Extracto
Antecedentes
En el cáncer de pulmón, UPA, su receptor (uPAR ), y los inhibidores de PAI-1 y PAI-2 de la familia del activador del plasminógeno interactuar con MMP-2 y MMP-9 de la familia de MMP para promover la progresión del cáncer. Sin embargo, sigue sin determinarse cuál de estos marcadores juega el papel más importante y puede ser el indicador más útil para estratificar a los pacientes según el riesgo.
Métodos
Se determinó el valor pronóstico individual de éstos 6 marcadores mediante el análisis de una cohorte de derivación y de 98 no pequeñas de pacientes con cáncer de pulmón de células por tinción inmunohistoquímica. La correlación entre los niveles de IHC expresión de estos marcadores de la enfermedad y el pronóstico fue investigado, y un panel de inmunohistoquímica para la predicción pronóstica fue posteriormente genera a través de análisis del modelo de pronóstico. El valor del panel inmunohistoquímico fue luego verificada por una cohorte de validación con pacientes con cáncer de pulmón
91
Resultados
En cohorte de derivación, PAI-2 es el factor pronóstico más potente (HR = 2,30.;
P
= 0,001), seguido de MMP-9 (HR = 2,09;
P
= 0.019) de acuerdo con el análisis multivariante. Cuando la combinación de PAI-2 y MMP-9, el grupo de pronóstico más desfavorable (mayor de MMP-9 IHC bajos niveles de expresión de PAI-2 y) mostró un 6,40 veces mayor riesgo de mal pronóstico en comparación con el grupo de pronóstico más favorable (nivel elevado de PAI -2 y bajos niveles de expresión de MMP-9 IHC). panel de PAI-2 y MMP-9 IHC podría identificar con mayor precisión los pacientes de alto riesgo, tanto en la derivación y validación de cohortes.
Conclusiones
Hemos puesto de manifiesto PAI-2 como el más poderoso marcador pronóstico entre PA y familia de las proteasas MMP incluso después de considerar sus relaciones cercanas entre sí. Mediante la utilización de una combinación de PAI-2 y MMP-9, información pronóstica más precisa que la mera utilización de estadio patológico por sí solo puede ser obtenida para pacientes con cáncer de pulmón
Visto:. Su CY, Liu YP, Yang CJ, Lin YF , Chiou J, Chi LH, et al. (2015) inhibidor activador del plasminógeno-2 juega un papel pronóstico de liderazgo entre las familias de la proteasa en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (7): e0133411. doi: 10.1371 /journal.pone.0133411
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela de Medicina Pecs, Hungría
Recibido: 12 de febrero de 2015; Aceptado: June 26, 2015; Publicado: 31 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la causa más dominante de la muerte relacionada con el cáncer, a pesar de los avances en las estrategias de tratamiento [1]. gestión basada en la etapa se utiliza generalmente como la guía para decidir qué pacientes deben recibir la cirugía, la quimioterapia o la radioterapia, o terapia dirigida [2]. Sin embargo, diferente pronóstico no se ve muy poco, en los pacientes dentro de la misma etapa. Aunque se recomendaron factores de alto riesgo, tales como tumores poco diferenciados y vascular o afectación pleural para ser utilizados como indicadores adicionales para un tratamiento más agresivo, estos factores de riesgo por sí solas son todavía no es suficiente para estratificar a los pacientes, precisamente por el riesgo [3,4]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente más nuevos marcadores predictivos de pronóstico para guiar la toma de decisiones terapéuticas. Recientemente, los estudios que comparan y combinan los marcadores de las vías de regulación de cáncer, tales como las vías de control de la proliferación tumoral [5] y la transición epitelio-mesenquimal [6], con el objetivo de generar una mayor eficacia pronóstica para identificar pacientes de alto riesgo han recibido una atención creciente .
En el cáncer de pulmón, la alta incidencia de agresividad local y el comportamiento metastásico es una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer y puede conducir al fracaso del tratamiento [7]. matriz (ECM) la degradación extracelular es uno de los pasos más importantes que participan en la invasión local y metástasis a distancia [8]. El activador del plasminógeno (PA) y la familia de metaloproteinasas de matriz familiar (MMP) son dos familias de proteasas conocidas que desempeñan papeles esenciales en la degradación de ECM durante la progresión del cáncer [9,10], y sus miembros se han notificado a ser marcadores pronósticos de utilidad en cáncer de pulmón. Los altos niveles de expresión de activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA), su receptor (uPAR), y el activador del plasminógeno de tipo inhibidor de 1 (PAI-1) en la familia y la metaloproteinasa de matriz PA 2 (MMP-2) y metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP 9) en la familia de las MMP se han correlacionado con un mal pronóstico y desfavorables parámetros clínico [11-18]. Por el contrario, los pacientes con alta plasminógeno inhibidor del activador del tipo 2 (PAI-2) los niveles de expresión tienden a tener un pronóstico favorable [19-21]. Aunque en algunos tipos de cáncer, tales como endometriales y colorrectales cánceres, alta PAI-2 de expresión se asocia con un mal pronóstico [22,23], la alta expresión de PAI-2 también fue demostrado que se correlaciona con un mejor pronóstico en cáncer de mama y de ovario [24, 25].
Además de actuar solo, moléculas en las familias de PA y MMP también interactúan entre sí para modular aún más el proceso de degradación de la MEC de una manera complicada (S1 Fig). La plasmina, que se activa a partir de plasminógeno por la fijación de uPA a uPAR, puede degradar el ECM directa o indirectamente a través de la activación proteolítica de MMP-2 y MMP-9 [26]. Cuando cualquiera de PAI-1 o PAI-2 está presente, la capacidad de UPA para activar la plasmina es inhibida, y a su vez, la degradación de ECM también se inhibe. Sin embargo, también se ha informado de complejos uPA de PAI-1 para aumentar la MMP-2 y MMP-9 nivel de expresión a través de la vía de señalización corriente abajo [27], mientras que el 2 de uPA-PAI complejo se ha demostrado que facilita el aclaramiento de UPA sin activar señalización corriente abajo [28]. Además, MMP-9 puede mejorar la actividad de uPA mediante la regulación de la proteasa nexina-1 división [29]. Estos marcadores forman una compleja red que regula el equilibrio de la degradación de ECM en el microambiente tumoral.
Por lo tanto, la identificación de los marcadores más importantes dentro de la red de señalización para la toma pronóstico y terapéutico aumentará el valor clínico. En lugar de centrarse en un solo marcador, nuestro principal interés en este estudio fue evaluar y comparar el valor pronóstico de los marcadores en las familias PA y MMP y para evaluar sus efectos combinados. Después de la tinción inmunohistoquímica de clínica del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) especímenes para determinar los niveles de expresión de los componentes de esta red, se utilizó un enfoque de tres pasos para integrar los valores de pronóstico de uPA, uPAR, PAI-1, PAI 2, MMP-2 y MMP-9. En primer lugar, verificó la correlación entre estos marcadores 6 y luego llevó a cabo una evaluación de varios marcadores, con lo cual se identificaron PAI-2 como el marcador con el mayor valor pronóstico y como el segundo indicador pronóstico más potente de MMP-9. Por último, un panel práctica IHC compone de PAI-2 y MMP-9 se generó para una mejor utilidad pronóstica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética y pacientes
El estudio se llevado a cabo con la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional y con el permiso de los comités de ética de la institución involucrada (KMUH-IRB-20110286), Junta Institucional del hospital Memorial Kaohsiung Médico de la Universidad Chung-Ho revisión. No se requirió consentimiento informado debido a que los datos fueron analizados de forma anónima. tratamientos "Ningún paciente se modificaron con el propósito de este estudio.
Un total de 98 pacientes con CPNM, incluyendo 61 casos de adenocarcinoma, 31 casos de carcinoma de células escamosas, y 6 casos de carcinoma de células grandes, de Kaohsiung Médico hospital universitario de Taiwán 1991-2007 se inscribieron como derivación de cohorte (Tabla S1). Todos los pacientes recibieron los protocolos de tratamiento estándar de acuerdo con las normas del hospital. Los pacientes con estadio I-III operable CPNM fueron sometidos a lobectomía o neumonectomía con linfadenectomía mediastínica. Los pacientes con resecable en estadio II y III NSCLC fueron tratados con adyuvante postoperatoria quimioterapia basada en platino. Los pacientes con nonresectable localmente avanzado o enfermedad metastásica recibieron quimioterapia con o sin radioterapia. núcleos de 1 mm de diámetro representativas de cada tumor con características morfológicas que eran típicos del diagnóstico se obtuvieron a partir de tejido embebido en parafina fijado con formalina para generar un microarray de tejido (TMA). La supervivencia global (SG) y la supervivencia (DFS) libre de enfermedad se definieron como los intervalos de tiempo de tratamiento inicial hasta la muerte o hasta la recurrencia, metástasis, o la muerte, respectivamente. Todos los casos se organizaron de acuerdo a la American Joint Committee on Cancer Staging Manual, y los tipos histológicos de cáncer se clasificaron según los criterios de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud. Otro cáncer no microcítico de pulmón de células TMA con 91 casos se adquirió de SuperBioChips (CC5 y CCA4, SuperBioChips laboratorios, Seúl, Corea) como la cohorte de validación (S1 Tabla).
inmunohistoquímica (IHC) tinción e interpretación
tinción IHC para uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2, MMP-2 y MMP-9 se realizó en secciones de tejido de 5 micrómetros de espesor de serie cortados de la micromatriz de tejido (TMA). Antes de la tinción en el TMA de derivación y la cohorte de validación, se probó y se valoró el anticuerpo primario en una prueba TMA-6 que contiene el tejido pulmonar normal y el tejido 6 NSCLC. Una condición de tinción que podemos discriminar la intensidad de la tinción entre los casos se consideró como una condición de tinción apropiada. Después de determinar la condición de tinción para todos los marcadores, IHC tinción se realizó utilizando un sistema automatizado immunostainer (tinción automática Ventana Descubrimiento XT, Ventana, EE.UU.) para uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2 y MMP-9. Los portaobjetos se tiñeron con un anti-PAI-1 anticuerpo policlonal de conejo (sc-8979, 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), una contra-PAI-2 anticuerpo policlonal de conejo (16035-1-AP, 1 : 50; Proteintech, Chicago, EE.UU.), un anticuerpo anti-uPA de conejo policlonal (sc-14019, un y cincuenta; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), un anticuerpo anti-uPAR policlonal de conejo (GTX100466, 1: 750; GeneTex, Taipei, Taiwán), y un anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP-9 (# 2270, 01:50; Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.). Manual de tinción IHC se realizó para la MMP-2. Brevemente, los portaobjetos se someten a calor inducida por la recuperación de antígeno durante 10 minutos con tampón de recuperación de antígeno DAKO (pH 6) y se incubaron a 4 ° C durante la noche con un contra MMP-2-anticuerpo policlonal de conejo (10373-2-AP, 1: 50; Proteintech, Chicago, EE.UU.) y luego se visualizaron usando un kit de sustrato de peroxidasa 3, 3'-diaminobencidina (DAB) (vector Laboratories, USA). El control negativo se realizó mediante la sustitución del anticuerpo primario por un anticuerpo policlonal de conejo de control de isotipo IgG (ab27478, 1: 100; Abcam, Cambridge, UK). (S2 Fig)
tinción IHC se analizó de forma independiente por 2 patólogos (Chia -Yi Su y Michael Hsiao) que fueron cegados a los resultados del paciente. Hemos adaptado los métodos de puntuación de IHC de estudios previos para establecer un uniforme criterios de puntuación de IHC para los 6 marcadores. Al igual que el sistema de puntuación utilizado por investigaciones anteriores se centraron en la familia PA [20] y MMP-2 y MMP-9 [17], tanto la intensidad de la tinción citoplásmica y el porcentaje (0-100%) de las células tumorales teñidas se registraron en este estudio . La intensidad de la tinción se puntuó en una escala de cuatro niveles: 0, negativo; 1+, débil; 2+, moderada; 3+, fuerte. Alto nivel de expresión IHC se definió como una intensidad de la tinción de 2+ o 3+ en más de 25% de las células tumorales, y los otros casos se consideraron como tener bajos niveles de expresión IHC (S3) Fig.
Estadística El análisis
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 17.0 (SPSS, EE.UU.). Las correlaciones para IHC nivel de expresión de los 6 marcadores fueron evaluados mediante análisis de correlación de Spearman. Las tasas de supervivencia se estimaron mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y univariante y multivariante de regresión de Cox análisis. Para el análisis de comparaciones múltiples, Benjamini y Hochberg falso descubrimiento (FDR) -Corregido
P se utilizó
valor y un FDR corregida
P
valor ≤ 0,05 fue considerado significativo [30] . Para el análisis del modelo de pronóstico, un modelo más complejo fue generado mediante la adición de cada marcador secuencialmente en el anterior modelo de pronóstico para determinar si el marcador añadido mejoró significativamente la predicción de pronóstico. La diferencia entre los modelos también se comparó por el área bajo la curva (AUC) de ROC (receptor operativa característica) curva, sensibilidad y especificidad. Para todos los análisis, un
P
valor. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Verificación de la correlación entre IHC niveles de expresión de uPA, uPAR, PAI 1, PAI-2, MMP-2 y MMP-9 en el CPNM
en primer lugar, con el fin de verificar si existen correlaciones significativas entre el estado de IHC expresión de uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2 , MMP-2 y MMP-9, el análisis de correlación de Spearman se llevó a cabo en nuestra cohorte de derivación. Los resultados identificaron correlaciones significativas (
P
& lt; 0,01) entre los niveles de expresión de PAI-1 y uPA y uPAR IHC (ρ = 0.616 y 0.431, respectivamente), entre los niveles de expresión de uPA y uPAR IHC (ρ = 0,571) , entre los niveles de expresión uPAR IHC (ρ = 0,354 y 0,322, respectivamente) MMP-9 y uPA y, y entre MMP-2 y UPA IHC los niveles de expresión (ρ = 0,261). Se observó una correlación inversa significativa entre IHC niveles de expresión de PAI-2 y UPA (ρ = -0,246;
P = 0,015
), y el nivel de expresión de PAI-2 IHC también tendió a ser correlacionado negativamente con los niveles de expresión de IHC de otros marcadores (Tabla 1). Las imágenes IHC mostrados en la figura 1A representan secciones seriadas de un adenocarcinoma de pulmón con baja intensidad PAI-2 tinción y alta intensidad de tinción de todos los 5 de los otros marcadores.
(A) Un adenocarcinoma de pulmón representante con bajo nivel de expresión IHC de altos niveles de expresión de IHC de PAI-1, uPA, uPAR, MMP-2 PAI-2 y, y MMP-9, detectada por IHC. Se tomaron fotografías con una ampliación de 400 aumentos. Las barras de escala representan 100 micras. parcelas (B) de Kaplan-Meier de supervivencia global con respecto a los niveles de expresión de MMP-9 IHC PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2, y en el CPNM. Bajo nivel de expresión IHC de PAI-2 se asoció significativamente con la supervivencia global más corto (
P Hotel & lt; 0,001), al igual que los altos niveles de expresión de IHC PAI-1, UPA, MMP-2 y MMP-9 (
P = 0,015
,
P = 0,031
,
P = 0,041
,
P = 0,037
, respectivamente). (C) de Kaplan-Meier parcelas de supervivencia libre de enfermedad en relación a PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2, y los niveles de expresión de MMP-9 IHC en NSCLC. Bajo nivel de expresión IHC de PAI-2 se asoció significativamente con la supervivencia libre de enfermedad (
P Hotel & lt; 0,001); IHC altos niveles de expresión de PAI-1, UPA, y MMP-9 también se asoció significativamente con la supervivencia libre de enfermedad (
P = 0,019
,
P = 0,017
,
P
= 0,021, respectivamente).
Determinación de la mayor importancia pronóstica de PAI-2 y MMP-9 entre los marcadores de la familia PA y MMP
Para determinar el poder pronóstico individuo 6 de estos marcadores, primero se evaluó la asociación entre sus IHC niveles de expresión y los resultados del paciente mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en la cohorte de derivación. bajo nivel de expresión de PAI-2 IHC se correlacionó significativamente con un mal pronóstico (
P Hotel & lt; 0,001 para la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS)) (Figura 1B y 1C). Alto nivel de expresión IHC de PAI-1, UPA, y MMP-9 también se correlaciona con un mal pronóstico. Alto nivel de MMP-2 expresión IHC se asoció con un sistema operativo desfavorable pero no se asoció con DFS. El nivel de expresión de uPAR IHC no se correlacionó con la SG o la SLE. Además, a través del análisis clínico-patológico, una correlación significativa entre el bajo nivel de expresión IHC PAI-2 y superior etapa patológica (
P = 0,027
) se encontró (Tabla S1 y S4 figura). Por el contrario, altos niveles de expresión de otros marcadores IHC tendían a tener una correlación con el mayor estadio patológico. Las correlaciones entre cada marcador y otras características clinicopatológicas se resumen en la Tabla S1.
Debido a la correlación significativa entre cada marcador en el análisis de correlación, se realizó un análisis multivariado para determinar sus respectivas funciones de pronóstico (tabla 2). Para DFS, bajo PAI-2 IHC nivel de expresión (hazard ratio [HR] = 2,30; 95% intervalo de confianza [IC] = 1,40 a 3,79;
P
= 0,001), alto nivel de expresión de MMP-9 IHC ( HR = 2,09; IC del 95% = 1,13-3,88;
P = 0,019
), y una etapa superior patológica (HR = 3,44; IC del 95% = 2,03-5,84;
P Hotel & lt; 0,001) permanecieron correlacionadas de forma independiente con un pronóstico desfavorable. Con respecto al sistema operativo, sólo el nivel de expresión de PAI-2 IHC (HR = 2,52; IC del 95% = 1,50-4,22;
P Hotel & lt; 0,001) y el estadio patológico (HR = 4,14; IC del 95% = 2.39- 7,16;
P Hotel & lt; 0,001) conservado una influencia significativa. Después de falso descubrimiento tasa de corrección de múltiples ensayos, PAI-2 (
P
= 0,01) y MMP-9 (
P
= 0,05) todavía tenían importancia pronóstica en la SSE. Estos resultados indicaron que el PAI-2 tiene el valor pronóstico de liderazgo y MMP-9 es el segundo marcador pronóstico más significativo entre los múltiples marcadores en las familias PA y MMP.
Establecimiento de un panel de IHC que comprende PAI-2 y MMP-9 para la predicción pronóstica más precisa en pacientes con CPNM
a partir de los resultados que el PAI-2 tuvo el mayor valor pronóstico y que la MMP-9 fue el segundo marcador pronóstico más potente en el análisis multivariante, un pronóstico análisis de modelos, análisis de supervivencia, y la curva ROC para el ensayo de la zona bajo la curva (AUC), la sensibilidad y la especificidad se realizaron para examinar la conveniencia de combinar PAI-2 y MMP-9 como un panel IHC. En el análisis del modelo de pronóstico (S3 Tabla), la adición de PAI-2 y MMP-9 a la variable de estadio patológico resultó en la capacidad de predicción más alta para DFS, sin embargo, la adición de más marcadores no mejoraron aún más el poder predictivo. A través de la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel de IHC, los pacientes podían separarse en tres grupos. Los pacientes con alto bajos MMP-9 niveles de expresión de PAI-2 y tenía el pronóstico más favorable, y los pacientes con altos niveles de MMP-9 baja expresión de PAI-2 y tenía el pronóstico más desfavorable (
P Hotel & lt; 0,001 para tanto SG y SLE) (figura 2A). En la curva ROC, aumento del área bajo la curva (AUC) fue visto en la supervivencia libre de enfermedad después de la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel (figura 2A y en la Tabla S4). El mapa de calor muestra los niveles de expresión de IHC PAI-2 y MMP-9 en pacientes individuales agrupados por estado de supervivencia de punto final (Figura 2A). Los pacientes que estaban muertos en el punto final tienden a tener altos niveles de MMP-9 expresión IHC baja PAI-2 y. Además, también se investigó el efecto acumulativo de pronóstico de PAI-2 y MMP-9. En comparación con el grupo de pronóstico más favorable (altas-bajas de MMP-9 IHC los niveles de expresión de PAI-2 y), el grupo de pronóstico más desfavorable (mayor de MMP-9 IHC bajos niveles de expresión de PAI-2 y) mostraron un 6,40 veces (IC 95% = 2,64 a 15,52;
P Hotel & lt; 0,001) mayor riesgo de un mal pronóstico después del ajuste para el estadio patológico (Tabla 3). Fig 2B muestran ejemplos representativos de la utilización del panel de PAI-2 y MMP-9 IHC en muestras de NSCLC. El paciente 1, que tenía que adenocarcinoma escenario con alta bajas MMP-9 IHC los niveles de expresión de PAI-2 y, estaba vivo al final del seguimiento. Por el contrario, el paciente 2 tenía un adenocarcinoma en estadio IV con altos niveles de MMP-9 expresión IHC baja PAI-2 y 2 y murió meses después del tratamiento se inició. Paciente 3 y 4 pacientes fueron diagnosticados tanto con adenocarcinoma fase III. Paciente 3 tenido altas-bajas de MMP-9 niveles de expresión IHC PAI-2 y y estaba vivo y no tenían recurrencia del tumor en el final del seguimiento. Por el contrario, los pacientes 4, que tenía altas MMP-9 IHC bajos niveles de expresión de PAI-2 y, recurrencia del tumor con experiencia en los 9 meses y murió 14 meses después del tratamiento iniciado.
Kaplan-Meier parcelas (A) y la República de China curva de supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad para la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel IHC. Los pacientes con alto bajos MMP-9 IHC los niveles de expresión de PAI-2 y tenía el pronóstico más favorable, mientras que los pacientes con altos MMP-9 IHC bajos niveles de expresión de PAI-2 y tenían el pronóstico más desfavorable (
P Hotel & lt; 0,001 para ambos OS y DFS). Se observó un aumento del área bajo la curva (AUC) de la República de China después de la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel en la supervivencia libre de enfermedad. En el mapa de calor agrupados por estado de supervivencia de punto final, los pacientes que estaban muertos en el punto final tienden a tener bajos de PAI-2 y MMP-9 de alto nivel de expresión IHC. (B) Imágenes representativas de la utilización del PAI-2 y MMP-9 panel de IHC en muestras de NSCLC clínicas. 1 paciente tenía un adenocarcinoma en estadio I con alta bajas MMP-9 niveles de expresión IHC PAI-2 y y estaba vivo al final del seguimiento. Por el contrario, el paciente 2 tenía un adenocarcinoma en estadio IV con altos niveles de MMP-9 expresión IHC baja PAI-2 y 2 y murió meses después del tratamiento se inició. Los pacientes 3 y 4 fueron ambos diagnosticados con adenocarcinoma fase III. Paciente 3, que tenía altas-bajas de MMP-9 IHC los niveles de expresión de PAI-2 y, estaba vivo y no tenía ninguna recurrencia tumoral en el seguimiento final; 4 pacientes, que tenían altos de MMP-9 IHC bajos niveles de expresión de PAI-2 y, recurrencia del tumor con experiencia en los 9 meses y murió 14 meses después del tratamiento se inició. Se tomaron fotografías con una ampliación de 400 aumentos. Las barras de escala representan 100 micras. (C) Las representaciones de Kaplan-Meier y curva ROC de la supervivencia global en el grupo de validación mostraron que los pacientes con bajo nivel de expresión de PAI-2 IHC (
P
= 0,002) o alto nivel de expresión de MMP-9 IHC (
P = 0,035
) tuvieron una supervivencia general pobres. Cuando se estratificó por PAI-2 y MMP-9 Panel de IHC, los pacientes del grupo de alto riesgo tenían los pacientes del grupo bajo riesgo bajo altos niveles de expresión de MMP-9 IHC PAI-2 y y tenía alta PAI-2 y de bajo nivel de expresión de MMP-9 IHC (
P Hotel & lt; 0,001). Se observó un aumento de área bajo la curva (AUC) de ROC después de combinar PAI-2 y MMP-9 como un panel. El mapa de calor mostró que los pacientes que estaban muertos en el punto final tienden a tener bajos de PAI-2 y alto nivel de expresión de MMP-9 IHC.
Confirmación del valor pronóstico de la IHC panel que comprende PAI-2 y MMP-9 en una cohorte de validación
Para validar el poder pronóstico del panel IHC que comprende PAI-2 y MMP-9 descubiertos en nuestra cohorte de derivación, se realizó un análisis aún más la supervivencia y la República de China análisis de la curva en una cohorte de validación con 91 pacientes con CPNM. En el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, los pacientes con bajo nivel de PAI-2 IHC expresión tenido un mal pronóstico, y los pacientes con un alto nivel de MMP-9 expresión IHC tenido un mal pronóstico (Figura 2C). Cuando la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel de IHC, los pacientes con alta bajos niveles de expresión de MMP-9 IHC PAI-2 y tenía el mejor pronóstico y pacientes con altos MMP-9 IHC los niveles de expresión bajo PAI-2 y tenía la peor resultado (
P
= 0,001). Aumento de la superficie bajo la curva (AUC) de ROC también se observó después de la combinación de PAI-2 y MMP-9 como un panel (Fig 2C y en la Tabla S4). Como se muestra en el mapa de calor (Figura 2C), los pacientes que estaban muertos en el punto final tienden a tener altos niveles de MMP-9 expresión IHC baja PAI-2 y. Por lo tanto, el PAI-2 y MMP-9 IHC panel de marcadores que hemos identificado a partir de las familias PA y MMP podría ser utilizado para estratificar a los pacientes con cáncer de pulmón en un riesgo y seleccionar pacientes para un tratamiento más agresivo.
Discusión
para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para integrar las familias PA y MMP mediante el análisis de IHC en el cáncer de pulmón. Ofrecemos una visión novedosa que el PAI-2 es el más potente indicador de pronóstico entre los marcadores en las familias PA y MMP y, más importante, PAI-2 se mantuvo su papel pronóstico que lleva incluso después de tomar su estrecha relación con otros marcadores de la familia PA y MMP en consideración . La investigación sobre ambas familias PA y MMP reveló que son un modelo apropiado para examinar valor pronóstico de evaluación multi-marcador (cuadro S5) [26-29]. Con respecto al nivel de la vía de señalización interconectado, un reciente estudio proporciona información sobre las respectivas contribuciones de cada miembro de la familia PA en las vías respiratorias células epiteliales [31]. Unida a la membrana uPAR (muPAR) se ha considerado la molécula clave, ya que es el único miembro de la familia PA demostrado que acelera la migración de células
in vitro
. En comparación, nuestros datos IHC demostraron que no había correlación entre el nivel de expresión de uPAR IHC y el pronóstico del paciente. Esta discrepancia puede ser el resultado de varios factores. En primer lugar, la limitación del estudio anterior era que la sobreexpresión de cada marcador puede no imitar con precisión la red de señalización coordinada
in vivo
[31]. Aunque nuestros datos pueden no ser capaces de demostrar la relación causa y efecto entre estos marcadores, que reflejan directamente el papel pronóstico de cada marcador en pacientes clínicos en los que se coexpresan estos marcadores e interactúan entre sí. Por otra parte, la expresión de ECM enzimas relacionadas con la degradación, tales como las familias de PA y MMP, también puede estar regulada por las células estromales asociadas a tumores [32]. El uso de un microarray tisular (TMA), hemos demostrado el valor predictivo de estos marcadores teniendo en cuenta tanto las células tumorales y su microambiente. La detección de marcadores de la familia PA de nivel de extracción de tejido mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) fue también un método utilizado con frecuencia para analizar su papel en el cáncer de pulmón (Tabla S6) [33-37]. Aunque ELISA podría cuantificar con mayor precisión los niveles de expresión de estos marcadores, las muestras de tumores pueden no ser completamente compuestas de tejido tumoral debido a no ser capaz de ver la morfología del tejido. En contraste, el análisis IHC utilizado en este estudio pudo más evitar esta limitación directamente observar la expresión in situ. Esto puede explicar que la importancia pronóstica de los marcadores de la familia PA no se observó en el estudio anterior mediante ELISA [33], pero se ha visto en nuestro estudio mediante el análisis IHC. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una ilustración complementaria de las funciones de los miembros de la familia PA y MMP en el cáncer de pulmón.
Nuestros datos revelan que el PAI-2 juega un papel principal en el PAI-1, PAI-2, UPA, uPAR , MMP-2 y MMP-9. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en la función patofisiológica de PAI-2 en el cáncer. PAI-2 sobreexpresión se informó para reducir la metástasis en modelos de xenoinjertos y disminuir el nivel de UPA y la migración
in vitro
[38,39]. Recientemente se ha demostrado que la baja afinidad de unión de PAI-2 por los receptores endocítica facilita el aclaramiento de UPA sin evocar eventos de señalización corriente abajo, proporcionando una posible explicación para el papel inhibitorio de PAI-2 en la progresión del cáncer [28,40]. La función fisiológica de PAI-2 puede proporcionar más pistas sobre su papel en la progresión del cáncer. Como una proteína expresada en condiciones de estrés, tales como la inflamación y la infección [41], elevado nivel en plasma de PAI-2 se encontró en los pacientes con sepsis o leucemia, y el nivel de expresión se incrementó durante la enfermedad activa o la recaída y fue indetectable en remisión [42, 43]. En este estudio, también se analizó la concentración plasmática de PAI-2 en pacientes con cáncer de pulmón NSCLC mediante ELISA (Fig S5). El hallazgo mostró elevado nivel plasmático de PAI-2 en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con el control normal. Curiosamente, una investigación reciente reveló que PAI-2 que es capaz de inhibir el uPA mediada por la migración de células tumorales y la invasión es secretada por las células tumorales en sí en micropartículas, no por las células de acogida [44]. Tomados en conjunto, un mecanismo puede ser propuesto que la elevada PAI-2 nivel plasmático en pacientes con cáncer de pulmón refleja PAI-2 micropartículas positivos en la circulación segregada por las células cancerosas. Y una mayor investigación está claramente necesaria para determinar si el nivel de PAI-2 de plasma se podría utilizar como un sustituto de estado de la enfermedad en pacientes con cáncer de pulmón.
Aunque el papel funcional de PAI-2 sigue siendo de entenderse completamente, tomando ventaja de su función inhibitoria, PAI-2 se ha investigado como un vector de direccionamiento de uPA en radioinmunoterapia alfa específica para diversos tipos de cáncer [45]. En nuestro estudio, la evaluación del nivel de expresión de los miembros de la familia PA y MMP por IHC análisis demostró proporciona un método potencial para seleccionar a los pacientes con alto nivel de expresión de uPA y de bajo nivel de expresión de PAI-2, que se puede obtener un mayor beneficio de PAI-2- terapia dirigida. Además, el fracaso de los inhibidores de MMP de amplio espectro en los ensayos clínicos del tratamiento del cáncer ha llevado al desarrollo de inhibidores selectivos de MMP [46], e inhibidores que se dirigen a la MMP-9 se han indicado como posibles tratamientos para el cáncer [47]. En consecuencia, la utilidad clínica de PAI-2 y MMP-9 como marcadores de pronóstico identificados en nuestro estudio sugiere, además, su potencial para la aplicación terapéutica en NSCLC.
En conclusión, teniendo en cuenta los marcadores de familias de la proteasa PA y MMP que es crítica en la regulación de la progresión del tumor, nuestro estudio revela el mayor significado pronóstico de PAI-2 entre uPA, uPAR, PAI-1 y PAI-2 en la familia PA y MMP-2 y MMP-9 en la familia MMP. Al priorizar el poder pronóstico de cada marcador, hemos generado un panel compuesto por IHC PAI-2 y MMP-9, que ofrece mayor valor pronóstico que el estadio patológico o de un solo marcador solo. La integración de los valores de pronóstico de los marcadores de familias de la proteasa determinados en el presente estudio permitirá su aplicación en el ámbito clínico para predecir el resultado del paciente y determinar la dirección en el tratamiento del cáncer de pulmón.
Apoyo a la Información
Materiales y S1 métodos. ELISA.
Los niveles plasmáticos de PAI-2 y MMP-9 se detectaron mediante comercial de PAI-2 (LS-F5568, vida útil Biosciences, EE.UU.) y MMP-9 (ab100610, Abcam, Cambridge, Reino Unido) Kit ELISA. Las muestras de plasma de 36 pacientes con CPNM y 6 controles normales se obtuvieron de Kaohsiung Medical University Hospital de Taiwán
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133411.s001 gratis (DOCX)
S1 Fig. La familia de PA y la familia MMP interactúan entre sí y forman una red compleja que regula la degradación de ECM.
(A y B) Ambos PAI-1 y PAI-2 inhiben la capacidad proteolítica de uPA y a su vez inhibe la formación de plasmina , que puede degradar el ECM solo o mediante la activación de MMP-2 y MMP-9. Además, MMP-9 puede mejorar la actividad de uPA mediante la degradación de la proteasa nexina-1. (A) El complejo de uPA-PAI-1 puede aumentar aún más la expresión de MMP-2 y MMP-9 a través de la señalización aguas abajo. (B) Sin embargo, la UPA-PAI-2 complejo facilita la compensación de UPA sin aumentar la MMP-2 y MMP-9 expresión a través de la señalización aguas abajo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133411.s002 gratis (TIF )
S2 Fig.