamente activo y las células PC-3 que carece de STAT3 [35]. Escoparona inhibió significativamente la constitutiva y la IL-6-mejorada actividad transcripcional de STAT3 en células DU145 (Figura 2B, izquierda). En las células de STAT3-negativas PC-3, como se esperaba, la actividad luciferasa basal fue extremadamente baja; Además, el tratamiento de IL-6 no aumentó la actividad del gen reportero, que no se ve afectada por escoparona (Figura 2B, derecha). Sin embargo, la sobreexpresión de tipo salvaje STAT3 llevó a aumento de la actividad luciferasa en respuesta a IL-6 estimulación de células PC-3. tratamiento escoparona reduce considerablemente la actividad STAT3 estimulada por IL-6. Estos resultados sugieren que escoparona inhibe tanto la actividad transcripcional constitutiva y estimulada por IL-6 de STAT3.
Para investigar más a fondo si escoparona puede reprimir la transcripción de STAT3 objetivos de abajo, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para el análisis de STAT3 genes diana tales como la ciclina D
1, c-Myc, survivina, Bcl-2, y Socs3. Los análisis de QRT-PCR demostró que escoparona disminuyó los niveles de expresión de mRNA de los genes diana STAT3 (Figura 2C). De acuerdo con QRT-PCR resultados, sino que también disminuye significativamente los niveles de proteína de los genes (Figura 2D). Estos hallazgos demuestran que escoparona suprime de la transcripción de genes objetivo STAT3.
escoparona inhibe la fosforilación y la acumulación nuclear de STAT3 independientemente de JAK2 y Src
Para delinear los mecanismos moleculares subyacentes inhibición de la actividad STAT3 por escoparona, se evaluó su efecto sobre la fosforilación de STAT3 en células DU145. Escoparona redujo significativamente los niveles de fosforilación de STAT3 en Tyr705 (pSTAT3 Y705) y Ser727 (pSTAT3 S727) en las células DU145 2 h y 30 min después del tratamiento, respectivamente (Figura 3A). También disminuyó mejorada-IL-6 fosforilación de STAT3 (Figura 3B). Total de los niveles de proteína de STAT3 no se vieron afectados por el tratamiento escoparona (Figura 3A y B, y la figura S3). De acuerdo con estos hallazgos, la tinción de inmunofluorescencia de pSTAT3 Y705 mostró que las proteínas pSTAT3 se localizaron predominantemente en el núcleo de las células DU145 (Figura 3C). La señal de pSTAT3 nuclear se redujo notablemente en las células escoparona tratados. Estos resultados demuestran que escoparona inhibe la fosforilación constitutiva y estimulada por IL-6 y la acumulación nuclear de pSTAT3 en las células DU145.
A y B. escoparona inhibe tanto constitutiva (A) y la IL-6 mejorada-fosforilación (B) de STAT3 en Tyr705 y Ser727. células DU145 se trataron con vehículo o escoparona (A), o suero de hambre durante 24 h seguido de tratamiento escoparona (0,5 mmol /L) durante 4 h antes de la estimulación con IL-6 (B) durante los tiempos indicados. Las células se recogieron por Western Blot utilizando anticuerpos contra pSTAT3 (Y705), pSTAT3 (S727), y STAT3. Los niveles de proteína se cuantificaron por densitometría y se normalizaron contra los niveles correspondientes de β-actina. El nivel de expresión de cada proteína ISS expresa como una proporción con respecto al nivel en el control en tiempo de 0 h (definida como 1). Los datos representan las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes.
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P Hotel & lt; 0,0005 y
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P Hotel & lt; 0,005 frente a control en el tiempo 0;
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P Hotel & lt; 0,01
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P Hotel & lt; control del vehículo vs. 0,05 en cada punto de tiempo. C. escoparona reduce la acumulación nuclear de STAT3 fosforilado. células DU145 se trataron con escoparona durante 4 h y se procesaron para la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra pSTAT3 (Y705) o STAT3. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI, y se obtuvieron imágenes confocales y se fusionaron. La barra de escala indica 10 micras. D. escoparona no inhibió la fosforilación de JAK2 y Src, dos principales quinasas aguas arriba STAT3. células DU145 se trataron con escoparona durante los tiempos indicados, y después se recogieron para análisis de transferencia Western. intensidad de la señal se cuantificaron por análisis densitométrico y se normalizó contra las señales de beta-actina correspondientes. El nivel de expresión de cada proteína se expresa como una proporción con respecto al nivel en el control en tiempo de 0 h, que se definió como 1.
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& lt; 0,05 frente a control de vehículo en cada punto de tiempo.
Para determinar si el efecto inhibidor de escoparona en la fosforilación de STAT3 se debe a la supresión de los eventos de señalización aguas arriba, se evaluó el efecto de la escoparona en la fosforilación de JAK2 y Src, dos de los principales quinasas aguas arriba responsables de la activación de STAT3. Escoparona no redujo los niveles de proteína de JAK2 constitutivamente fosforilada (Figura 3D) y Src fosforilación no se redujo, sino más bien ligeramente elevada, por escoparona. Los niveles de proteína total y ARNm para JAK2 y Src no fueron alterados por el tratamiento escoparona (Figura 3D y Figura S4). En conjunto, estas observaciones sugieren que escoparona inhibe la fosforilación y la acumulación nuclear de STAT3 independientemente de las quinasas aguas arriba de JAK2 o Src.
escoparona pueden inhibir la actividad transcripcional de STAT3 por la unión directa al dominio SH2 de STAT3
Para confirmar aún si escoparona podría regular la actividad STAT3 independientemente de la señalización aguas arriba, las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con STAT3C, un mutante constitutivamente activa de STAT3 que imita la acción de STAT3 fosforilado por sustitución de dos residuos de cisteína dentro de su dominio SH2 y activa la transcripción de genes diana sin estímulos aguas arriba [20].