Extracto
La mayoría de las células cancerosas expresan altos niveles de telomerasa y proliferan indefinidamente. Además de su función de mantenimiento de los telómeros, la telomerasa también tiene una función pro-supervivencia que resulta en un aumento de la resistencia contra el daño del ADN y la disminución de la inducción de apoptosis. Sin embargo, los mecanismos moleculares de esta función protectora sigue siendo difícil y no está claro si es conectado con el mantenimiento de los telómeros o es más bien una función no telomérica de la proteína telomerasa, terc. Recientemente se demostró que la subunidad de la proteína de la telomerasa puede lanzadera desde el núcleo hasta la mitocondria al estrés oxidativo en los que protege la función mitocondrial y disminuye el estrés oxidativo intracelular. Aquí mostramos que la telomerasa endógena (proteína de TERT) lanzaderas desde el núcleo en las mitocondrias en el estrés oxidativo en las células cancerosas y se analizaron los patrones de exclusión nucleares de telomerasa endógeno después del tratamiento con peróxido de hidrógeno en diferentes líneas celulares. Las poblaciones de células excluidos de TERT del núcleo sobre el estrés oxidativo de una manera heterogénea. Se encontró una correlación significativa entre la localización nuclear de la telomerasa y el daño de ADN alto, mientras que las células que excluían la telomerasa a partir del núcleo muestran ningún daño o muy baja ADN. Hemos modelado telomerasa nuclear y mitocondrial usando orgánulo vectores específicos de localización y confirmó que la localización mitocondrial de la telomerasa protege el núcleo de daño infringido DNA y la apoptosis mientras que, en contraste, la localización nuclear de la telomerasa en correlación con una mayor cantidad de daño en el ADN y la apoptosis. Se sabe que el daño del ADN nuclear puede ser causada por especies reactivas de oxígeno generadas mitocondrial (ROS). Se demuestra aquí que la localización mitocondrial de la telomerasa impide expresamente a daños en el ADN nuclear por la disminución de los niveles de ROS mitocondrial. Sugerimos que esta disminución del estrés oxidativo podría ser una posible causa de alta resistencia al estrés de las células cancerosas y podría ser especialmente importante para las células madre del cáncer
Visto:. Singhapol C, D Pal, Czapiewski R, Porika M, Nelson G, Saretzki GC (2013) mitocondrial telomerasa protege a las células de cáncer a causa daño del ADN nuclear y la apoptosis. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10.1371 /journal.pone.0052989
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Agosto, 2012; Aceptado: 27 Noviembre 2012; Publicado: 9 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Singhapol et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Chatchawan Singhapol fue financiada por una beca del gobierno tailandés. Glyn Nelson fue apoyada por la beca BBSRC nr. BB /C008200 /1 (CISBAN). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Gabriele Saretzki es un PLOS ONE editor y miembro del Consejo Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La telomerasa es una enzima conocida por su papel en el mantenimiento de los telómeros. Las células con expresión baja o nula telomerasa pierden repeticiones de los telómeros durante la división celular, lo que implicaría en la senescencia celular. La mayoría de las células cancerosas, las células germinales y las células madre embrionarias expresan altos niveles de telomerasa, contribuyendo así a la pluripotencia y la inmortalidad. A fin de mantener los telómeros la enzima necesita su subunidad catalítica (terc), así como el componente de ARN (TERC o TR), que contiene la plantilla para la síntesis de los telómeros.
En los últimos años, sin embargo, se han acumulado pruebas de que la telomerasa , y en particular su subunidad catalítica de TERT, está implicado en diversas funciones no relacionadas con telómeros como la regulación de la expresión génica, factores de crecimiento y la proliferación celular [1] - [6]. Además, varios grupos han demostrado que las lanzaderas TERT desde el núcleo y se transloca a la mitocondria al estrés exógeno [7] - [12]. Nosotros y otros han demostrado un papel protector de la telomerasa dentro de la mitocondria [10] - [12] mientras que la incapacidad de shuttling telomerasa conduce a estrés celular, impide la inmortalización y aumenta la sensibilidad contra el estrés genotóxico, como se muestra recientemente por el grupo de Santos '[13] - [ ,,,0],15].
la mayoría de las células cancerosas expresan altos niveles de telomerasa, un requisito previo importante para la proliferación indefinida y la inmortalidad. Además, la telomerasa contribuye a la tumorigénesis a través de mecanismos no dependientes de los telómeros que no se comprenden bien todavía [16].
La telomerasa tanto, se ha sugerido que es un importante objetivo de lucha contra el cáncer, con los primeros ensayos clínicos de la inhibidor de la telomerasa imetelstat éxito en curso [17], [18]. La telomerasa se regula a varios niveles y localización subcelular es uno de ellos. supervivencia de las células del cáncer después de los tratamientos terapéuticos puede ser heterogéneo con algunas células que responden al tratamiento, mientras que otros parecen ser resistentes, contribuyendo a la supervivencia de células tumorales. Un mejor conocimiento de las consecuencias biológicas de diferentes localizaciones subcelulares de terc podría conducir al desarrollo de tratamientos más eficaces contra el cáncer.
A continuación se caracterizó la exclusión de la telomerasa desde el núcleo al aplicar la tensión y el estrés encontramos una heterogénea respuesta en las poblaciones celulares de cáncer. Es importante destacar, que había una correlación llamativa entre la telomerasa /de TERT retenido dentro de los daños núcleo y alta de ADN. En contraste, las células que excluyen la telomerasa rápidamente desde el núcleo acumulada ninguna o muy poca cantidad de daño en el ADN. Al modelar las diferentes localizaciones subcelulares de la telomerasa usando vectores de "tirador" orgánulos orientada demostramos aquí que la telomerasa mitocondrial previene el daño nuclear ADN, así como la inducción de la apoptosis después del tratamiento con H
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2 y la irradiación. Sugerimos que la reducción de la generación de especies reactivas del oxígeno mitocondrial (ROS) podría ser el mecanismo subyacente para explicar cómo mitocondrial de TERT evita daños en el ADN nuclear.
Por lo tanto, la exclusión de la telomerasa desde el núcleo después de estrés, tales como anti-cáncer tratamiento terapéutico podría ser un mecanismo de protección que disminuye el daño del ADN nuclear y la apoptosis mediante la reducción de estrés oxidativo dentro de la mitocondria. Esto puede contribuir a aumentar la resistencia de las células de cáncer contra diversos tratamientos contra el cáncer.
Resultados y Discusión
shuttling subcelular de la proteína de TERT desde el núcleo hasta las mitocondrias se habían mostrado previamente en diversos tipos de células , incluyendo las células del cáncer [7], [10] - [12]. Se confirmó esta shuttling de la telomerasa endógena después de H
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2 de tratamiento en las células HeLa y MCF7 (Fig. 1A) desde el núcleo a la mitocondria y se cuantificó la exclusión en comparación con células MRC-5 /hTERT (Tabla 1). Con el fin de evaluar la cinética de shuttling de TERT con más detalle se analizaron 3 líneas celulares, incluyendo líneas celulares de cáncer de 2, así como de hTERT que sobre-expresan fibroblastos MRC-5, y seguido ellos más de 5 días.
Ejemplo rindió proyecciones de volumen 3D de imágenes confocal deconvolved de células HeLa y MCF7 no tratadas (control, panel izquierdo) o tratadas con 400 mM h
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2 de 3 h (panel derecho). El verde representa MitoTracker fluorescencia verde, rojo anti-terc inmuno-fluorescencia y ADN nuclear azul (DAPI). colocalización marcada entre MitoTracker verde y de TERT se muestra mediante una mezcla rojo-verde que se muestran como amarillo. B-D: Cinética de localización TERT en 3 poblaciones línea celular después del tratamiento con 400 M H
2O 2 más de 5 días. B: HeLa C: MCF7 D: MRC-5 /hTERT. Las barras negras: de TERT nuclear, barras rojas: citoplasmática de TERT. Las barras son medias ± SE de al menos 30 células por punto de tiempo y la línea celular de 3 experimentos independientes.
En todas las líneas celulares de 3 exclusión de TERT nuclear comenzó alrededor de 45 minutos después del inicio de H
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2 tratamiento. En hTERT sobre-expresión de fibroblastos de la exclusión alcanzó su máximo de 60% después de 3 horas mientras se tomó las dos líneas celulares de cáncer hasta un día para alcanzar un nivel de exclusión de 50 a 60% (Fig. 1B-D). Esto se corresponde bien con la de TERT mitocondrial datos co-localización de nuestras imágenes confocales de las líneas 3 de células (Tabla 1). Curiosamente, el nivel de exclusión nuclear de 50-60% persistió en todas las líneas celulares de 3 hasta 5 días, los puntos más largos de tiempo que analizamos (fig. 1B-D y S1). Por lo tanto, la exclusión de TERT nuclear es un proceso más persistente que puede durar hasta varios días después de una dosis única en bolo de 400 M H
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2. Para nuestro conocimiento, este es la primera vez que la cinética de exclusión TERT se ha investigado en detalle y comparación en tres líneas celulares diferentes a lo largo de un plazo de 5 días. La gran persistencia de la proteína de TERT fuera del núcleo en las líneas celulares de cáncer podría ser un contribuyente importante para el aumento de la resistencia y la disminución de la apoptosis en células de cáncer después de tratamiento con fármacos o irradiación en comparación con las células no cancerosas que en la mayoría de los casos no expresan o niveles bastante bajos de telomerasa. Hemos demostrado anteriormente que los fibroblastos negativos telomerasa son mucho más susceptibles a la apoptosis después del tratamiento con H
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2 y etopósido que su sobre-expresión de la telomerasa homólogos [10]. También habíamos demostrado previamente [10] que la exclusión de TERT del núcleo es reversible durante un periodo de tiempo de alrededor de 10 días. Sin embargo, no sabemos si la proteína de TERT persistente dentro de la mitocondria no siempre vienen del núcleo o si la proteína de TERT recién sintetizado se importa directamente en las mitocondrias. Esta pregunta requiere más investigación.
A continuación se correlacionó la exclusión de la telomerasa para cada celda individual con su nivel de daño en el ADN a las 3 horas después de la H
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2 tratamiento. Se cuantificó el nivel de exclusión de TERT para cada célula individual, ya sea como nuclear, si más de 75% de los de TERT total fue en el núcleo, o citoplásmica /mitocondrial si más de 75% de los de TERT estaba fuera del núcleo con las células restantes ser clasificado como una fenotipo intermedio.
Hemos encontrado una clara heterogeneidad de exclusión de TERT nuclear entre las células dentro de una población (Fig. 2A y S2A). Curiosamente, se encontró que las células que habían excluidos telomerasa 3 horas después del tratamiento no mostró ninguna o muy baja daño en el ADN, mientras que aquellos con la telomerasa nuclear tenía una cantidad significativamente mayor de daño en el ADN nuclear en las 3 líneas de células (Fig. 2). Además, las células con un patrón de exclusión intermedio mostraron un nivel de daño intermedia, siendo significativamente más alto que las células con telomerasa completamente excluido, pero no significativamente diferente de los que tienen la telomerasa predominantemente nuclear. Estos datos sugieren que un alto nivel de exclusión nuclear (& gt; 75%) que se requiere y la localización mitocondrial de t con el fin de ejercer su función de protección [10] - [15]. los niveles de daño de ADN absolutos fueron diferentes entre las líneas celulares 3 con las dos líneas celulares de cáncer que muestran los niveles de daño mucho más altas que de TERT sobre-expresión de fibroblastos. También se midió la intensidad de señal de TERT absolutos para las 3 localizaciones diferentes y se encontró que la señal de TERT mitocondrial fue siempre menor que en el núcleo o en el estado intermedio (Fig. S2B). Se había demostrado previamente que el nivel de proteína de TERT es el regulado dentro de la mitocondria después de H
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2 de tratamiento que podría explicar esta observación [19].
mientras que la telomerasa mitocondrial lo impide. A-C: Imágenes representativas de la localización de TERT (verde), y tinción γH2A.X (rojo). Azul: DAPI contratinción nuclear A: HeLa B: MCF7 C: células MRC-5 /hTERT. Las células fueron tratadas durante 3 h con 400 M H
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2. Se determinó la localización de TERT como se describe para la Figura 1B y agrupados en 3 categorías: de TERT nuclear (N) de TERT (C) y terc intermediario localización (I). Ejemplos para las 3 localizaciones diferentes se indican con flechas. D: La correlación entre la localización subcelular de TERT y nucleares de ADN de daños niveles (número de focos γH2A.X). Citoplasmática de localización de TERT se correlaciona con un bajo daño en el ADN nuclear en todas las líneas celulares, mientras que 3 TERT nucleares resultados de la localización de los daños nucleares de alta después de 3 h de tratamiento con 400 M H
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2. Intermediarias resultados de TERT de localización en los niveles de daño del ADN intermedios. Las barras negras: HeLa, barras rojas: MCF7, barras verdes: MRC-5 /hTERT. Las barras son media ± SE de al menos 40-100 células por línea celular en experimentos repetidos. * P & lt;.
0,05
Una correlación entre un mayor daño en el ADN en las células cancerosas y la telomerasa nuclearmente confinado incapaz de servicio de transporte debido a una mutación en su señal de exportación nuclear fue descrita recientemente por Kovalenko y colegas [13]. El de TERT mutada indujo un aumento en telomérica espontánea, así como daños en el ADN nuclear no telomérica en 2 líneas celulares de cáncer en comparación con las mismas células sin el mutante de TERT [13]. Además, las células de cáncer con una de TERT mutante que se limitan al núcleo y que no pueden lanzadera perdieron su capacidad de proliferación, no fueron capaces de formar colonias en agar blando y mostraron un aumento de la cantidad de daño en el ADN mitocondrial [13]. En conjunto, estos resultados sugieren que subcelular de vaivén de TERT podría tener importantes implicaciones para la sensibilidad de las células contra el daño en el ADN. Este aumento de la resistencia debido a la alta expresión de la telomerasa y la exclusión nuclear de terc podría favorecer la supervivencia de las células madre del cáncer que podrían resultar en la recaída después de la terapia [17]. También hay datos publicados anteriormente de un papel protector de t nuclear contra la apoptosis inducida por estaurosporina [9]. Sin embargo, la estaurosporina es un inhibidor de proteína quinasa que activa la apoptosis de una manera rápida sin inducir daño en el DNA e independiente de las mitocondrias. Por consiguiente, proponemos un mecanismo de acción diferente en ambos experimentos.
A continuación modelamos los diferentes localizaciones TERT por separado por sobre-expresión de vectores específicos de orgánulos nuclear y mitocondrial que expresa la subunidad catalítica de la telomerasa de TERT fusionado a una etiqueta myc en 3 líneas celulares de cáncer: HeLa, MCF7 y glioblastoma U87 (Fig. 3). Transitoriamente células transfectadas se trataron con H
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2 o irradiación y se analizaron los focos daño en el ADN y la localización de TERT γH2A.X utilizando la marca myc fusionado. La localización para mitocondrial (mito de TERT) y terc nuclear se muestra en la Fig. 3A y B (paneles superiores). No hubo diferencias en los niveles de daño de ADN entre las células transfectadas con o bien vector o células un-transfectadas antes del tratamiento. Sin embargo, hemos encontrado que en las 3 líneas celulares y ambos tratamientos, las células con una localización mitocondrial de TERT tuvieron significativamente menos daño en el ADN en comparación con las células que expresan ya sea nuclear o de TERT eran un-transfectadas (Fig. 3 A-D). Con el fin de excluir que la telomerasa endógena interactuado con la proteína tirador de TERT sobre-expresado repetimos el experimento en un SV40 inmortalizado línea celular MRC-5 que mantiene sus telómeros a través de un mecanismo de alargamiento alternativo [20]. la irradiación posterior, encontramos el mismo efecto protector de la telomerasa mitocondrial (Fig. 3 E). También usamos un anticuerpo contra 53BP1, otra proteína implicada en la respuesta al daño de ADN para confirmar los resultados de que los focos de daño de ADN son elevados en las células transfectadas con terc nuclear mientras que en contraste las transfectadas con terc mitocondrial ver menos daño en el ADN de las células un-transfectadas ( La Fig. S3).
H
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2 de tratamiento en comparación con la localización de TERT nuclear en 4 líneas celulares diferentes. R: Los vectores específicos de TERT Orgánulo transfectadas en células HeLa. Panel superior: imágenes representativas de las células transfectadas con vectores tirador de TERT mitocondrial y nuclear con y sin tratamiento con 200 M H
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2 durante 3 horas. tinción de TERT (usando myc-tag) fusionado a la proteína de TERT (verde) y tinción γH2A.X (rojo) para focos daño del ADN. Las flechas indican las células transfectadas. Panel inferior: La cuantificación de células con altos niveles de daño del ADN focos de células transfectadas y un-transfectadas con y sin H
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2 de tratamiento. Las barras son media ± SE de 3 experimentos independientes, * P & lt; 0,05. B: TERT vectores específicos Orgánulo transfectadas en células MCF7. Los paneles que se describen para A. C-F: La cuantificación de células con altos niveles de daño del ADN focos de células transfectadas y un-transfectadas con y sin irradiación X. C: MCF7 después de 20 Gy de irradiación X. D: U87 después de 20 Gy de irradiación X. E: MRC-5 /SV40 después de 10 Gy X-irradiación. Las barras se media ± SE de 3 experimentos independientes. * P & lt;.
0,05
Dado que se cree que altas cantidades de daño en el ADN nuclear para disminuir la supervivencia de las células se analiza si los tratamientos de estrés utilizados también pondría en peligro la supervivencia celular e inducir la apoptosis. Se han tratado las 3 líneas celulares transfectadas con ambos vectores tirador de TERT con H
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2 y X-irradiación y se determinó la inducción de apoptosis utilizando un anticuerpo contra activar la caspasa 3. Curiosamente, ni una sola célula transfectada con terc mitocondrial mostró ningún signo de apoptosis mientras que alrededor del 20% de las células transfectadas de las Naciones Unidas y entre el 40-60% de las células que expresan el tirador nuclear eran apoptóticas (Fig. 4). Este resultado confirma que, efectivamente, el daño del ADN inducido encuentra en las células con impactos de localización nuclear TERT directamente en la supervivencia celular, mientras que de TERT mitocondrial protege eficientemente contra la apoptosis. Con el fin de elucidar el mecanismo por el cual de TERT mitocondrial podría proteger las células de cáncer de daño en el ADN nuclear se midió la cantidad de ROS mitocondrial después de H
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2 de tratamiento e irradiación usando tinción MitoSOX como una medida de la generación de superóxido mitocondrial además a mYC-de TERT tinción de vectores "tirador" nuclear y mitocondrial en las mismas 3 líneas celulares de cáncer (Fig. 5 a-e). colorante MitoSOX es tomado por las mitocondrias en un potencial de membrana de manera específica. Con el fin de excluir que el potencial de membrana diferente causó los efectos, que mide el potencial de membrana mitocondrial en células HeLa y MCF7 transfectadas con ambos tiradores TERT y los comparó con las células un-transfectadas después de H
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2 tratamiento, así como X -irradiación. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores de un aumento del potencial de membrana mitocondrial en células MRC-5 /hTERT en comparación con los fibroblastos de los padres los resultados confirman un potencial de membrana significativamente mayor en las células que sobreexpresan de TERT mitocondrial, que está en células HeLa ya evidente incluso antes de cualquier tratamiento de estrés (Fig. S4). Por lo tanto, los niveles de MitoSOX se encuentran en nuestros experimentos realmente representan diferentes niveles de ROS que dependen de la localización de TERT. Se encontró que la sobreexpresión de TERT de mitocondrial en todos los tipos de células resultó en niveles de ROS significativamente más bajos después de H
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2 de tratamiento y la irradiación en comparación con las células de un-transfectadas o los que sobre-expresan de TERT nuclear (Fig. S4 )
imágenes representativas de la caspasa 3 activada (en rojo) en a:. Hela, B: MRC /SV40, C: células U87 transfectadas con terc Mito y terc nuclear (myc, que se muestra en verde) después de 400 M h
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2 de tratamiento durante 3 horas o irradiación con 20 Gy. D: Cuantificación del porcentaje de células apoptóticas de las líneas de células después de 3 H
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2 tratamiento, E: Cuantificación del porcentaje de células apoptóticas de las líneas de células después de 3 X-irradiación. Bares presentes media y el error estándar de alrededor de 45 células transfectadas por condición y la línea celular. * P & lt; 0,05
Panel superior:. Imágenes representativas de tinción ROS (rojo, MitoSOX) y la localización de TERT (myc-tag, verde) después de la transfección de TERT orgánulo específico y 100 M H
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2 de tratamiento durante 3 h en células HeLa. Fila superior: de TERT mito-, fila inferior: de TERT nuclear. Las flechas indican las células transfectadas. Panel inferior: La cuantificación de los niveles de ROS medidos como porcentaje del área MitoSOX positiva por parte de todo el citoplasma usando ImageJ en las células transfectadas y un-transfectadas. B: células MCF7, paneles como se ha descrito para A. C: Cuantificación de ROS en células U87 después de 3 h de 100 M H
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2 tratamiento. D-F: La cuantificación de los niveles de ROS después de la irradiación con rayos X. D: MCF7 después de 20 Gy de irradiación X. E: U87 después de 20 Gy de irradiación X-F: MRC-5 /SV40 después de 10 Gy de irradiación X. Las barras representan la media ± SE de 3 experimentos independientes. * P & lt;.
0,05
Una vez más hemos utilizado células /SV40-5 MRC sin telomerasa endógena para confirmar los resultados de las líneas celulares de cáncer de 3 y encontramos el mismo efecto protector de las mitocondrias, de TERT localizada en los niveles de ROS ( La Fig. 5F). los niveles de ROS en células que expresan el de TERT "tirador" nuclear eran por lo general no diferentes de las células un-transfectadas con la excepción de MCF7 y células MRC-5 /SV40 después de la irradiación, donde las células transfectadas tirador nuclear mostraron menores niveles de ROS que las células un-transfectado.
Estos datos sugieren que por shuttling en telomerasa mitocondrias /de TERT no sólo protege el orgánulo, pero por la disminución de la producción de superóxido mitocondrial también protege indirectamente el núcleo de daño del ADN. Observaciones similares de la telomerasa yendo y viniendo desde el nucleoplasma de nucleolos se había informado anteriormente con radiación ionizante en las células primarias y cáncer [21]. Los autores han especulado que la telomerasa podría interferir negativamente con las enzimas de reparación en el núcleo en condiciones de aumento de daño en el ADN y el estrés. Nuestros resultados parecen apoyar esta sugerencia de que la telomerasa podría ser "indeseable" dentro del núcleo en condiciones de daño en el ADN. La telomerasa se ha demostrado que "curar" cromosomas intentando una forma de la reparación del ADN mediante la adición de secuencias de telómero a roto extremos telómeros [22]. Sin embargo, esto podría no dar lugar a la reparación del ADN apropiado, como se conoce para ser llevado a cabo por los sistemas de reparación del ADN verdaderos.
Nuestros resultados demuestran que la localización mitocondrial de la telomerasa disminuye específicamente la generación de ROS mitocondrial y el estrés oxidativo celular después de la inducción de estrés exógeno generada por H
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2 o irradiación en las células cancerosas y por lo tanto podría prevenir el daño al ADN nuclear. También podría explicar por qué shuttling de la telomerasa a partir del núcleo a la mitocondria parece promover la supervivencia celular, mientras que en células en las que la telomerasa no es capaz de salir de la acumulación daño en el ADN núcleo se observa.
Diehn y sus colegas informaron recientemente de que el cáncer las células que producen menos ROS debido a una mayor expresión antioxidante acumulada menos daño en el ADN después de la radiación [23] ionizante madre. Sería interesante determinar si estas células también tienen la telomerasa más excluido que las células madre no cancerosas después de la irradiación. Se ha demostrado que las células madre de cáncer expresan alto nivel de actividad de la telomerasa; Sin embargo no se sabe nada acerca de TERT yendo y viniendo en estas células [24].
Hemos demostrado previamente que la generación de ROS exógeno por irradiación en los fibroblastos daña las mitocondrias y acelera el daño en el ADN nuclear de la creación de un circuito de retroalimentación positiva [25]. Sugerimos que una interacción funcional de este tipo entre las mitocondrias y el núcleo también existe en las células cancerosas y las células positivas otro telomerasa, donde la telomerasa entra mitocondrias con el fin de disminuir ROS que son inducidos por los fármacos quimioterapéuticos y de la irradiación. Por lo tanto, parece que los tratamientos contra el cáncer pueden inducir una novela, hasta ahora desconocido de mecanismo de vaivén de la telomerasa que previene el daño de ADN nuclear por la disminución de la generación de ROS mitocondrial a través de la inducción de la shuttling telomerasa. Debido a su patrón heterogéneo también podría explicar la resistencia de algunas, pero no todas, las células de cáncer contra tratamientos terapéuticos.
Materiales y Métodos
Las células
HeLa, MCF7, Las células U87 y MRC5 /SV40 se originaron a partir de ATCC. MRC5 se adquirieron de ECACC (Londres). la sobreexpresión de hTERT se realizó mediante transfección retroviral de hTERT como se describió anteriormente [10]. U 87 y MRC5 /SV40 células se cultivaron en MEM y DMEM suplementado con ácido respectivamente 1% no esencial amino, 10% de FCS (Sigma), glutamina 2 mM, y 1% de penicilina /estreptomicina. Todos los otros tipos de células se cultivaron en DMEM (PAA) que contiene 10% de FCS (SIGMA), 1% de penicilina /estreptomicina (PAA) y glutamato 2 mM (Gibco). Las células se incubaron a 37 ° C en oxígeno ambiental y 5% de CO
2.
Tratamientos
Las células se sembraron 1 o 2 días antes del tratamiento en 19 mm cubreobjetos en placas de 12 pocillos para la tinción de inmunofluorescencia (5 × 10
4 por pocillo).
H
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2 de tratamiento (SIGMA) se llevó a cabo en un medio libre de suero durante los tiempos y las concentraciones indicadas. La H se utiliza
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2 concentraciones había sido optimizada para cada tipo diferente de experimento. X-irradiación a 10 Gy y 20 se realizó usando un Faxitron (Elektron Technology, Reino Unido). Para todos los experimentos de irradiación (excepto análisis apoptosis) se fijaron las células y se analizaron 20 minutos después del tratamiento. Las células se fijaron utilizando paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min.
tinción de inmunofluorescencia e Imagen
Las células fueron fijadas en cubreobjetos utilizando paraformaldehído al 4% durante 10 min. inmuno-tinción simple o doble se realizó con los siguientes anticuerpos primarios: ratón γH2A.X (Upstate), de conejo anti-terc (Rockland), de conejo anti-Ki67 (Abcam) y anti-myc tag (Abcam). La especificidad y la falta de tinción de fondo del anticuerpo de TERT usado ha sido confirmada (Fig. S5). Los anticuerpos secundarios fueron: anti-ratón de cabra y conejo Alexafluor 594 y 488 (Molecular Probes /Invitrogen). Se observó tinción nuclear DAPI utilizando. Se obtuvieron imágenes para cada canal usando un microscopio AxioImager Z1 (Zeiss) equipado con cubos de filtros adecuados para espectralmente distinguir Alexafluor
488 y Alexafluor
594, asegurando que no bleedthrough en /de cualquiera de fluoróforo (establecido anteriormente, los datos no se muestran) . Las imágenes fueron analizadas posteriormente usando ImageJ. Los umbrales se definen para cada imagen individual.
confocal microscopía de fluorescencia y Co-localización Análisis
Las células se cargaron con 400 nM verde MitoTracker (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37 ° C antes de la fijación y después se tiñeron con anticuerpo anti-terc Alexa Fluor ® y 594. las imágenes fueron capturadas utilizando un Zeiss LSM 510 equipado con un objetivo NA 63 x 1.4 con el conjunto del agujero de alfiler a 1 unidad de Airy (Zeiss, Alemania). pilas Z se obtuvieron todos los 100 nm para cada celda (muestreo & gt; 2 x criterios de Nyquist). Las imágenes fueron deconvolved y luego analizados por objeto co-localización en 3D usando el software de Huygens (SVI, Países Bajos). Para el análisis de colocalización y preparación de imágenes, las imágenes deconvolved se transformaban en 3 volúmenes tridimensionales. Se aislaron las células individuales dentro de la imagen y se identificaron, objetos individuales unificadas (mitocondrial) y terc usando 'colocalización Objeto' en Huygens con un punto de corte para excluir objetos más pequeños de una mitocondria en el canal verde MitoTracker. Huygens calcula entonces coeficiente de correlación de Pearson para cada celda de 3 dimensiones colocalización entre las mitocondrias y tinción Terc. Esto nos permitió predecir con exactitud la verdadera colocalización (dentro de los límites de la limitación de difracción) de los dos tintes, independientemente de sus diferentes longitudes de onda.
orgánulos específicos de transfección
de TERT contienen vectores específicos de orgánulos nuclear y mitocondrial ( pCMV-myc-mitoTERT y pCMV-myc-nucTERT fueron una especie de regalo de J. Haendeler y Joachim Altschmied, Düsseldorf, Alemania y descritos anteriormente [9], [11]). La transfección transitoria se realizó utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EE.UU.) de los vectores de nuc-hTERT "disparadores" mito-terc e. Las eficiencias de transfección promedio de 48 horas después de la transfección fueron de entre 25 y 30%. Las células transfectadas transitoriamente se trataron 2 días después de la transfección ya sea con H
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2 o irradiación.
Determinación de ROS Nivel
Las células se tiñeron con 5 MitoSOX mu M (Invitrogen, EE.UU. ) durante 15 min después de H
2O
2 tratamiento o irradiación antes de la fijación y tinción de anticuerpos. los niveles de ROS se determinaron como el porcentaje de señal MitoSOX citoplasmática del total de la zona citoplasmática utilizando la imagen J (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Análisis de daños de ADN
Análisis del daño del ADN se realizó utilizando inmuno-fluorescencia, ya sea como una única tinción con γ-H2A.X o doble tinción con terc. Las células se fijaron, permeabilizaron con PBG (PBS, BSA, Fishskin gelatina y 0,5% de Triton) y el anticuerpo γ-H2A.X se aplicó a las células y luego teñidas con Alexa Fluor® 594. anti myc-tag y Alexa Fluor® 488 eran utilizado para visualizar la proteína de TERT transfectadas. Los portaobjetos se examinaron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovision (Zeiss, Alemania). Para el análisis de ADN daña el número de focos de daño en el ADN se contó para cada tipo de localización de TERT por separado de 20-40 células por grupo línea y celular.
Medición de TERT Exclusión Anote
Para cada célula individual, la localización de TERT se cuantificó manualmente mediante la comparación de las señales de la telomerasa en el interior y fuera del núcleo utilizando una imagen zonas J. subcelulares se determinaron para las regiones nucleares y citosólicas mediante el uso de la selección a mano alzada. señales de expresión de la región seleccionada se evaluaron utilizando la función de cálculo del área después de umbralización para eliminar el ruido. El resultado de cada célula individual indica un porcentaje de la señal de TERT se expresa en el compartimento subcelular:
% de TERT expresión nuclear = señal de TERT en la zona de núcleo /total de la señal de TERT × 100, España
% citoplasmática de TERT la expresión = señal de TERT en la zona de citosólica de la señal /de TERT total × 100. El porcentaje medio de localización nuclear y citoplasmática de t de al menos 30 células individuales fue tomada para determinar el porcentaje promedio de toda la población.
Correlación de celular de TERT y localización de ADN Nivel del daño
clasificado la localización de de TERT en 3 clases: de TERT nuclear (N): 75% -100% de la señal de TERT reside dentro del núcleo, de TERT citoplásmica (C): 75% -100% de la señal de TERT reside fuera del núcleo y todos los demás porcentajes para la clase de la localización intermedia (I). Para cada una de las 3 clases se determinó el número de focos γH2A.X de alrededor de 40-100 células por línea celular.
Análisis de Apoptosis
Hela, U87 y células /SV40 MRC se transfectaron con tirador de TERT nuclear y mitocondrial. Después de 2 días en que fueron tratados ya sea con 400 mM H
2O
2 o 20 Gy de irradiación y se dejaron durante 1 día más (U87 y MRC /SV40) o 2 días para HeLa debido a un retraso conocido en la inducción de la apoptosis en las estas células. Después las células se tiñeron con fijación myc-tag para de TERT y activan la caspasa 3 (Abcam) con el fin de marcar las células apoptóticas. Los resultados se han determinado a partir de 30-150 células transfectadas por línea celular y el estado.
Estadísticas
Una forma ANOVA se realizó a través de Sigma Plot (Systat Software Inc, EE.UU.).
Apoyo a la Información
Figura S1.
inmuno-blot de la fracción nuclear y mitocondrial en células HeLa y MCF7 tratados con 400 M H
2O
2 durante 5 días.