Extracto
Antecedentes
Para descubrir nuevos marcadores para la mejora de la eficacia del diagnóstico de cáncer de páncreas (PC) , fue perfilado secretoma de dos líneas celulares PC (BxPC-3 y MIA Paca-2). proteína de unión a UL16 2 (ULBP2), una de las proteínas identificadas en el secretoma de células PC, se seleccionó para la evaluación como un biomarcador para la detección de PC porque también se encontró que su nivel de mRNA ser significativamente elevados en los tejidos de PC.
métodos
ULBP2 expresión en los tejidos de PC de 67 pacientes fue estudiado mediante técnicas de inmunohistoquímica. los niveles séricos ULBP2 en 154 pacientes de PC y 142 controles sanos se midieron por inmunoensayo basado en perlas, y la eficacia de suero ULBP2 para la detección de PC se comparó con el antígeno ampliamente utilizado serológica marcador PC carbohidrato 19-9 (CA 19-9).
Resultados
análisis inmunohistoquímico reveló una elevada expresión de ULPB2 en los tejidos de PC en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes. Mientras tanto, los niveles séricos de ULBP2 entre todos los pacientes de PC (n = 154) y en pacientes con cáncer en fase inicial fueron significativamente más altos que los de los controles sanos (
p
& lt; 0,0001). La combinación de ULBP2 y CA 19-9 superó cada marcador sola en pacientes de PC distintivas de individuos sanos. Es importante destacar que un análisis del área bajo las curvas ROC mostró que ULBP2 fue superior a CA 19-9 en la discriminación de los pacientes con estadio temprano PC de controles sanos.
Conclusiones
En conjunto, nuestros resultados indican que ULBP2 puede representar un nuevo y suero biomarcador útil para el cribado primario del cáncer pancreático
Visto:. Chang YT, Wu CC, Shyr YM, Chen TC, Hwang TL, Yeh TS, et al. (2011) basado en la identificación de secretoma ULBP2 como un marcador de suero Novel para la detección del cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (5): e20029. doi: 10.1371 /journal.pone.0020029
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2011; Aceptado: April 10, 2011; Publicado: 20 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por las becas del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC 96-2320-B-182-031-MY3), Departamento de Salud (DOH-99-TD-C-111-006), y el Ministerio de Educación (EMRPD180241 y EMRPD180091). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) es la cuarta causa líder de muerte por cáncer en los Estados Unidos, con una supervivencia a 5 años inferior al 7% [1], [2]. En 2010, se estimó que más de 43.000 nuevos casos de PC para el desarrollo y se espera que 36.800 muertes en los Estados Unidos [1]. En Taiwán, se ocupó el décimo lugar entre las muertes relacionadas con el cáncer en 2008 y muestra una mayor tasa de mortalidad en la última década [3]. Debido a la temprana difusión de la PC y la aparición tardía de los síntomas aparentes, menos del 8% de los pacientes son diagnosticados de PC en la etapa localizado cuando una cura quirúrgica es posible [1], [4], [5]. En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias mejoradas para la detección precoz de la PC.
Los enfoques actuales para el diagnóstico de PC se basan principalmente en la formación de imágenes y métodos endoscópicos [6], que, debido a la ubicación retroperitoneal del páncreas , tienen una probabilidad limitada de diagnóstico precoz [7], [8]. Una elevación en los niveles séricos de antígeno de carbohidrato 19-9 (CA 19-9) ha sido ampliamente utilizado para la detección de PC; Sin embargo, este enfoque es insuficiente con respecto tanto a la especificidad y la sensibilidad [6], [9], [10]. Además de CA 19-9, más de 40 proteínas han sido reportados como potenciales biomarcadores serológicos para la detección de PC [11]. Desafortunadamente, la mayoría, o bien han especificidad y /o sensibilidad limitada, o esperar la validación con una cohorte a gran escala de especímenes [11] - [17], a pesar de evidencia de que el uso de un panel de biomarcadores combinatoria mejora la exactitud de diagnóstico PC [12] . Por lo tanto, el descubrimiento de la novela y los marcadores tumorales útiles podría facilitar la mejora del diagnóstico y /o pronóstico de PC.
Recientemente, los enfoques basados en secretoma han sido ampliamente utilizados en la identificación de potenciales biomarcadores de cáncer [18], [ ,,,0],19]. En el presente estudio, hemos analizado la secretoma de dos líneas celulares PC, BxPC-3 y MIA Paca-2 y evaluamos una de las proteínas identificadas, la proteína de unión a UL16 2 (ULBP2), como un potencial biomarcador PC. resultados de la tinción inmunohistoquímica confirmaron los niveles elevados de ULBP2 en los tejidos de PC en comparación con sus homólogos no cancerosos adyacentes. inmunoensayos basados en perlas validan aún más los niveles séricos elevados de ULBP2 en pacientes de PC frente a individuos sanos. Lo más importante, el uso combinado de ULBP2 con CA 19-9 mejoró la sensibilidad y la precisión de la detección temprana PC en este estudio de casos y controles, proporcionando un enfoque prometedor para el diagnóstico PC en una etapa temprana.
Materiales y Métodos
población de pacientes y muestras clínicas
muestras tumorales de pacientes 67 PC (edad media, 64 años; rango: 35-82) han sido recogidos en el Chang Gung Memorial hospital (CGMH), Lin-Kou, Taiwan. Las muestras de tejido se recogieron en la cirugía, evaluados por los patólogos, y se almacenan en el Banco de Tejidos CGMH hasta su uso. Las muestras de suero de 154 pacientes (edad media de PC, 70; rango, 31-87) se recogieron en Taipei el Hospital General de Veteranos de Taipei, Taiwán. muestras de sangre adicionales, incluyendo 142 muestras de suero de donantes sanos (edad media, 58; rango, 34-86), 25 muestras de plasma de donantes sanos (edad media, 54; rango, 29-79), 28 muestras de suero de carcinoma nasofaríngeo ( APN) pacientes (edad media, 46; rango, 31-80), 29 muestras de suero de pacientes con carcinoma colorrectal (CRC) de los pacientes (edad media, 61; rango, 30-83), y 30 muestras de plasma de cáncer gástrico (CG) de los pacientes (mediana de edad, 66; rango, 33-83), se recogieron en el CGMH, Lin-Kou, Taiwán. Las alícuotas de estas muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso. Esta investigación siguió los principios de la Declaración de Helsinki y todos los sujetos firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité Institucional del Hospital Chang Gung Memorial o Taipei el Hospital General de Veteranos, Taiwan antes de su participación en este estudio y para el uso de tejidos o muestras de sangre recogidas antes del tratamiento.
cultivo de células
Las líneas de células PC-3 BxPC, MIA Paca-2, PANC-1 y AsPC-1 fueron adquiridos de bio-Recogida y Centro de Investigación (Hsinchu, Taiwán) . BxPC-3 y AsPC-1 se mantuvieron en suero fetal bovino 10% (FBS, Biological Industries, Israel) -supplemented medio RPMI-1640 (Invitrogen, CA, EE.UU.). MIA PaCa-2 y PANC-1 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen) con 10% de FBS más suero de caballo 2,5% (Biological Industries) y 10% de FBS, respectivamente. Las cuatro líneas de células se cultivaron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 medio ambiente.
Generación de secretoma conjunto de datos de líneas celulares de cáncer de
Los métodos utilizados para la preparación de las células del cáncer medio condicionado (CM) y el perfilado secretoma fueron descritas anteriormente [20] y se detalla en Materiales y Métodos S1.
dominio público de búsqueda de base de datos de perfiles de expresión de genes diana seleccionados
los perfiles de expresión de la proteínas secretadas en los tejidos de PC se realizaron búsquedas en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Expresión génica Omnibus base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). El conjunto de datos GSE1542 fue seleccionado para la identificación de genes candidatos con los niveles de expresión elevados en células PC [21]. El conjunto de datos GSE1542 contiene los perfiles de expresión génica de células ductales pancreáticas aisladas de 24 pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático y 25 donantes con un páncreas normal [21]. Las intensidades medias de cada sonda de genes en grupos sanas y cancerosas se calcularon para obtener la relación de tumor /normal (N /T); genes con relaciones T /N ≥2 fueron considerados candidatos hasta reguladas. Entre ellos, los que tienen
p-valores
menos de 0,05 calculado por
t-test fueron seleccionados
aún más como los candidatos más prometedores para la expresión elevada en los tejidos cancerosos.
Western El análisis de transferencia
Las proteínas en los extractos de células y CM se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, MA, USA), y se sondearon con anticuerpos contra la transformación de crecimiento inducida por el factor de β proteína ig-h3 ( BIGH3) (1:1000 dilución; Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.), ULBP2 (1:1000 dilución; R & amp; D Systems, MN, EE.UU.) o α-tubulina (1:10000 dilución; Millipore). Las proteínas de interés se detectaron por incubación durante 1 hora con la peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (Santa Cruz Biotechnology), y se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia (PerkinElmer, MA, EE.UU.).
Inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó con anticuerpos contra BIGH3 (1:100 dilución, Santa Cruz Biotechnology) y ULBP2 (dilución 1:20; R & amp; D Systems). Los protocolos de tinción se describen en los materiales y métodos S1. La expresión de las proteínas diana se evaluó de acuerdo con el sistema simplificado puntuación H, que se basa en la intensidad de la tinción de células (3, fuerte; 2, moderado; 1, débil; 0, no tinción de células) y el porcentaje de tinción de células [3 , ≥90%; 2, 50-89%; 1, 10 a 49%; 0, 0-9%)]. Las dos puntuaciones se multiplicaron y luego dividir por 3 para obtener el resultado final. La tinción positiva se definió como una puntuación final ≥0.67 [22], [23]
Suero análisis
Suero BIGH3 y niveles de CA 19-9 se determinaron utilizando los kits ELISA de R & amp;. D sistemas y Alfa diagnóstico (TX, EE.UU.), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo. Para determinar la concentración sérica ULBP2, el inmunoensayo basado en perlas en el local ELISA sándwich y se establecieron en nuestro laboratorio (ver Materiales y Métodos S1 para más detalles).
El análisis estadístico
Las diferencias en la inmunohistoquímica puntajes y niveles séricos de proteínas diana entre grupos fueron evaluados usando la prueba de Wilcoxon o la prueba de Kruskal-Wallis. Las correlaciones entre los niveles séricos de proteínas diana se calcularon utilizando la correlación de Pearson, y se compararon las puntuaciones inmunohistoquímicas de pares de muestras de la misma materia, mediante emparejado
t-pruebas
. característica (ROC) curvas de operador receptor se construyeron mediante el trazado de la sensibilidad frente a 1-especificidad y las áreas bajo la curva ROC (AUC) fueron analizados utilizando el método Hanley y McNeil. Todas las pruebas fueron de dos caras, y un
p-valor
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los datos fueron procesados utilizando el software SPSS versión 13.0 (IL, EE.UU.).
Resultados
Análisis secretoma de dos líneas celulares de cáncer de páncreas
Para descubrir potenciales biomarcadores séricos de PC, las proteínas secretadas de las líneas celulares PC se analizaron de forma sistémica. La representación esquemática del diagrama de flujo utilizado se ilustra en la Fig. 1A. Las proteínas presentes en el 24 h CM libre de suero de PaCa-2 células BxPC-3 y Mia fueron separadas por SDS-PAGE, visualizado por Coomassie azul tinción (Fig. 1B, panel superior), cortado en 40 fracciones, digeridos individualmente con tripsina y se analizaron por C-18 de fase inversa de cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas (LC-MS /MS). El patrón de tinción de proteínas del lisado celular se muestra también en paralelo para demostrar que las proteínas secretadas se enriquecieron en el CM, y su patrón era bastante diferente de la generada por las proteínas intracelulares (Fig. 1B, panel superior). La distribución de la proteína citosólica, alfa-tubulina, se examinó como un control. Alfa-tubulina se detectó claramente en los extractos de células, pero no en la CM (Fig. 1B, panel inferior), lo que indica que las proteínas recuperadas de la CM no fue debido a la muerte celular.
(A), el estrategia consiste en secretoma cáncer y análisis tranacriptome tejido. (B), las proteínas (50 mg) en CM y extractos celulares (CE) de las células cancerosas se resolvieron por 10% SDS-PAGE y se tiñó con azul de Coomassie (panel superior) o análisis de inmunotransferencia se sometieron con alfa-tubulina (panel inferior ). (C), análisis por inmunotransferencia con anticuerpos anti-BIGH3 y ULBP2.
Después de buscar con el algoritmo de la mascota y el establecimiento de un punto de corte de 95,0% de probabilidad de péptidos y proteínas 95,0% de probabilidad en el software de andamios, 1011 y 1141 proteínas con múltiples (≥2) péptido hits fueron encontrados en el BxPC-3 y MIA Paca-2 cm, respectivamente (cuadros justificantes S1 y S2), dando lugar a proteínas no redundantes 1427 y 725 de solapamiento.
Generación de lista biomarcador candidato para la detección de PC
para reducir la lista de candidatos, los niveles de expresión de las proteínas comunes en 725 células ductal pancreático fueron examinados en un análisis basado en la serie publicada por Ishikawa et al. [21], en el que se comparó la expresión génica en células ductales pancreáticas derivadas de 24 pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático y 25 donantes con un páncreas normal (Fig. 1A). Este análisis reveló que 10 de las 725 proteínas fueron upregulated significativamente (≥2 veces sobre-expresión,
p
& lt; 0,05) en el carcinoma ductal de páncreas en comparación con las células ductales pancreáticas no tumorales (Tabla 1). Entre ellos, la ceruloplasmina se ha confirmado que se sobreexpresa en tejidos de PC [24], y el nivel sérico elevado de ERO1-como la proteína alfa se ha informado en pacientes de PC en comparación con controles sanos [17], lo que indica que el análisis combinado de la secretoma y el transcriptoma es una estrategia factible para el descubrimiento de nuevos marcadores candidato PC.
la sobreexpresión de ULBP2 y BIGH3 en los tejidos de PC
Nos centramos nuestra atención en ULBP2 y BIGH3 como marcadores potenciales de PC (Tabla 1) porque otro análisis basado en la matriz también había demostrado que sus niveles de mRNA fueron significativamente superiores en los tejidos de PC [25], y ni aún no se había estudiado en PC. Se confirmó la presencia de BIGH3 y ULBP2 en el CM recogido de cuatro líneas celulares PC (BxPC-3, MIA PACA-2, PANC-1 y AsPC-1) por análisis de transferencia Western (Fig. 1C). Otros análisis de inmunohistoquímica mostraron tinción positiva para BIGH3 y ULBP2 en 41,9% (13/31) y 100,0% (67/67), respectivamente, de secciones de tejido de PC. Inspección de cada sección de tejido que contiene tejidos ductales tanto no cancerosas y cancerosas reveló una mayor expresión de ambas proteínas en los tejidos cancerosos que en los homólogos no cancerosos en la mayor parte de las secciones de tejidos examinados (Figura 2A;. Apoyo figuras S1 y S2). Las puntuaciones de inmunohistoquímica de ambas proteínas en los tejidos tumorales fueron estadísticamente superiores a los de sus homólogos no cancerosos: 0,54 ± 0,46 frente a 0,14 ± 0,27 para BIGH3 (
p Hotel & lt; 0,0001) y 2,71 ± 0,49 frente a 1,89 ± 0,74 para ULBP2 (
p Hotel & lt; 0,0001) (figura 2B.). Otros análisis mostraron que los niveles de expresión en los tejidos tumorales no fueron estadísticamente asociados con la edad, sexo, grado histológico, estadio tumoral general, o tumor-nódulo-metástasis (TNM) de cáncer de páncreas (Defensa de los cuadros S3 y S4).
(a), la tinción inmunohistoquímica para BIGH3 (panel izquierdo) y ULBP2 (panel derecho) en pericancerous adyacentes no cancerosos (panel inferior) emparejado y los tejidos tumorales (panel superior). Barra de escala, 100 micras. Aumento original, × 400. (B), el análisis de Box-gráfico de las puntuaciones de tinción inmunohistoquímica en no canceroso (AN) y tumorales tejidos adyacentes apareados. El cuadro indica la 25
º y 75
º percentiles de la gama de datos; la línea media indica la mediana; la línea discontinua muestra la distribución media del 90%.
Los niveles séricos de BIGH3 y ULBP2 en pacientes con CP
Para evaluar el potencial de BIGH3 y ULBP2 como marcadores séricos de PC, examinamos su los niveles en suero de pacientes de PC (n = 154) y controles sanos (n = 142). Se midió niveles BIGH3 suero utilizando un kit comercial ELISA y los niveles de ULBP2 suero determina usando un inmunoensayo basado en perlas desarrollado en nuestro laboratorio que es capaz de detectar las típicamente muy bajos niveles de ULBP2 suero (& lt; 1 ng /ml) que no podría ser medido con precisión utilizando nuestro sándwich-ELISA en casa. Nuestra inmunoensayo basado en perlas podría detectar con precisión los niveles de ULBP2 en un rango de 4,3 pg /ml a 31,9 ng /mL (Figura Apoyo S3). Se encontró que los niveles séricos de ULBP2, pero no BIGH3, fueron significativamente elevados en pacientes de PC en comparación con los de los controles sanos: 1,87 ± 1,67 frente a 1,29 ± 0,49 g /ml para BIGH3 (
p
= 0,328; Fig 3A) y 200,2 ± 168,6 frente a 51,4 ± 64,6 pg /ml para la ULBP2 (
p
. & lt; 0,0001; Fig. 3B). El uso de un valor de corte de 60 pg /ml para ULBP2, se encontró que los valores de sensibilidad y especificidad para la detección de cáncer fueron 83,8% y 73,9%, respectivamente. Sérica y los niveles de BIGH3 ULBP2 no fueron estadísticamente correlacionados con la edad, sexo, grado histológico, estadio tumoral global, o la clasificación TNM de PC en este estudio de casos y controles (cuadro justificante S5). Estos hallazgos indican que ULBP2 podría ser un nuevo marcador de suero para la detección de PC.
Los niveles séricos de BIGH3 (A), ULBP2 (B), y CA 19-9 (C) se midieron en 154 pacientes con cáncer de páncreas (PC) y 142 controles sanos (CTRL). Los datos se presentan como diagramas de caja. (D), los análisis de curva ROC de la capacidad de BIGH3, ULBP2, CA 19-9, y el panel de marcadores que comprende de dos ULBP2 y CA 19-9 para discriminar pacientes con CP de los controles.
El eficacia de ULBP2 y CA 19-9 para el cribado PC
los niveles séricos de CA 19-9, un biomarcador PC suero utilizado en la actualidad, se ensayaron adicionalmente en las mismas muestras. Se encontró que los niveles séricos de CA 19-9 fueron mayores en los pacientes con CP que en los controles sanos (63,4 ± 24,4 frente a 28,3 ± 20,2 U /ml,
p Hotel & lt; 0,0001, la figura 3C.); como ULBP2, niveles de CA 19-9 no se correlacionaron con las características clínico-patológicas de apoyo (cuadro S5). Un análisis más detallado mostró que no había correlación entre las dos moléculas en la cohorte de pacientes (r = 0,061,
p = 0,453
de correlación de Pearson; Apoyando figura S4). A los 40 U /ml, el valor de corte se aplican actualmente para el cribado de la PC, los valores de sensibilidad y especificidad para CA 19-9 fueron 84,4% y 74,6%, respectivamente. En particular, la aplicación de un valor de corte de 60 pg /ml para ULBP2, hemos sido capaces de discriminar 21 de 24 pacientes con PC niveles de CA 19-9 & lt; 40 U /ml de individuos sanos. Además, 24 de 36 individuos sanos con niveles de CA 19-9 & gt; 40 U /ml podría estar más lejos se distingue de los pacientes sobre la base de los niveles ULBP2. & Lt; 60 pg /ml
La utilidad de ULBP2 y CA 19 -9 como marcadores de detección se ensayó adicionalmente mediante la aplicación de un análisis de la curva ROC. Este análisis demostró que ULBP2 (AUC = 0,862; 95% intervalo de confianza [IC], 0,821-0,904) se comportó ligeramente mejor que el CA 19-9 (AUC = 0,856; IC del 95%, 0,809-0,902) como marcador de selección (Fig. 3D). Lo más importante, un modelo de regresión logística [26] mostró que la capacidad de diagnóstico de la combinación de ULBP2 y CA 19-9 fue mayor que la de cualquiera marcador solo (AUC = 0,910, IC del 95%, 0,877-0,943; Fig. 3D) . En conjunto, estos resultados indican que ULBP2 podría ser un marcador sérico PC útil, especialmente cuando se usa junto con el CA 19-9.
La idoneidad de ULBP2 y CA 19-9 para PC detección temprana
a continuación, se evaluó la idoneidad de ULBP2 como un marcador de detección precoz de la PC por niveles ULBP2 suero pruebas en pacientes con tumores en fase inicial primarios (TNM-T1 /T2), no de los ganglios linfáticos metástasis (TNM-N0), y en el tumor global temprano etapas (etapa I-II). Se encontró que los niveles séricos ULBP2 fueron significativamente mayores en los pacientes con tumores primarios en fase inicial (205,7 ± 184,3 pg /ml,
p Hotel & lt; 0,0001, n = 34), sin afectación ganglionar (191,6 ± 155,2 pg /ml,
p
& lt; 0,0001, n = 57), y en una etapa temprana tumor general (181,2 ± 158,8 pg /ml,
p
& lt; 0,0001, n = 106) de en los controles sanos (51,4 ± 64,6 pg /ml; n = 142; Fig. 4A). El suero CA 19-9 también fueron elevados en las primeras etapas del tumor primario (56,3 ± 26,9 U /ml,
p Hotel & lt; 0,0001), metástasis de ganglios linfáticos (62,1 ± 25,5 U /ml,
p
& lt; 0,0001), y la etapa tumoral general (60,7 ± 24,4 U /ml,
p
& lt; 0,0001) en comparación con los controles sanos (28,3 ± 20,2 U /ml, n = 142,) ( la Fig. 4B). Los análisis de curva ROC mostró además que ULBP2 era más apropiado que CA 19-9 para discriminar los controles sanos de pacientes con PC diagnosticado como TNM-T1 /T2 (AUC = 0,854 [IC del 95%, 0,778 a 0,930] frente a AUC = 0,796 [95% CI, 0,690-0,901]), TNM-N0 (AUC = 0,866 [IC del 95%, desde 0,811 hasta 0,920] frente a AUC = CI 0.841 [95%, 0,764 hasta 0,917]) o de la etapa I /II (AUC = 0,846 [95% CI, 0,798 a 0,895] frente a AUC = 0,839 [IC del 95%, 0,782 a 0,896]; la Fig. 4C). Más importante aún, la combinación de los dos marcadores era mejor para distinguir entre individuos sanos y TNM-T1 /T2 (AUC = 0,883; IC del 95%, 0,816-0,949), TNM-N0- (AUC = 0,893; IC del 95%, 0,841 hasta 0,946 pacientes), o en estadio I /II en PC (AUC = 0,897; IC del 95%, 0,856 a 0,937) que los marcadores de solo (figura 4C).. Estos resultados implican que ULBP2 es un marcador de suero potencialmente útil para la detección temprana PC, particularmente en conjunción con CA 19-9.
Los niveles séricos de ULBP2 (A) y CA 19-9 (B) en los controles sanos ( Ctrl) se compararon con los de pacientes con estadio temprano PC. Los datos se presentan como diagramas de caja. (C), la curva ROC análisis de la capacidad de ULBP2 (línea de color negro), CA 19-9 (línea discontinua), y una combinación de ambas proteínas (línea gruesa) para discriminar pacientes con CP en fase inicial de los controles.
los niveles en sangre ULBP2 en pacientes con otros tipos de cáncer
para probar si ULBP2 es también un indicador de otras enfermedades malignas, que determinaron los niveles de ULBP2 en la sangre de pacientes con CCR, APN, y GC. Se encontró que los niveles de ULBP2 suero mostraron una tendencia a ser mayor en los pacientes que sufren de NPC (65,5 ± 74,3 pg /ml,
p
= 0,122, n = 28) en comparación con los controles sanos (51,4 ± 64,6 pg /ml) y se fueron moderadamente, pero significativamente, mayor en los pacientes de CRC (70,6 ± 73,8 pg /ml,
p
= 0,038, n = 29; Fig. 5A); los niveles plasmáticos de ULPB2 no fueron significativamente diferentes entre los individuos sanos (86,1 ± 101,2, n = 25) y pacientes GC (78,1 ± 79,7 pg /ml, n = 30,
p
= 0,673; Fig. 5B). Sin embargo, los niveles de ULBP2 suero fueron elevados en pacientes sorprendentemente PC comparación con los de CRC (200,2 ± 168,6 frente a 70,6 ± 73,8 pg /ml,
p
& lt; 0,0001) y NPC (200,2 ± 168,6 frente a 65,5 ± 74,3 pg /ml,
p Hotel & lt; 0,0001) de los pacientes (figura 5A).. La observación de que los niveles de ULBP2 se inalterada, o sólo marginalmente elevado en otras dos cánceres gastrointestinales, CRC y GC, sugiere que ULBP2 podría representar un marcador relativamente específico de PC.
(A), los niveles séricos ULBP2 en controles sanos (Ctrl ) se compararon con los de los pacientes con carcinoma nasofaríngeo (NPC, n = 28) y el carcinoma colorrectal (CCR, n = 29). (B), los niveles de plasma ULBP2 en los controles (Ctrl, n = 25) se compararon con los de los pacientes con cáncer gástrico (CG, n = 30).
Discusión
CA 19 Actualmente -9 es considerado como el más posible marcador de PC suero [27], [28]. Sin embargo, debido CA 19-9 también es elevada en otras enfermedades gastrointestinales, incluyendo pancreatitis, hepatitis, obstrucción biliar, y otros cánceres gastrointestinales [9], [27], [28], su especificidad no es fiable. Además, no se expresa en los sujetos con Lewis a-b- genotipo [29], y PC pobremente diferenciado parece producir menos CA 19-9 de moderada o así cánceres diferenciados [28], lo que limita su sensibilidad de detección. Claramente, la identificación de nuevos marcadores de PC para la elusión de estas limitaciones sería un desarrollo bienvenido.
En este estudio, hemos utilizado un enfoque integrado, los análisis combinados de la secretoma celular PC y transcriptoma para identificar nuevos candidatos marcadores PC, y proporcionar la primera evidencia de que ULBP2 es un marcador de suero nuevo candidato potencial para el diagnóstico de PC. ULBP2 se sobreexpresa en células PC comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes (Fig. 2). inmunoensayos basados en perlas realizados con más de 150 muestras de suero de pacientes de PC revelaron que los niveles de suero no sólo ULBP2 discriminados pacientes de donantes sanos, pero también demostraron un gran potencial para la detección temprana PC (Figs. 3 y 4). Aunque se ha informado de varios marcadores potenciales de PC suero, muy pocos han demostrado ser superiores a CA 19-9 [30], [31]. Es importante destacar que nuestra comparación de ULBP2 suero con CA 19-9 en este estudio de casos y controles mostró que ULBP2 sérica es superior a CA 19-9 como un marcador diagnóstico temprano (Fig. 4). Este hallazgo es especialmente importante a la luz del hecho de que la mayoría de los pacientes con CP mueren dentro de un año, ya que no se diagnostican hasta que el cáncer alcanza una etapa avanzada [1]. El potencial de diagnóstico y pronóstico de ULBP2 en un entorno clínico tendrá que ser verificado utilizando una serie mayor de muestras de suero. Por otra parte, los candidatos adicionales que aparecen en la Tabla 1 no han sido estudiados en detalle para PC, pero sus niveles de expresión podrían ser examinados en los tejidos de PC del uso de Atlas base de datos de proteína humana (HPA), que contiene la inmunohistoquímica (IHC) los perfiles de tinción de 10118 proteínas en una variedad de tejidos cancerosos y no cancerosos basa en anticuerpos 13154 (versión 7.1, http://www.proteinatlas.org/) [32]. Se realizaron búsquedas en 8 proteínas en la base de datos encontramos HPA y 5 de ellos fueron detectados en más del 50% de las secciones de PC examinados. Noteworthily, proteína de unión del NSF alpha soluble, anexina A11, y ERO1-como la proteína alfa se expresa en más del 50% de las secciones de PC con moderada a fuerte tinción IHC (cuadro justificante S6). Estas tres proteínas pueden representar como potenciales biomarcadores de PC que requieren más investigación.
Un consenso se ha unido en torno a la idea de que una detección eficaz y preciso de cáncer en estadio temprano es probable que confiar en los paneles de marcadores que poseen una mayor especificidad y sensibilidad que cada marcador por sí sola [26], [33]. Como se señaló anteriormente, CA 19-9 se utiliza actualmente para la detección de PC, pero su uso como un agente de cribado primario es problemática. Por lo tanto, un panel marcador que combina CA 19-9 con otros marcadores útiles, tales como ULBP2, podría mejorar la capacidad de detectar y supervisar cáncer. De hecho, la combinación de ambos marcadores evidenciado una eficacia diagnóstica mejorada en comparación con el enfoque tradicional usando CA 19-9 solo, especialmente con respecto a la detección de las primeras etapas del PC (Fig. 4).
Aunque ULBP2 tiene ha reportado como un pañuelo de papel y marcador pronóstico suero para el cáncer de ovario [34] y el melanoma [35], respectivamente, creemos que ULBP2 todavía tiene potencial como una prueba de suero relativamente específico y útil para el diagnóstico de PC. Varias líneas de evidencia apoyan esta: (a) el suero ULBP2 /niveles plasmáticos no fueron significativamente elevados en pacientes GC, CRC o NPC en comparación con los individuos sanos en este estudio; (B) Li et al. han informado de que ULBP2 no era detectable en el suero de pacientes con cáncer de ovario [34]; (C) Paschen et al. mostró que ULBP2 no fue medible en más de 20% de los sueros ensayados de pacientes con melanoma, especialmente en pacientes en etapa temprana [35]; y (d) ULBP2, a diferencia de CA 19-9, no parece ser expresadas en niveles más bajos en PC pobremente diferenciado que en moderada o así cánceres diferenciados (cuadros justificantes S4 y S5). Sin embargo, la evaluación de ULBP2 como un marcador de cáncer de páncreas requerirá contra-cribado a gran escala, en particular el uso de muestras de suero de pacientes con pancreatitis.
ULBPs y la clase complejo mayor de histocompatibilidad I-relacionados con la cadena (MIC) son de superficie celular ligandos para NK y T inmunoreceptor expresado por células (NKG2D) que rara vez se expresa por las células normales, pero aparecen en una amplia variedad de tumores malignos [36], [37]. Estos ligandos pueden activar natural killer (NK) y las células T citotóxicas mediante la unión a la NKG2D, y posteriormente contribuir a la citólisis mediada por células y el aclaramiento del cáncer [38], lo que sugiere que las células tumorales que sobreexpresan estos ligandos son más susceptibles a las células mediada inmune vigilancia. De hecho, la expresión de MIC se ha descrito como un indicador de mejor pronóstico en pacientes con CRC [39], y la liberación de ligandos NKG2D de células tumorales se ha demostrado previamente como un nuevo mecanismo immunoevasion cáncer [40], [41]. Recientemente se ha propuesto que derramamiento proteolítica de ULBP2 a partir de células tumorales es mediado por metaloproteasas de matriz (MMP), y puede poner en peligro la inmunogenicidad de las células tumorales [41]. Via el análisis secretoma en este estudio, varios MMPs, incluyendo MMP-1, -7, -9, -11, -13, -14, -28 y podría ser detectada en CM de las líneas celulares PC (Apoyo Tablas S1 y S2) . Por otra parte, la expresión elevada de MMP-7, -8, -9, y -11 se han descrito en tejidos de PC; dos de ellas, la MMP-7 y MMP-11, están fuertemente asociados con un mal pronóstico del cáncer [42]. Estas observaciones sugieren colectivamente que séricos elevados niveles ULBP2 en pacientes con CP podrían reflejar la participación de la escisión proteolítica por MMP liberadas por el cáncer en sí. Mediante la activación de NK y la inmunidad mediada por células T citotóxicas, la eliminación de la forma soluble ULBP2 podría ser una estrategia terapéutica eficaz en PC. Esta intrigante posibilidad de nuevas investigaciones.
En conclusión, en este documento nos informan de que los niveles en suero en pacientes ULBP2 PC son significativamente más altos que los de los controles sanos. La combinación de ULBP2 y CA 19-9 superó cada marcador sola en pacientes de PC distintivas de las personas sanas. Más importante aún, un análisis del área bajo la curva ROC mostró que era superior a la ULBP2 CA 19-9 en la discriminación de pacientes con cáncer de páncreas en estadio temprano de los controles sanos. Por lo tanto, ULBP2 puede representar un nuevo y suero biomarcador útil para el cribado primario para el cáncer de páncreas.
Apoyo a la Información
Figura S1.
detección de la expresión BIGH3 en 31 tejidos de cáncer de páncreas mediante técnicas de inmunohistoquímica.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s001 gratis (PDF)
figura S2.
detección de la expresión ULBP2 en 67 tejidos de cáncer de páncreas mediante técnicas de inmunohistoquímica.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s002 gratis (PDF)
Figura S3.
curva estándar de ULBP2 determinado por el inmunoensayo basado en perlas desarrollado en casa.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s003 gratis (PDF)
figura S4.
Correlación de suero ULBP2 y los niveles séricos de CA 19-9.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s004 gratis (PDF) sobre Table S1. List de las proteínas identificadas en el medio BxPC-3 acondicionado.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s005 gratis (PDF) sobre Table S2. List de las proteínas identificadas en el medio MIA Paca-2 acondicionado.
doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s006 gratis (PDF) sobre Table S3.
Correlación entre las características clínico-patológicos y la expresión BIGH3 en secciones de tejido de 31 pacientes con cáncer de páncreas.