Extracto
DNA topoisomerasa I (TOP1) los niveles de varios tumores humanos son superiores a las de los tejidos normales. inhibidores de TOP1 son ampliamente utilizados en el tratamiento de los cánceres de ovario resistentes a la terapia convencional. Sin embargo, los pacientes pueden desarrollar resistencia a los inhibidores de TOP1, lo que dificulta el éxito de la quimioterapia. En este estudio, se examinaron los mecanismos asociados con el desarrollo de resistencia camptotecina (CPT) en los cánceres de ovario y identificados Evodiamina (EVO), un producto natural con TOP1 inhibición de la actividad que supera la resistencia. Se analizaron las correlaciones entre los niveles de TOP1, la estadificación del cáncer y la supervivencia global (SG). Se evaluó el efecto de EVO en el cáncer de ovario resistente CPT
in vitro
y
in vivo
. TOP1 se asocia con un mal pronóstico en el cáncer de ovario (
p = 0,024
). EVO indujo la apoptosis que fue detectado mediante citometría de flujo y la terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado de ensayo (TUNEL). El tamaño del tumor disminuyó significativamente en el grupo de tratamiento EVO en comparación con el grupo control (
p
& lt; 0,01) en un modelo de xenoinjerto de ratón. Efectos de las drogas dirigidas a TOP1 para el pronóstico y la terapia en el cáncer de ovario resistente CPT se anticipan. EVO con TOP1 puede ser desarrollado como un agente antiproliferativo para superar la resistencia CPT en los cánceres de ovario
Visto:. Lee Y-C, Lee C-H, Tsai H-P, un H-W, Lee C-M, Wu J-C, et al. (2015) Orientación de la topoisomerasa I para el pronóstico y la terapéutica del cáncer de ovario resistente a la camptotecina. PLoS ONE 10 (7): e0132579. doi: 10.1371 /journal.pone.0132579
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos |
Recibido: 21 Enero, 2015; Aceptado: 17 Junio 2015; Publicado: 24 Julio 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC101-2320-B-038-023), el Ministerio de Salud & amp; Bienestar (MOHW104-TDU-B-212-113001), y Taipei Hospital de la Universidad Médica-Shuang Ho (101TMU-SHH-10)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario no presenta signos o síntomas específicos y por lo general se diagnostica en una etapa avanzada, por lo que es el cáncer ginecológico más letal en el mundo occidental [1]. La quimioterapia estándar para el cáncer de ovario se acompaña con frecuencia de la quimio-resistencia, lo cual es un obstáculo importante para el tratamiento exitoso del cáncer [2] y una opción de quimioterapia de segunda línea debe ser recomendada. Se propusieron mutaciones estocásticos causados por la presión de selección, los cambios genéticos secuenciales inducidos por estroma especializado, y stemness de las células cancerosas para explicar la supervivencia de las células quimiorresistentes durante la quimioterapia [3]. La identificación de biomarcadores moleculares para predecir la sensibilidad a los fármacos y la resistencia es crucial para el pronóstico del paciente.
son reportados El número TOP1 copia de genes, ARNm, el nivel de proteína, y la actividad enzimática que se asocia con un mal pronóstico en la terapia del cáncer [4 ]. Establecer el papel de la expresión de TOP1 en cáncer de ovario puede facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces. vía Notch y ADN topoisomerasa I inhibidores (TOP1) han sido ampliamente utilizados en los cánceres de ovario resistentes al cisplatino [5]. Sin embargo, los pacientes pueden desarrollar resistencia a los inhibidores TOP1, lo que dificulta el éxito de la terapia [6]. El uso de la terapia de combinación con la quimioterapia de un solo agente conduce a mejores resultados en el cáncer [7] ovario. efectos secundarios inducidos por la quimioterapia se alivian después de usar productos naturales tales como polyphyllin D [8], emodina [9] o Rosa Roxburghii Tratt [10] mientras que se observan determinadas funciones inmunomoduladoras y antitumorales [11].
La activación de 5 proteína activada por AMP 'quinasa (AMPK) y la posterior supresión de la actividad mTOR pueden inducir la autofagia protectora que confiere quimiorresistencia a las células tumorales [12]. Por lo tanto, la inhibición de la autofagia AMPK-asociado puede aumentar los efectos antitumorales ejercidas por agentes quimioterapéuticos [4,13]. La camptotecina inhibidor TOP1 (CPT) puede inducir la autofagia y reducir la apoptosis a través de la vía de AMPK-TSC2-mTOR en el cáncer colorrectal humano [14]. Además, topotecan se informó de inducir la autofagia en las células citoprotector p53 de tipo salvaje, pero no en p53 o p53 knockout células mutantes [15]. células de cáncer de ovario A2780 humanas han sido analizados por las mutaciones de p53 y clasificadas en una línea de p53 de células de tipo salvaje [16]; Por lo tanto, se espera que esta línea celular para desarrollar fácilmente a través de la quimio-resistencia autofagia mediada por la AMPK. Este mecanismo de acción de la línea celular A2780 humano proporciona una estrategia potencial para detectar inhibidores de TOP1 con actividad de activación de la autofagia bajo protectora para el tratamiento de los cánceres con p53 de tipo salvaje.
Evodiamine (EVO), un alcaloide quinilone, originalmente aislado de
Evodia rutaecarpa gratis (Juss.), se informa que poseen muchas funciones fisiológicas, incluyendo la vasodilatación, antiobesidad, anticancerígena, antibacteriana, antiviral y efectos antiinflamatorios [17]. derivados EVO sintéticos se han desarrollado como agentes antitumorales potentes [18]. Este estudio caracteriza los mecanismos asociados a células de cáncer de ovario de CPT-resistente. El producto natural EVO muestra actividad inhibidora TOP1 que venció la resistencia de las células A2780 CPT ováricos. Nuestros resultados proporcionan conocimientos sobre el aumento de la sensibilidad a los medicamentos de las células de cáncer de ovario CPT-resistentes después de usar alcaloides relacionados con el EVO.
Materiales y Métodos
Materiales
(
S
) - (+) - CPT (C9911), Evodiamine (E3531), bicarbonato de sodio, dimetil sulfóxido (DMSO), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), propium yoduro (PI), y Hochest 33342 se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), la tripsina, suero bovino fetal (FBS), L-glutamina, y piruvato de sodio se adquirieron de Gibco-BRL (Grand Island, NY, EE.UU.). Un anticuerpo contra la ciclina D1 fue adquirido de Ventana (Tucson, AZ, EE.UU.). γ-H2A.X, la AMPK, fosfo-AMPK, acetil-CoA carboxilasa (ACC), fosfo-ACC, y deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) fueron adquiridos de Señalización Celular (Danvers, MA, EE.UU.). Ki-67 de conejo anticuerpo primario monoclonal fue adquirido forma DAKO (MIB-5, Dinamarca). Kit de Ensayo Cometa se obtuvo de Trevigen (Gaithersburg, MD, EE.UU.). Capa General de Medio (GLM) viruta de la capacidad se obtuvo de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.). Los vectores lentivirales (LVs), luciferasa (Luc) y vectores de la proteína fluorescente verde (GFP), y luciferina de escarabajo se obtuvieron de Promega (Madison, WI, EE.UU.). kit de detección iView universal DAB se obtuvo de Ventana (Tucson, AZ, EE.UU.). In Situ Cell Death Kit de detección, POD, se obtuvo de Roche Applied Science (Penzberg, Alemania) |
Ética
Sin perjuicio de Investigación Humana:. Los tejidos que usamos se obtuvieron de Taipei Medical University Hospital y Wan hospital de colmillo tras la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB-FMH-99049). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. Investigación de Animales: Los estudios se realizaron en ratones con las pautas y previa aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina de Taipei. Sin la aprobación del IACUC: ALC-99-0302. Los animales fueron sacrificados con isoflurano.
Los especímenes
piezas quirúrgicas incluidas en parafina fijadas con formalina fueron utilizados para la tinción inmunohistoquímica (IHC). Un diagnóstico histológico se realizó de acuerdo a la clasificación de la OMS. microarrays de tejidos consistieron en 180 carcinomas epiteliales de ovario de superficie: 61 carcinomas serosos, 35 carcinomas mucinosos, 42 carcinomas endometrioide, y 42 carcinomas de células claras. Para el presente estudio, 2 patólogos (Chi Long Chen y Chii-Hong Lee) examinaron las secciones histológicas y áreas seleccionadas de células tumorales representativas. Se utilizó un tejido básico (1,5 mm de diámetro) de cada ejemplar en plataformas de detección (Ventana Benchmark GX, Tucson, AZ, EE.UU.).
Cultivo de células
A2780 se cultivó en DMEM y CPT A2780 -resistant
células de cáncer de ovario R2000 [19] fueron cultivadas en RPMI 1640 que fueron contiene 10% de FBS, 4 mM L-glutamina, 4,5 g /L de glucosa, piruvato sódico 1 mM, y 1,5 g /L de bicarbonato de sodio a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
Western blot
Las muestras de proteína se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y en electrotransferred difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas, que se incubaron con un anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche, y después se incubó con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo de inmunoglobulina G secundario (IgG). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) reactivos de PerkinElmer [20].
viabilidad de las células de ensayo
Las células (10
4 células /pocillo) se cultivaron en un 96- así placa suplementado con medio de cultivo. Las células fueron tratadas o no tratadas durante 48 h, y una solución de MTT de stock (5 mg de MTT /ml de solución salina tamponada con fosfato [PBS]) se añadió a los cultivos en crecimiento durante 2 h. La absorbancia se midió usando un espectrofotómetro a 560 nm. Una solución en blanco que contiene sólo DMSO se consideró el control de lectura [21].
Citometría de flujo
Las células se trataron con compuestos de ensayo durante 0-24 h, después se trataron con tripsina, se sedimentaron, y se lavaron en PBS . Las muestras de células se analizaron mediante un flujo FACS Canto-II citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Anexina-V y yoduro de propidio (PI) doble tinción se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante [22].
análisis del ciclo celular
Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos y sincronizados los cultivos en un medio RPMI 1640 durante 24 horas para el análisis del ciclo celular. Las células se incubaron en 2 ml de RPMI1640 completo con 5 M EVO y 10 CPT mu M durante 48 h. Después del tratamiento, las células se recogieron con tripsina y se lavaron una vez con PBS. Antes de citometría de flujo, las células se incubaron con 10 mg /ml de RNasa A a 37 ° C durante 15 min. A continuación, las células se tiñeron con 5 mg /ml de Hochest 33342 y 20 mg /ml PI durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad [23]. Diez mil células por muestra fueron analizados utilizando un citómetro de flujo BD FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). El ciclo celular se analizó utilizando software MODFIT.
relajación de ADN de ensayo
El efecto inhibidor de EVO en superenrollado rotura de cadenas de ADN causada por TOP1 se evaluó. El ADN de plásmido (200 ng) se incubó a 37 ° C durante 30 min en 20 l de solución de reacción (40 mM Tris-acetato, NaCl 100 mM, MgCl 2,5 mM EDTA
2, y 0,1 mM; pH 7,5) en el presencia y ausencia de un inhibidor de 0-5 M; Se añadieron 0,5 unidades de enzima TOP1 para iniciar la reacción de 30 min [24]. inducida por TOP1 rotura de cadenas de ADN se indica por la conversión del ADN de doble hebra circular cerrado covalentemente superenrollado a una forma relajada.
ensayo cometa (electroforesis en gel de una sola célula)
Para determinar la grado de daño en el ADN de las células, los ensayos de cometas se realizaron según el protocolo del kit Trevigen CometAssay con ligeras modificaciones. Las células A2780
R2000 fueron tratados con inhibidores de TOP1 durante 1 h. La densidad final de células fue de aproximadamente 15.000 células /ml. La suspensión de células se mezcló entonces con agarosa de bajo punto de fusión a 37 ° C y posteriormente se transfiere a portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se sometieron a electroforesis a temperatura ambiente y después se tiñeron con SYBR Green I durante 5 min. En cada diapositiva, núcleos de las células se examinaron usando un microscopio de fluorescencia. momentos cola individuales se calcularon utilizando software de análisis de imágenes (Proyecto Comet Assay Software, http://www.casp.of.pl/). momentos de cola se calcularon según la siguiente fórmula: momento de la cola = ADN de la cola% (porcentaje de ADN en la cola) x longitud de la cola (longitud de la cola) [24]. La media ± error estándar (SE) se calculó a partir de al menos 50 células para cada grupo de tratamiento. El análisis estadístico se realizó utilizando
t
prueba.
Computacional acoplamiento molecular
La estructura cristalina de rayos X del complejo TOP1-ADN humano fue recuperado de Student no pareado de 2 colas de la Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) para los estudios de acoplamiento. Después de la adición de átomos de hidrógeno, la estructura compleja de proteínas de ADN resultante se utilizó en simulaciones de acoplamiento. software Chem3D 6,0 (CambridgeSoft, Cambridge, MA, EE.UU.) se utilizó para la construcción de la estructura 3D de EVO. Además, esta estructura se ha optimizado sobre la base de minimización de energía, utilizando el campo de fuerza MM2 y una raíz mínimo cuadrado medio (RMS) de gradiente de 0,05 Docking simulaciones se realizaron con el programa GOLD (Versión 3.1) en una estación de trabajo Silicon Graphics octano con dual 270 MHz procesadores MIPS R12000. El programa GOLD utiliza un algoritmo genético (GA) para realizar simulaciones de acoplamiento ligando-flexibles. Los parámetros de recocido para la unión de hidrógeno y de van der Waals se fijaron a 4,0 y 2,5 Å, respectivamente. La función de aptitud GoldScore se aplicó al eliminar el acoplamiento plantea mediante el uso de energía externa WT = 1.375 [24].
ensayo de analitos con una resonancia de plasmones superficiales (SPR) chip sensor
Humano (h) TOP1 se acopló a la superficie de dextrano de un chip de carboxylmethylated capacidad GLM de acuerdo con el protocolo descrito en la cinética One-Shot Kit Bio-Rad Proteon Manual de instrucciones con ligeras modificaciones. Soluciones de EVO y el ADN plásmido se prepararon en un tampón de reacción filtrada y desgasificada. Todos los experimentos de unión se realizaron a 25 ° C para un caudal constante de 100 l /min de tampón de reacción TOP1 (40 mM Tris-acetato de [pH 7,5], mM MgCl 2,5
2, NaCl 100 mM, y 1 mM EDTA). La afinidad de unión de las proteínas se evaluó usando las constantes de equilibrio de disociación (KD). KD se determinó sobre la base de un análisis apropiado de afinidad en estado estacionario mediante el uso de los resultados de Proteon Manager 2.0 (Bio-Rad) [24].
Producción de luciferasa (Luc) /proteína fluorescente verde (GFP) Las células A2780
R2000
in vivo
estudios, A2780
R2000 células fueron infectadas con LV que contienen Luc o GFP que fue impulsado por un promotor de citomegalovirus. Al ser implantadas en los ratones SCID, LUC- o A2780 GFP-etiquetados
R2000 células pueden ser monitorizados utilizando
in vivo
imágenes de bioluminiscencia, y las células GFP-positivas se pueden aislar usando un clasificador de flujo. Brevemente, las células A2780
R2000 se cultivaron en placas de 6 pocillos tal que alcanzaron el 20% -40% de confluencia. Se añadió una titulación específica de los medios de comunicación cosechadas a partir de células productoras de LV a las células cultivadas. Las placas fueron centrifugadas a 1200 ×
g
durante 1 h. Inmediatamente después de la centrifugación, se añadieron 2 ml del medio de células específicas a cada pocillo, y las placas se colocaron en una incubadora. Dos días después de la espinoculación, la expresión de GFP fue examinada bajo un microscopio de fluorescencia. células GFP-positivas fueron ordenados usando células nontransduced como control negativo [25].
Mouse modelos de tumores marcados
A2780
células R2000 (10
6) se mezclaron con 500 l de DMEM y por vía subcutánea en ratones SCID inoculados 4 semanas de edad. Después de 7 días, los ratones se les administró por vía intraperitoneal inyecciones (IP) EVO (100 mg /kg) (5 ratones por grupo). El tamaño del tumor se midió utilizando calibradores cada 3 días, y la bioluminiscencia de los tumores fue fotografiada usando un sistema no invasivo IVIS-200 óptica (Xenogen, Alameda, CA, EE.UU.) y el Programa de Vida de la imagen (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, ESTADOS UNIDOS). Los ratones se administraron por vía intraperitoneal 300 l de PBS que contiene 10 mg /ml de luciferina de escarabajo (Promega, Madison, WI, EE.UU.) antes de recibir la anestesia con isoflurano mediada. La intensidad de la bioluminiscencia cuantitativa (Qbi) se determinó como el flujo total de fotones por segundo [26]. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extirparon y se pesaron. Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las directrices y la aprobación previa del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina de Taipei. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con isoflurano mediada, y se hicieron esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Immunohistocytochemistry
Immunohistocytochemical y desoxinucleotidiltransferasa terminal de dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayos de células de cáncer de ovario, cosechado en la Semana 4, se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. tejidos fijados con formalina se incluyeron en parafina, cortado en secciones de 4 micras de espesor, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). tinción Immunohistocytochemical se realizó utilizando Ventana anticyclin D1 (SP4-R), anti-TOP1 (EPR5375), y el conejo Ki-67 anticuerpos primarios monoclonales en una tinción de portaobjetos ULTRA de referencia, y las muestras se analizaron usando un kit iView universal de detección de DAB (Ventana Medical Systems). tinción de TUNEL se realizó usando el kit de detección de muerte celular in situ, POD (Roche Applied Science), como se describe anteriormente [27,28]. núcleos positivos fueron contados en 500 células, y el número de TUNEL y la ciclina D1-positivos células por campo de alta potencia se contó en 5 campos de cada diapositiva codificada. La expresión se analizó usando el software GraphPad Prism (Versión 5.0; GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).
El análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (SD). Se utilizó la prueba de 2 colas, no paramétrico (prueba de Mann-Whitney) en comparación con la puntuación del tumor y la puntuación normal. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante parcelas log-rank de Kaplan-Meier (KM). Se utilizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox para evaluar la importancia pronóstica de los factores en los modelos univariantes y multivariantes. Un
p valor Red de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Para la comparación de los dos métodos de clasificación,
Se realizó análisis estadístico de los estudiantes t
prueba.
Resultados
La sobreexpresión de TOP1 está correlacionada con la etapa avanzada y un mal pronóstico en el ovario cáncer
determina si la expresión de TOP1 en cáncer de ovario se asoció con una baja supervivencia. Los tejidos de 156 pacientes con cáncer de ovario fueron examinadas usando tinción IHC. Los criterios de especificidad de anticuerpos y de puntuación se definieron y se calificó a los niveles 0-3 (figura 1A). Examinamos 30 conjuntos de diferentes muestras de neoplasia ovárica primaria y tejidos normales. TOP1 expresión fue significativamente mayor en tumores que en los tejidos normales, según se evaluó usando IHC (Fig 1B,
p
& lt; 0,001). A continuación se investigó la relación entre los niveles de expresión TOP1 y la supervivencia global (SG), definidos como pacientes con cáncer de ovario puede morir directamente de esta enfermedad o por otra causa. En general, 110 de 156 pacientes tenían altos niveles de expresión TOP1 (con puntuaciones de 2+ o 3+), y los restantes 46 pacientes tenían niveles bajos de expresión TOP1 (con puntuaciones de 0 o 1+). Por otra parte, los pacientes con altos niveles de expresión TOP1 tenían mala SG en comparación con los pacientes con bajos niveles de expresión TOP1. Se examinó la contribución de la expresión de ARNm TOP1 al sistema operativo de los pacientes con cáncer de ovario utilizando el plotter KM (http://kmplot.com/analysis/), que evaluó el efecto de 22,277 genes en la supervivencia de 1.464 pacientes con cáncer de ovario. Una base de datos de fondo se estableció utilizando los datos de expresión génica y la información sobre la supervivencia de los pacientes que 1436 ha sido descargado de la Expresión Génica Omnibus (GEO; Affymetrix HGU133A y HGU133 + 2 microarrays). El análisis reveló que la expresión OS alta TOP1 ARNm indica una baja supervivencia de los pacientes con cáncer de ovario (razón de riesgo (HR): 1,28,
p = 0,00062
) (Fig S1). Los resultados mostraron que la alta expresión TOP1 se asoció significativamente con un mal pronóstico (log-rank
p = 0,024
, la figura 1C). Por otra parte, χ
2 análisis entre los niveles TOP1 y las características clínico-patológicas de los pacientes mostró que la sobreexpresión TOP1 en cáncer de ovario se asoció con la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) etapa (
p Hotel & lt; 0,044; Tabla S1). En el análisis univariante, la alta expresión TOP1 (HR: 2,465; intervalo de confianza del 95% (IC): 1,139-5,335;
p = 0,022
; Tabla 1), el estadio tumoral (HR: 8,843; IC del 95%: 4,200 a 18,619;
p & lt; 0,0001
, Tabla 1) y la recurrencia tumoral (HR: 0,453; IC del 95%: 0,243-0,841;
p = 0,012
; Tabla 1) fueron significativamente correlacionada con la SG. Además, supervivencia libre de enfermedad (DFS), la longitud de tiempo después del tratamiento durante el cual se encontró ninguna enfermedad, también se asoció con la expresión TOP1 (HR: 1,939; IC del 95%: 1,018-3,695;
p = 0,044
), el estadio del cáncer (HR: 5,669; IC del 95%: 3,143 a 10,225;
p & lt; 0,0001
), quimioterapia (HR: 1,774; IC del 95%: 0,999-3,1