Extracto
SRC, también conocido como proto-oncogén c-Src, es una tirosina quinasa no receptor que juega un papel importante en la progresión del cáncer mediante la promoción de las vías de supervivencia, la angiogénesis, la proliferación y la invasión. En este estudio, se encontró que los niveles de proteína SRC se upregulated consistente en tejidos de cáncer de pulmón, pero que los niveles de ARNm de SRC variado al azar, lo que sugiere que un mecanismo post-transcripcional estaba involucrado en la regulación de SRC. Debido a que los microRNAs (miRNAs) son potentes reguladores post-transcripcional de la expresión génica, se utilizó el análisis bioinformático para buscar miRNAs que potencialmente se dirigen a SRC. Se identificaron los sitios de orientación específicos para el miR-203 en la región 3 'no traducida (3'-UTR) de SRC. entonces Hemos validado experimentalmente miR-203 como un regulador directo de SRC usando ensayos de transfección celular y luciferasa y demostramos que miR-203 inhibe la expresión de SRC y por lo tanto activa la supresión de la vía de SRC /Ras /ERK. Por último, hemos demostrado que la represión de SRC por miR-203 suprime la proliferación y la migración y promueve la apoptosis de las células de cáncer de pulmón. En resumen, este estudio proporciona las primeras pistas sobre el papel de miR-203 como un supresor tumoral en las células de cáncer de pulmón a través de la inhibición de la traducción SRC
Visto:. Wang N, Liang H, Zhou Y, Wang C , Zhang S, Pan Y, et al. (2014) miR-203 suprime la proliferación y migración y promueve la apoptosis de las células del cáncer de pulmón por la orientación SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10.1371 /journal.pone.0105570
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2014; Aceptado: 21 de julio de 2014; Publicado: 20 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas del Programa Nacional de Investigación Básica de China (973 programas) (núm 2014CB542300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81101330, 31271378, 81250044 y), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (núm BK2011013 y BK2012014), y el Fondo Especial de Investigación para la Industria de Bienestar público de Salud (N ° 201 302 018). Este trabajo también fue apoyado por el programa de New Century talentos excelentes en la Universidad del Ministerio de Educación de China (NCET-12-0261). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% de todos los casos [1]. La mayoría de los cánceres de pulmón (56%) son diagnosticados en una etapa temprana de la enfermedad distante, porque suele ser asintomática; sólo el 15% de los casos se diagnostican en una fase local [2]. De hecho, los pacientes con cáncer de pulmón a menudo exhiben la invasión tumoral y la metástasis de células antes del diagnóstico, lo que hace que los tratamientos actuales, incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, ineficaz. La tasa de supervivencia global a 5 años para el cáncer de pulmón de células no pequeñas es extremadamente baja (17,1%). Por lo tanto, el estudio de las bases moleculares del cáncer de pulmón es crucial para el diseño de nuevos agentes terapéuticos que mejoren la tasa de supervivencia
.
Con los sustanciales avances en nuestra comprensión de la biología del tumor, vías de señalización clave que participan en la mediación de crecimiento del cáncer de pulmón y progresión se han identificado [3]. oncogenes dominantes y genes supresores de tumores implicados en la patogénesis del cáncer de pulmón han atraído un interés sustancial, y sus papeles centrales y contribución fundamental para el mal comportamiento de las células cancerosas se han puesto de manifiesto [4]. Estos genes ofrecen nuevos objetivos para las terapias biológicas. Uno de tales objetivo SRC (también conocido como c-Src), un proto-oncogen que codifica una tirosina quinasa que con frecuencia se sobreexpresa y activado en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón [5], [6]. Sobre la base molecular, SRC regula múltiples cascadas de señalización asociadas con el desarrollo y progresión del tumor, incluyendo la vía de la quinasa de adhesión focal (FAK), vía el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y de la vía Ras /ERK [7]. En consecuencia, las funciones SRC como un oncogén para favorecer la proliferación, la migración y la invasión de varios tipos de células de cáncer [8], [9]. A pesar de estos avances recientes en nuestra comprensión de las funciones importantes de SRC en la tumorigénesis, el mecanismo molecular preciso a través del cual SRC contribuye a la progresión del cáncer de pulmón aún no ha sido dilucidado.
Una clase de los pequeños no codificante, sola ARN -cables conocidas como microRNAs (miRNAs) se ha demostrado estar involucrados en el cáncer. miRNAs se unen mRNAs diana en los sitios complementarios en sus regiones 3 'no traducidas (3' UTRs), suprimiendo así la expresión del gen diana a nivel postranscripcional [10], [11]. A través de este mecanismo, miRNAs regulan una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la proliferación y la diferenciación celular, la migración, la apoptosis, el desarrollo, y el metabolismo de [10]. Por otro lado, la disfunción de miRNAs está implicado en diversos cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón, y miRNAs puede funcionar como oncogenes y supresores de tumor durante la carcinogénesis [12], [13]. Por ejemplo, una baja expresión de let-7a y alta expresión de la agrupación de miR-17-92 se asocia con un mal resultado clínico en cáncer de pulmón [14], [15]. Por otra parte, se informó que el miR-31 pudo reprimir directamente los supresores de tumores y LATS2 PPP2R2A en el cáncer de pulmón humano [16]. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de una búsqueda en profundidad para miRNAs que se expresan de forma aberrante durante la carcinogénesis pulmonar, así como la necesidad de una intensa investigación de su papel en la biología del tumor.
A pesar de que la desregulación de los miRNAs y juego SRC un papel importante en la carcinogénesis pulmonar, se ha reportado ninguna correlación entre el SRC y miRNAs en el cáncer de pulmón. En este estudio, se predijo que SRC es un objetivo de miR-203. Después de medir los niveles de expresión de miR-203 y SRC en el tejido de cáncer de pulmón humano y emparejado muestras de tejidos cancerosos, se detectó una correlación inversa entre el miR-203 y los niveles de proteína SRC. Por otra parte, hemos validado experimentalmente la inhibición directa de la traducción SRC por miR-203 usando ensayos de transfección celular y luciferasa. Por último, hemos demostrado que miR-203 inhibe la expresión de SRC y por lo tanto activa la supresión de las vías de señalización corriente abajo de SRC, tales como la vía /Ras /ERK SRC, que eventualmente suprime la proliferación y migración y promovió la apoptosis de células de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
las células y tejidos humanos
el cáncer de pulmón humano A549 líneas celulares, HCC827 y H1975, y la línea celular de fibroblastos de pulmón humano normal HLF se adquirieron de Shanghai Institute of Cell Biology, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). A549, HCC827, y H1975 células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (GIBCO, CA, EE.UU.), y las células HLF se cultivaron en F12K suplementado con 10% de suero bovino fetal (GIBCO) y 2,5 g /L de NaHCO
3. Todas las células se incubaron en un CO 5%
2 a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua. Los tumores de pulmón y los tejidos adyacentes normales emparejados se derivaron de los pacientes sometidos a una intervención quirúrgica en el Hospital Gulou Afiliado de la Universidad de Nanjing (Nanjing, China). A continuación, la sección de diapositivas tumorales fueron sometidos a análisis inmunohistoquímico de SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Todos los pacientes o sus tutores proporcionado un consentimiento escrito, y el Comité de Ética de la Universidad de Nanjing aprobaron todos los aspectos de este estudio. Los fragmentos de tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido en el momento de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. Las características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla S1 S1 en el archivo.
ARN aislamiento y RT-PCR cuantitativa
El ARN total se extrajo de las células cultivadas y tejidos humanos utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen , Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Los ensayos para cuantificar miRNAs se realizaron con sondas TaqMan miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 g de ARN total fue transcrito de forma inversa en ADNc usando transcriptasa inversa AMV (Takara, Dalian, China) y un cebador tallo-bucle RT (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, y 85 ° C durante 5 min. PCR en tiempo real se realizó con un kit TaqMan PCR en un Sistema de Applied Biosystems 7300 de detección de secuencias (Applied Biosystems). Las reacciones se incubaron en una placa óptica de 96 pocillos a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Después de la reacción, el ciclo umbral (C
T) de datos se determinaron utilizando ajustes de umbral fijos, y la media C
se determinó T de las PCR por triplicado. Un método C
T comparativo se utilizó para comparar cada condición a los controles. Los niveles relativos de los miRNAs en células y tejidos se normalizaron a U6. La cantidad de miARN en relación con el control interno U6 se calculó utilizando el
-ΔΔCT la ecuación 2, en el que ΔΔC
T = (C
T miARN - C
T U6)
target - (C
T miARN - C
T U6)
control. Para cuantificar el mRNA SRC, 1 g de ARN total fue transcrito de forma inversa a cDNA utilizando oligo dT y Thermoscript (Takara) en la reacción, que se realizó con las siguientes condiciones: 42 ° C durante 60 min y 70 ° C durante 10 min . A continuación, PCR en tiempo real se realizó utilizando el producto de la RT, SYBER tinte verde (Invitrogen) y cebadores específicos para SRC y GAPDH. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: SRC (sentido): 5 'CATCCAAGCCTCAGACCCA-3'; SRC (antisentido): 5'-TGACACCACGGCATA CAGC-3 '; GAPDH (sentido): 5'-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 '; y GAPDH (antisentido): 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 '. Las reacciones se incubaron a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Después de que las reacciones eran completas, la C
valores de T se determinó mediante el establecimiento de un umbral fijo. La cantidad relativa de ARNm SRC se normalizó a GAPDH.
La sobreexpresión y la caída de miR-203
ARN control negativo sintéticos pre-miR-203, anti-miR-203 y revueltos fueron adquiridos de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). Todas las células se sembraron en placas de 6 pocillos o placas de 60 mm, y las células fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) al día siguiente cuando las células fueron aproximadamente 70% de confluencia. En cada pocillo, se utilizaron cantidades iguales de pre-miR-203 anti-miR-203 o revueltos ARN control negativo. Las células se cosecharon 24 h después de la transfección por RT-PCR cuantitativa y Western Blot.
reportero de luciferasa ensayo
Para probar la unión directa de miR-203 a la SRC gen diana, un reportero de la luciferasa ensayo se realizó como se describe anteriormente [17]. Toda la región 3 'no traducida (3'-UTR) de SRC humano se amplificó utilizando PCR con el ADN genómico humano como plantilla. Los productos de PCR se insertaron en el plásmido p-MIR-reporter (Ambion), y la inserción se confirmó como correcta por secuenciación. Para probar la especificidad de unión, se mutaron las secuencias que interactúan con la secuencia de semilla de miR-203 (de AUUUCA a UAAAGU), y el mutante SRC 3'-UTR se insertó en un indicador de luciferasa equivalente. Para los ensayos de reportero de luciferasa, las células A549 se cultivaron en placas de 24 pocillos, y cada pocillo se transfectaron con 1 g de la luciérnaga del plásmido informador de luciferasa, 1 g de una β-galactosidasa (β-gal) plásmido de expresión (Ambion), y cantidades iguales (100 pmol) de pre-miR-203, anti-miR-203 o el ARN control negativo revueltos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El plásmido β-gal fue utilizado como un control de transfección. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se analizaron utilizando un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
Plásmido construcción y ensayo de siRNA de interferencia
Una secuencia de siRNA dirigidos a la humano SRC cDNA fue diseñado y sintetizado por GenePharma (Shanghai, china). La secuencia de siRNA fue 5'-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 '. Un siRNA revueltos se incluyó como un control negativo. Un plásmido de expresión de mamífero que codifica el marco de lectura abierta SRC humana (Preceiver-M02-SRC) se adquirió de GeneCopoeia (Germantown, MD, EE.UU.). Un plásmido vacío sirvió como control negativo. El vector de expresión SRC y SRC siRNA se transfectaron en las células A549 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Total RNA y proteínas se aislaron 24 h después de la transfección. Los niveles de mRNA SRC y de expresión de proteínas se evaluaron mediante RT-PCR cuantitativa y transferencia Western.
extracción de proteínas y Todas las células se aclararon con PBS (pH 7,4) y se lisaron en RIPA lisis Western blotting
tampón (Beyotime, china) suplementado con un cóctel de proteasa y fosfatasa inhibidor (Thermo Scientific 78440) en hielo durante 30 min. Las muestras de tejido se congelaron con nitrógeno líquido sólido, muele en un polvo y se lisaron en tampón de lisis RIPA que contiene la proteasa Cocktail y fosfatasa inhibidor en hielo durante 30 min. Cuando sea necesario, se utilizó sonicación para facilitar la lisis. Los lisados celulares o tejidos homogeneizados se centrifugaron durante 10 min (12000 g, 4 ° C). Se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se calculó utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Los niveles de proteína se analizaron mediante transferencias Western con anticuerpos correspondientes. Los niveles de proteína se normalizaron sondando las mismas manchas con un anticuerpo GAPDH. Los anticuerpos fueron adquiridos de las siguientes fuentes: anti-c-Src (B-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, EE.UU.), anti-ERK1 (BD Biosciences 610031, EE.UU.), anti-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) y anti-GAPDH (sc-365062, Santa Cruz Biotechnology). la actividad de Ras se detectó usando el kit de ensayo de activación de Ras de Upstate-Millipore (17-218). Las bandas de proteínas se analizaron utilizando el software ImageJ.
viabilidad de las células de ensayo
Para evaluar la viabilidad de las células, las células A549 se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
3 células por pocillo en 100 l de medio de cultivo. El índice de proliferación celular se midió utilizando el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil (MTT) ensayo (Sigma, EE.UU.), que se realizó 12, 24, 36, y 48 h después de la transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
la migración de células de ensayo
la capacidad de migración de las células A549 transfectadas con el plásmido de miR-203 imitan o sobreexpresión SRC fue probado en una Cámara Transwell Boyden (6,5 -mm, Costar, EE.UU.). Las membranas de policarbonato (8 micras de tamaño de poro) en la parte inferior del compartimiento superior de los Transwells se recubrieron con fibronectina humana 1% (R & amp; D systems 1918-FN, EE.UU.). Las células se recogieron 24 h después de la transfección y se suspendieron en medio de cultivo DMEM FBS-libre. Después, se añadieron las células a la cámara superior (4 × 10
4 células /pocillo). Al mismo tiempo, se añadió 0,5 ml de DMEM con 10% FBS al compartimento inferior, y las placas Transwell que contienen se incubaron durante 12 h en un CO 5%
2 atmósfera saturada con H
2O. Después de la incubación, las células que habían entrado en la superficie inferior de la membrana de filtro se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 25 min a temperatura ambiente, se lavó 3 veces con agua destilada y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en borato 0,1 M y 2% de etanol durante 15 min a temperatura ambiente. Las células que quedan en la superficie superior de la membrana de filtro (no migrante) se rasparon suavemente con un bastoncillo de algodón. Las imágenes de las superficies inferiores (con células migrantes) fueron capturados por un fotomicroscopio (5 campos por cámara) (BX51 de Olympus, Japón), y las células se contaron a ciegas.
Ensayos de apoptosis
La apoptosis de las células A549 transfectadas con el miR-203 plásmido imitan o sobreexpresión SRC fue probada usando un /yoduro de propidio Anexina V-FITC (PI) tinción ensayo. Las células A549 se cultivaron en placas de 12 pocillos y se transfectaron con el miR-203 imitan, siRNA, el plásmido o sobreexpresión SRC para inducir apoptosis. siRNAs-miR-de control pre y control sirvieron como controles negativos. Las células se cultivaron durante la noche con tanto medio completo y medio de suero empobrecido que contiene suero; y luego se recogieron las células unidas y flotantes. Citometría de flujo El análisis de las células apoptóticas se llevó a cabo utilizando un kit V-FITC /PI tinción con anexina (BD Biosciences, CA, EE.UU.). Después de lavados con PBS frío, las células se resuspendieron en tampón de unión (HEPES 100 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, y CaCl 25 mM
2), seguido por tinción con Anexina V-FITC /PI a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. Las células apoptóticas fueron evaluados por gating células PI y Anexina V-positivo en un activadas por fluorescencia de células (FACS) citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
Todas las imágenes de Western Blot son representativos de al menos tres experimentos independientes. RT-PCR cuantitativa, el ensayo indicador de luciferasa y los ensayos de viabilidad celular y la apoptosis se realizaron por triplicado, y cada experimento se repitió varias veces. Los datos mostrados son la media ± SE de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p & lt;. 0.05 usando la prueba t de Student
Resultados
La regulación positiva de la proteína SRC, pero no ARNm, en tejidos de cáncer de pulmón
investigaron por primera vez la expresión de SRC por medio de ambos análisis inmunohistoquímico y análisis de inmunotransferencia en tejidos de cáncer de pulmón humano y los tejidos no cancerosos correspondientes. Se encontró que los niveles de proteína SRC eran mucho más altos en los tejidos de cáncer de pulmón (Figura 1, A-C). Aunque la proteína SRC se reguló consistente en tejidos de cáncer de pulmón, los niveles de ARNm de SRC no difirieron significativamente entre el cáncer y tejidos no cancerosos (Figura 1D). Además, se encontró que el nivel de proteína SRC fue mayor en las células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano en comparación con la de las células de fibroblastos de pulmón HLF normales (Figura S1, A y B en S1 File), pero el nivel SRC mRNA fue igual en estas dos líneas celulares (Figura S1C en S1 archivo). Esta disparidad entre la proteína y el ARNm de la expresión de SRC en los cánceres de pulmón sugiere que un mecanismo post-transcripcional participa en la regulación SRC.
(A) Imagen representativa del análisis inmunohistoquímico de la expresión de SRC en el cáncer de pulmón (CL) y tejido adyacente (NL) muestras normales. (B y C) Análisis de transferencia de Western de los niveles de expresión de la proteína SRC en seis pares de muestras de CL y NL. B: imagen representativa; C: análisis cuantitativo. análisis (D) RT-PCR cuantitativa de los niveles relativos de expresión de SRC mRNA en seis pares de muestras CL y NL. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Identificación de miR-203 sitios objetivo conservadas dentro de la 3'-UTR de SRC
Un modo importante de la regulación post-transcripcional es la represión del ARNm transcripciones de miRNAs. miRNAs son, por lo tanto, probable que desempeñe un papel biológicamente relevante en la regulación de la expresión de SRC en el cáncer de pulmón. Tres algoritmos computacionales, incluyendo TargetScan [18], Miranda [19], y PicTar [20], se utilizaron en combinación para identificar miRNAs potenciales que pueden dirigirse SRC. El uso de estos enfoques, el miR-203 fue identificado como un candidato miARN reguladoras de SRC. La interacción predicha entre miR-203 y los sitios diana de la SRC 3'-UTR se ilustran en la Figura 2A. Cuatro sitios diana potenciales miR-203 se encontraron en el 3'-UTR de la secuencia de mRNA SRC. Los valores de energía libre mínima de estos híbridos eran -16,9, -20,1, -15,8, -18,9 y kcal /mol, respectivamente, que están bien dentro de la gama de auténticos pares miARN objetivo. Por otra parte, perfecto apareamiento de bases se produjo entre la región de la semilla (la secuencia central que abarca los primeros 2-8 bases de la madurez miARN) y los objetivos afines. Además, las secuencias de unión de miR-203 en la SRC 3'-UTR están muy conservadas entre especies.
(A) Descripción esquemática de los dúplex hipotéticas formadas por las interacciones entre los sitios de unión en el SRC 3'- UTR (arriba) y miR-203 (parte inferior). El valor predicho energía libre de cada híbrido se indica. Los sitios de reconocimiento de la semilla se denotan, y todos los nucleótidos de estas regiones están muy conservadas entre las especies, incluida la humana, el ratón y la rata. (B) El análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de expresión de miR-203 (en forma de la relación de los genes miARN /U6) en seis pares de muestras CL y NL. (C) de dispersión gráfica de correlación de Pearson de las veces el cambio de los niveles de proteína de miR-203 y SRC en los tejidos de cáncer de pulmón humano. (D) de dispersión gráfica de correlación de Pearson de las veces el cambio de los niveles de miR-203 y SRC ARNm en tejidos de cáncer de pulmón humano. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
La detección de una correlación inversa entre los niveles de miR-203 y SRC en el cáncer de pulmón muestras de tejido
miRNAs generalmente se cree que tienen patrones de expresión que son opuestas a la de sus objetivos [21] - [23]. A continuación se investigó si el miR-203 se correlaciona inversamente con SRC en el cáncer de pulmón. Después de determinar los niveles de miR-203 en los mismos seis pares de tejidos de cáncer de pulmón y los tejidos no cancerosos correspondientes, se demostró que los niveles de miR-203 se downregulated consistente en tejidos de cáncer de pulmón (Figura 2B). La correlación inversa entre los niveles de miR-203 y los niveles de proteína SRC (Figura 2C) y la disparidad entre los niveles de miR-203 y los niveles de ARNm de SRC (Figura 2D) se ilustra adicionalmente mediante los gráficos de correlación de Pearson de dispersión. Como se observa, una correlación inversa entre los niveles de miR-203 y los niveles de proteína Src, pero no los niveles de ARNm, se observó en los tejidos de cáncer de pulmón humano. Del mismo modo, el nivel de miR-203 también fue menor en las células A549 en comparación con la de las células HLF (Figura S1D en File S1). Los resultados indican firmemente que un típico, mediada por miRNA, mecanismo de regulación post-transcripcional estuvo involucrado en la represión SRC.
Validación del CEC, tal como un objetivo directo de miR-203
La correlación entre el miR -203 y SRC, se examinó mediante la evaluación de la expresión de SRC en las células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 después de la sobreexpresión de miR-203. En estos experimentos, miR-203 sobreexpresión se consiguió mediante la transfección de las células con pre-miR-203 (un dúplex de ARN oligonucleótido sintético imitando el precursor miR-203). Como se preveía, miR-203 niveles en las células A549 se aumentaron más de 300 veces cuando estas células fueron transfectadas con pre-miR-203 (Figura 3A). Para validar que la transfección de miR-203 se ha realizado correctamente, uno de los genes diana representativas de miR-203, PKCalpha (REF), se evaluó y se demostró que PKCalpha se downregulated significativamente en las células A549 después de la transfección de miR-203 (Figura S2 en S1 File). Del mismo modo, la expresión de la proteína SRC se redujo por la introducción de miR-203 en las células A549 (Figura 3, B y C). Para determinar el nivel en el que miR-203 influenciada expresión SRC, repetimos los experimentos antes mencionados y examinado la expresión de SRC mRNA después de la transfección. Aunque el nivel intracelular de miR-203 se modificó significativamente después del tratamiento con pre-miR-203, la sobreexpresión de miR-203 no afectó SRC mRNA estabilidad (Figura 3D). Por otra parte, la correlación entre miR-203 y SRC se examinó también mediante la evaluación de la expresión de SRC en las células normales de fibroblastos de pulmón HLF después desmontables de miR-203 con anti-miR-203 (oligonucleótidos antisentido modificados químicamente diseñados para dirigirse específicamente a miR maduro 203) (Figura 3A). El derribo de miR-203 en células HLF resultó en el aumento de la proteína SRC (Figura 3, B y C) los niveles, pero no mRNA (Figura 3D). Estos resultados demuestran que el miR-203 regula específicamente la expresión de la proteína SRC en el nivel post-transcripcional, que es un mecanismo de regulación mediada por miRNA típico animal. Para demostrar la robustez de la prueba, repetimos los experimentos mencionados anteriormente en dos líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón adicionales, HCC827 y H1975. Del mismo modo, los niveles de miR-203 se incrementaron significativamente cuando las células HCC827 y H1975 se transfectaron con pre-miR-203 (Figura S3, A y E en S1 Archivo). En consecuencia, los niveles de proteína SRC fueron suprimidos cuando las células HCC827 y H1975 se trataron con pre-miR-203 (Figura S3, B, C, F y G en S1 del archivo), pero los niveles de SRC de ARNm no fueron influenciados por este tratamiento (Figura S3, D y H en S1 File).
(análisis a) RT-PCR cuantitativa de los niveles de miR-203 en las células A549 tratadas con pre-miR-control o pre-miR-203 y en células HLF tratados con anti-miR-control o anti-miR-203. (B y C) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína Src en células A549 tratadas con pre-miR-control o pre-miR-203 y en células HLF tratados con anti-miR-control o anti-miR-203. B: imagen representativa; C: análisis cuantitativo. (D) Análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de SRC de mRNA en células A549 tratadas con células HLF pre-miR-control o de pre-miR-203 y en tratados con anti-miR-control o anti-miR-203. reporteros de luciferasa (E) de la luciérnaga que contienen de tipo salvaje (WT) o sitios de unión de mutantes (MUT) miR-203 en el SRC 3'-UTR se co-transfectaron en células A549 con pre-miR-control o pre-miR-203 y HLF en células con anticuerpos anti-miR-control o anti-miR-203. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se analizaron utilizando un kit de ensayo de luciferasa. Los resultados se calculan como la relación de la actividad luciferasa de luciérnaga en las células anti-miR-203 transfectadas con normalizadas a las células de control pre-miR-203- o. * P & lt; 0,05; ** P & lt;.
0,01
Para determinar si los efectos reguladores negativos que el miR-203 ejercida sobre la expresión de SRC fueron mediados por la unión de miR-203 a los presuntos sitios en la 3'-UTR de el mRNA SRC, el SRC longitud completa 3'-UTR que contiene los cuatro sitios de unión de miR-203 presuntos se fusionó cadena abajo del gen de luciferasa de luciérnaga en un plásmido reportero. El plásmido resultante se transfectó en células A549, junto con un plásmido de control de transfección (β-gal) y pre-miR-203. Como era de esperar, la sobreexpresión de miR-203 dio lugar a una reducción de más del 50% de la actividad de luciferasa en comparación con las células tratadas con el ARN control negativo (Figura 3E). Además, introdujimos mutaciones puntuales en los sitios complementarios correspondientes en el SRC 3'-UTR de eliminar los sitios de unión de miR-203 predichos (todo de las cuatro posiciones de unión se mutante). Este indicador de luciferasa mutado no se vio afectada por la sobreexpresión de miR-203 (Figura 3E). En contraste, cuando el plásmido resultante se transfectó en células HLF junto con un plásmido de control de transfección (β-gal) y anti-miR-203, la caída de miR-203 dio como resultado un aumento de más del 75% de la actividad de luciferasa en comparación con las células tratadas con el ARN control negativo, mientras que el indicador de luciferasa mutado no se vio afectada por la caída de miR-203 (Figura 3E). Este hallazgo sugiere que los sitios de unión contribuyen en gran medida a la miARN: mRNA interacción mediar la represión post-transcripcional de la expresión de SRC. En conclusión, nuestros resultados demuestran que el miR-203 reconoce directamente y se une a la 3'-UTR de la transcripción SRC ARNm e inhibe la traducción SRC.
supresión de la ruta SRC /señalización Ras /ERK por miR-203
a continuación analizaron las consecuencias biológicas de la expresión SRC disminución causada por el miR-203 en células de cáncer de pulmón. Como un potente oncogén, SRC regula la proliferación y motilidad de las células cancerosas al afectar las vías de señalización /ERK FAK, EGFR, y Ras [7]. Por lo tanto, se investigó si la supresión de la expresión de SRC debido a miR-203 regula las actividades de las moléculas en la vía de señalización SRC /Ras /ERK. En primer lugar, hemos validado el efecto de la actividad de SRC en la vía de señalización Ras /ERK en células A549. De acuerdo con los informes anteriores [7], [24], desmontables de SRC por la interferencia de ARN siRNA mediada produjo una reducción de SRC mRNA y los niveles de proteína (Figura 4, A-C), que, a su vez, dio lugar a una disminución de Ras-GTP y fosforilados-ERK1 /2 (Figura 4, A y B). Por el contrario, la sobreexpresión de SRC produjo un aumento de mRNA SRC y los niveles de proteína (Figura 4, A-C), que, a su vez, condujo a un aumento de Ras-GTP y fosforilados-ERK1 /2 (Figura 4, A y B). A continuación, se investigó si la inducción de miR-203 podría imitar la reducción de SRC en la supresión de la vía de señalización Ras /ERK. Como se preveía, la sobreexpresión de miR-203 en células A549 downregulated la proteína SRC y resultó en menos activa Ras-GTP, que, a su vez, dio lugar a menos fosforilados ERK1 /2 (Figura 4, D y E). Tomados en conjunto, los resultados sugieren que Ras /ERK, como la vía de señalización corriente abajo de SRC, puede ser estrechamente controlada por la vía reguladora miR-203 /SRC.
(A y B) análisis de transferencia de Western de la proteína niveles de SRC, Ras-GTP, el total de Ras, ERK1 fosforilados /2, y ERK1 en las células A549 transfectadas con ARNsi de control, SRC siRNA, el control de vector, o vector SRC. A: imagen representativa; B: análisis cuantitativo. análisis (C) RT-PCR cuantitativa de los niveles de ARNm de SRC en las células A549 tratadas con ARNsi de control, SRC siRNA, el control de vector, o vector SRC. (D y E) Análisis de transferencia de Western de los niveles de la proteína SRC, Ras-GTP, el total de Ras, fosforilados ERK1 /2, y ERK1 en las células A549 transfectadas con pre-miR-control o pre-miR-203. D: imagen representativa; E: análisis cuantitativo. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
El papel de miR-203 en la regulación de SRC en las células de cáncer de pulmón
A continuación se centró en el estudio del papel de miR-203 en la regulación de SRC. Debido SRC se sabe que está implicado en la regulación de la proliferación celular, la apoptosis y la migración, se investigó si miR-203 regularía SRC para modular la proliferación celular, la apoptosis y la migración en las células A549. En apoyo a la idea de que el SRC es esencial en la promoción de la proliferación [25], las células A549 transfectadas con siRNA SRC mostraron inhibición de la proliferación celular (Figura S1 S4A de archivos); en contraste, la transfección con el plásmido de SRC-overexpressing, que especialmente expresa el marco de longitud completa de lectura abierto (ORF) de SRC sin el miR-203-sensible 3'-UTR, tenía un efecto opuesto sobre la proliferación celular (Figura S4B en File S1). Posteriormente, se evaluó el papel de miR-203 en la proliferación celular. Como era de esperar, las células A549 transfectadas con pre-miR-203 se habían reducido los niveles de proteína SRC (Figura 5, A y B) y proliferado a un ritmo significativamente inferior (Figura 5C).