Extracto
Orientación metabolismo del tumor se está convirtiendo en una nueva e importante esfera de actividad farmacéutica. En consecuencia, una búsqueda sistemática para definir si existen dependencias fuente de energía específicos de tumores, y cómo éstas podrían ser dictadas por mutaciones genéticas de conducción de aguas arriba, se requiere. La vía de señalización de PI3K-AKT-mTOR tiene un papel seminal en la regulación de diversos procesos celulares incluyendo la proliferación celular y la supervivencia, pero también se ha asociado con la desregulación metabólica. En este estudio, hemos tratado de definir cómo las mutaciones dentro de
PI3KCA
pueden afectar la dependencia metabólica de una célula cancerosa, utilizando líneas celulares isogénicas creadas con tanta precisión. Los estudios revelaron la expresión de genes firmas en
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células mutantes indicativos de una regulación constante de la glucólisis. Curiosamente, los genes arriba y hacia abajo reguladas varió entre modelos isogénicas que sugieren que el nodo principal de la regulación no es la misma entre los modelos. También se observaron cambios adicionales de expresión de genes, lo que sugiere que las vías metabólicas distintas de la glucólisis, como glutaminolysis, también se vieron afectados. estudios sobre la dependencia de nutrientes revelaron que el crecimiento de los
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células mutantes es dependiente de la glucosa altamente, mientras que la dependencia de la glutamina es independiente de
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de estado. Además, la dependencia de la glucosa exhibido por
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células mutantes no podía ser anulado por la administración de suplementos con otros nutrientes. Esta dependencia específica de la glucosa para el crecimiento se ilustra además por los estudios que evalúan los efectos de la interrupción selectiva de la vía glucolítica utilizando siRNA y también se encontró a estar presentes a través de un panel más amplio de líneas celulares de cáncer de albergar endógenos
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mutaciones. En conclusión, hemos encontrado que
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mutaciones conducen a un cambio hacia un fenotipo altamente glucolítica, y que a pesar de las sugerencias de que las células cancerosas son expertos en la utilización de fuentes alternativas de nutrientes,
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células mutantes son no es capaz de compensar la retirada de la glucosa. La comprensión de las dependencias metabólicas de
PIK3CA
cánceres mutantes proporcionará información crítica para el diseño de terapias eficaces y estrategias de visualización del tumor
Visto:. Fomentar R, S Griffin, Grooby S, R Feltell, Christopherson C, Chang M, et al. (2012) Múltiple Alteraciones Metabólicas Existen en cánceres mutante PI3K, pero sólo la glucosa es esencial como fuente de nutrientes. PLoS ONE 7 (9): e45061. doi: 10.1371 /journal.pone.0045061
Editor: Jen-Tsan Ashley Chi, la Universidad de Duke, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Febrero, 2012; Aceptado: August 14, 2012; Publicado: 13 Septiembre 2012
Copyright: © Foster et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio no recibió ninguna financiación externa. El trabajo fue financiado en su totalidad por Horizon Descubrimiento Ltd y Celera Genomics como parte de un programa de investigación interna. Diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito se llevaron a cabo por los empleados de Horizon Descubrimiento Ltd y Celera Genomics
Conflicto de intereses:. Rebeccca Foster, Sue Griffin, Suzanne Grooby, Ruth y Feltell Chris Torrance son todos los empleados de Horizon Ltd. Descubrimiento Chris Torrance es co-fundador de Horizonte Descubrimiento Ltd y es miembro de la junta directiva. Cindy Christopherson, Mónica Chang, John Sninsky y Shirley Kwok son todos los empleados de Celera Genomics. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La vía PI3K-AKT-mTOR es una vía clave de señalización oncogénica y como tal tiene un papel central en la regulación de la proliferación celular, la supervivencia celular, la invasión de células de cáncer y la metástasis [1] - [3]. Hyper-activación de la vía es común en los cánceres humanos y se puede lograr en un número de maneras, incluyendo la mutación de
PIK3CA
.
PIK3CA
, el gen que codifica la subunidad alfa catalítica de la quinasa, está mutado en aproximadamente el 15% de los tumores colorrectales y aproximadamente el 30% de los cánceres de mama, con la mayoría de las mutaciones que ocurren en tres puntos de acceso,
E542K
,
E545K
y
H1047R
[4] - [9]. Las dos primeras mutaciones de punto de acceso,
E542K
y
E545K
, se encuentran en el exón 9, que se encuentra dentro del dominio helicoidal, mientras que
H1047R
, la mutación más frecuente en mama cáncer, se encuentra en el exón 20, que se encuentra dentro del dominio de quinasa. Las mutaciones dentro de las dos regiones conducen a la activación constitutiva de PI3K-AKT-mTOR señalización [3], [5], [10].
La vía PI3K-AKT-mTOR no sólo regula la proliferación celular y la supervivencia celular, pero es una vía importante en el control y regulación del metabolismo de cáncer [2], [11] - [15]. La integración de los cambios metabólicos con señalización proliferación es crucial para conferir una ventaja competitiva sobre una célula de cáncer, lo que resulta en la oncogénesis y la metástasis
.
análisis de expresión génica comparativo se llevó a cabo para un conjunto de genes que representan diferentes vías metabólicas que utilizan (A ) el par isogénica MCF10A PI3Kα (+ /+ y H1047R /+) y (B) el par isogénica HCT116 PI3Kα (+/- y H1047R /+). Ox Phosph, phosphorytion oxidativo; PPP, vía pentosa fosfato. Replicar los conjuntos de datos se han promediado y los cambios de expresión génica de las células mutantes PI3Kα se representan como factor de cambio en relación con las células de tipo salvaje PI3Kα. Glucólisis diferentes genes fueron reguladas como resultado de
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mutación en los diferentes modelos celulares.
adaptación metabólica de las células cancerosas es un fenómeno bien conocido, con los estudios realizados por Otto Warburg que demostraron las células cancerosas consumen glucosa a una tasa elevada incluso en presencia de oxígeno, permaneciendo seminal al campo (revisado [16] - [18]). alteraciones metabólicas no se limitan a resultar en cambios en la producción de energía, pero son fundamentales para la regulación de la producción de bloques de construcción macromoleculares requeridos por una célula y para el mantenimiento del equilibrio redox [16], [19] - [22]. Aunque la glucólisis aeróbica (el efecto Warburg) es la actividad metabólica más ampliamente documentado en tumores y líneas celulares de cáncer, las vías adicionales, tales como metabolismo de la glutamina mitocondrial y la síntesis de ácidos grasos cooperan para producir las macromoléculas necesarias para soportar el crecimiento celular continuo. De hecho, la glutamina contribuye a muchas tareas metabólicas centrales de la proliferación de células tumorales y a menudo sólo se considera secundaria a la glucosa en términos de importancia en el metabolismo de las células tumorales. La glutamina es el aminoácido más abundante en el plasma humano, y células de cáncer de metabolizar la glutamina en exceso de cualquier otro ácido amino [23] - [25]. No obstante, un número de estudios publicados han relacionado otras dependencias de aminoácidos con efectos metabólicos y la supervivencia de las células del cáncer [26] - [28]. Estos estudios ponen de relieve la naturaleza de nutrientes complejos y algo flexible del metabolismo del tumor, ya que las células cancerosas no sólo pueden adaptarse y cambiar entre diferentes vías metabólicas, sino también tener acceso simultáneo a múltiples nutrientes.
La vía de señalización, en gran parte a través de PI3K sus efectos sobre AKT y mTOR, se ha asociado con la regulación de una serie de efectos metabólicos, incluyendo la captación de glucosa, la estimulación del efecto Warburg, y el aumento de la síntesis de lípidos y proteínas [11], [29], [30]. la activación de Akt por ejemplo se ha demostrado que estimulan la glucólisis por aumento de la expresión y de la membrana translocación del transportador de glucosa GLUT4. AKT activa también actúa a través de GSK3 para regular la glucógeno sintasa y promover la asociación de hexoquinasa 2 con la membrana mitocondrial, donde hexoquinasa 2 puede fosforilar más fácilmente la glucosa [11], [13], [29] - [33].
expresión de la proteína se evaluó mediante transferencia de Western para confirmar datos de expresión génica tanto en (a) el par isogénica MCF10A PI3Kα (+ /+ y H1047R /+) y (B) el par isogénica HCT116 PI3Kα (+/- y H1047R /+ ) de las líneas celulares.
Mientras que los estudios históricos han demostrado conexiones entre la vía PI3K-AKT-mTOR y el metabolismo, los sistemas de modelos usados a menudo se han basado en comparaciones entre las líneas celulares que tienen varias diferencias genéticas o usados estrategias de traspaso de expresión que no son un reflejo de la genética tumorales del paciente. El enfoque predominante de la investigación se ha centrado en la influencia de la genética del tumor sobre el metabolismo de la glucosa. Sin embargo, las alteraciones genéticas también pueden dictar nutrientes alternativo y dependencias metabólicas.
Con el fin de explorar la forma endógena de
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mutaciones alteran específicamente las vías metabólicas y para comprender mejor si cualquiera de estos posibles cambios establecen terapéuticamente objeto de orientación dependencias metabólicas celulares, hemos realizado centró análisis metabólico de la expresión génica, la conmutación de nutrientes y siRNA experimentos utilizando modelos de línea celular isogénicas que son genéticamente idénticos, aparte de la estado de la mutación de la endógena
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gen.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Todo MCF10A y HCT116 X-MAN ™ líneas celulares isogénicas se obtuvieron a partir Horizonte Descubrimiento Ltd (http://www.horizondiscovery.com). La siguiente X-MAN ™ líneas celulares isogénicas se utilizaron en este estudio: MCF10A PI3Kα (H1047R /+), heterocigotos knock-in de
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dominio quinasa mutación activadora (HD 101-011); MCF10A PI3Kα (E545K /+), heterocigotos knock-in de
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dominio helicoidal mutación activadora (HD 101-002); HCT116 PI3Kα (+/-), ronda de
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dominio quinasa alelo mutante (
H1047R
) en células de los padres heterocigotos (HD 104-007). líneas celulares de sus padres, MCF10A PI3K (+ /+) y HCT116 PI3K (/+ H1047R) fueron también utilizados. Todas las líneas celulares isogénicas fueron creados usando recombinación homóloga rAAV mediada alterar con precisión y de forma estable objetivo loci genómico específico [3], [34]. Todas las líneas celulares isogénicas MCF10A se mantuvieron en DMEM /F12 (PAA) suplementado con 5% de suero de caballo (Invitrogen), 10 mg /ml de insulina (Sigma), 0,5 mg /ml de hidrocortisona (Sigma) y 0,1 g de toxina /ml cólera ( Sigma). células parentales MCF10A se suplementaron adicionalmente con 20 ng /ml hEGF (R & amp; D Systems). líneas celulares isogénicas HCT116 se mantuvieron en medios de McCoy 5A (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10% (PAA).
líneas celulares no isogénicas albergar
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mutaciones se adquirieron de ATCC (BT20 , DLD-1, MDA-MB-453 y RKO) y ECACC (MCF7 y T47D), y mantenido de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
isogénicas células MCF10A PI3Kα (+ /+, H1047R /+ y E545K /+) y HCT116 células isogénicas (+/- y H1047R /+) se cultivaron en medios que contienen glutamina 2 mM y las concentraciones indicadas de glucosa (a y B respectivamente), o en medios que contienen glucosa 25 mM y las concentraciones indicadas de glutamina ( C y D, respectivamente) durante 120 horas y el crecimiento celular evaluaron utilizando SRB. El crecimiento de cada línea celular se expresa en relación con el crecimiento en glucosa o glutamina 2 mM 25 mM (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01)
MCF10A PI3Kα (+ /+) y MCF10A PI3Kα. se hicieron crecer células (H1047R /+) durante 120 horas en medio que contenía glucosa 25 mM o sin glucosa como se indica. Todos los medios contenían glutamina 2 mM. Además, las células cultivadas sin glucosa se suplementaron con cualquiera de fructosa 0,5 mM (+ fruct), galactosa 10 mM (+ galact), suplemento de ácidos grasos de cultivo celular (+ FA) o 0,1 mM de ácido aspártico (+ AA). El crecimiento celular se evaluó mediante SRB.
MCF10A PI3Kα (+ /+) y MCF10A PI3Kα (H1047R /+) las células fueron transfectadas con siRNA no específica (NT) y 2 siRNA focalización individual
HK2
, HK2 A y B. HK2 (A) El crecimiento celular se evaluó 96 horas después de la transfección usando SRB. El crecimiento fue evaluado como un porcentaje de no específica de control (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01). (B) Desmontables de proteína HK2 se confirmó por transferencia de Western. HK1 Western Blot se realizó para confirmar la especificidad de la caída.
Las líneas celulares se cultivaron durante 120 horas en un medio que contiene glutamina 2 mM, y la concentración indicada de glucosa y el crecimiento evaluó a través de SRB. El crecimiento de cada línea celular se expresó como un porcentaje del crecimiento en glucosa 25 mM (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01)
Crecimiento de dependencia Ensayos
proliferación de las células. se evaluó sobre un período de 120 horas usando el sulforodamina B (SRB) de ensayo [35]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado en DMEM glucosa y glutamina libre (PAA) suplementado con la concentración requerida de glucosa (Sigma) y glutamina (PAA). líneas celulares isogénicas MCF10A se suplementaron adicionalmente con 5% de suero de caballo, 10 mg /ml de insulina, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 0,1 mg /ml la toxina del cólera y 0,2 ng /ml hEGF. Todas las demás líneas celulares se suplementaron con 10% de suero bovino fetal solamente. Cuando los medios de comunicación se indica también se complementó con fructosa 0,5 mM, galactosa 10 mM, 0,5 ml /l de cultivo celular suplemento de ácido graso o 0,1 mM de ácido aspártico (Sigma).
Expresión Génica Estudios
isogénica MCF10A líneas celulares fueron sembradas en 25 cm
2 frascos en medio DMEM /F12 suplementado con 5% de suero de caballo, 10 mg /ml de insulina, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 0,1 mg /ml la toxina del cólera y 0,2 ng /ml hEGF. líneas celulares isogénicas HCT116 se sembraron en 25 cm
2 frascos en medios de McCoy 5A suplementado con suero bovino fetal 10%. Después de 48 horas las células se recogieron por tripsinización y ARN prepararon usando el Kit RNeasy (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El ARN total se transcribió de forma inversa usando la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Los niveles de transcripción de 45 genes implicados en la glicólisis, glutaminolysis, vía pentosa fosfato, la fosforilación oxidativa, y el metabolismo de los lípidos fueron cuantificados por PCR en tiempo real junto con tres genes de normalización (
NUP214
,
ppig
y
SLU7
). 5 ng de ADNc se utilizaron por PCR. Las amplificaciones se realizaron con
ADN ΔZO5
polimerasa en un tampón que contiene 20 mM Tris pH7.85, mM KCl 30, MgCl 3 mM
2, 100 M dA, G, CTP, 200 dUTP m, 0.8units uracil N-glicosilasa, 6% de glicerol, 1X ROX, y 0,2X SYBR verde. Las reacciones se amplificaron en el Prism 7900 usando los siguientes parámetros de ciclo: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 12 minutos, seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Una piscina de referencia (ARN Universal Humanos de referencia, Stratagene) a 2,5 ng se amplificó con cada gen. Todas las amplificaciones se realizaron por duplicado. Se determinó
expresión génica utilizando el método 2 (-ΔΔCt) descrito por Livak y Schmittgen [36]. La expresión de un gen en
PIK3CA
células mutantes en relación con
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células de tipo salvaje se determinó utilizando la fórmula 2
(ΔΔCt PI3K-mutado ΔΔ Ct PI3K WT).
Western Blot
las células se lisaron en tampón de lisis TG en concentraciones de hielo y proteínas determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Sigma). Igual cantidad de proteína se cargaron en 10% geles de Bis-Tris resolvieron por electroforesis en SDS-PAGE y transferidos a una membrana de PVDF (Invitrogen). Las membranas se bloquearon en 5% w /v de leche en polvo sin grasa, solución salina tamponada con Tris 1x, 0,1% de Tween-20 durante 1 hora a temperatura ambiente y después se incubó en anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: Anti-GLUT1 (1:5000 dilución; Epitomics 2944-1), anti-GLUT5 (dilución 1:500; Santa Cruz ac-271 055), anti-hexoquinasa 1 (1:500 dilución; Cell Signalling Tecnología 2804), anti-hexoquinasa 2 (1:500-1000 dilución; señalización celular Tecnología 2106), anti-MCT4 (1:500; Millipore AB3314P), anti-fosfo-AKT (1:1000; Cell tecnología de señalización 9271) y anti -β-actina (1:500 000; Sigma A5441). Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado (Cell Signalling Technology) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se detectaron utilizando ECL-Plus (GE Healthcare) y la exposición a la película.
siRNA Estudios
ON-TARGETplus piscina no director siRNA (Dharmacon D-001810-10-20 #) y dos individuales en TARGETplus-siRNA contra la hexoquinasa 2 (Dharmacon#J-006735-06 y#J-006735-07) se transfectaron en células usando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante para la transfección adelante. complejos de transfección fueron dejados en las células durante 6 horas antes de reemplazar con medio de crecimiento. El crecimiento celular se determinó 96 horas después de la transfección usando el ensayo de SRB como se describe anteriormente. Hexoquinasa 2 desmontables se confirmó mediante transferencia de Western como se describe, con hexoquinasa 1 de expresión monitoreado para confirmar la especificidad de la caída.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de 2 vías seguido de pruebas múltiples de Bonferroni prueba de comparación. Para simplificar, los valores de p se representan como p & lt; 0,05 (*) op. & Lt; 0,01 (**) Sólo
Resultados
La presencia de una mutación activadora PIK3CA resultados en la expresión génica cambios asociados con el aumento de glicolítica Dependencia y metabólica adicional Camino alteraciones
Para caracterizar completamente la influencia de un
PIK3CA mutación en
alteraciones metabólicas como un todo, un conjunto de genes objetivo fue compilado en primer lugar, que representa a 45 genes de diferentes vías metabólicas tales como la glucólisis, la fosforilación oxidativa, glutaminolysis, vía pentosa fosfato y el metabolismo de ácidos grasos. a continuación, la expresión génica se analizó a través de muestras de ARN replicados, preparado a partir de dos sistemas modelo isogénicas. El primer sistema de modelo celular era un par no tumorigénicos celular de cáncer de línea compuesto de células de los padres MCF10A en el que PI3Kα es de tipo salvaje (WT), PI3Kα (+ /+) y MCF10A células en las que la mutación
H1047R
activación había sido introducido, PI3Kα (H1047R /+). La segunda fue una línea celular de cáncer de colon HCT116, que es heterocigótica para el
H1047R PIK3CA
mutación, PI3Kα (H1047R /+), se combina con células en las que el alelo mutante se ha golpeado de salida para hacer que las células funcionalmente WT, PI3Kα (+/-). Análisis de la expresión génica para el
PIK3CA
muestras de células mutantes respecto a
PIK3CA
células WT revelaron algunas alteraciones notables en los niveles de expresión de genes metabólicos. Mientras que los genes precisos arriba y hacia abajo-regulada en el
PIK3CA
células mutantes en comparación con
PIK3CA
WT diferían entre los dos sistemas de modelo celular, los cambios globales en la expresión de genes eran indicativos de un mayor fenotipo glucolítico aeróbica dentro de
PIK3CA
células mutantes. Introducción de una mutación activadora dentro de
PIK3CA
en las células MCF10A dado lugar a un aumento de la expresión de la enzima glucolítica tecla
hexoquinasa 2 gratis (
HK2
), y una disminución simultánea en expresión del transportador de fructosa,
GLUT5 gratis (Figura 1A). En el fondo de células de cáncer de colon HCT116, la presencia de un
PIK3CA
dio lugar a una elevada expresión del transportador de glucosa,
GLUT1 gratis (Figura 1B).
Otra expresión del gen mutado cambios como consecuencia de la presencia de un
PIK3CA
mutación sugieren que pueden existir alteraciones de rutas metabólicas adicionales. En MCF10A PI3Kα (H1047R /+) las células, el transportador de ácidos grasos
SLC27A1
demostraron una reducción de la expresión, con varios genes implicados en la fosforilación oxidativa también muestra la expresión reducida (Figura 1A). Los aumentos en la expresión de los genes, como
asparagina sintetasa y
(ASN) glutaminasa (GLS)
se ve constantemente en PI3Kα (H1047R /+), sugestivo de glutaminolysis elevada (Figura 1A y 1B).
los cambios en la expresión de mRNA fueron luego confirmados a nivel de proteínas, lo que demuestra niveles elevados de enzimas glucolíticas clave como HK2 y GLUT1, y, además, que revelan la regulación de la MCT4 lactato transportador en el MCF10A PI3Kα ( H1047R /+) células (Figura 2). La activación de la vía PI3K se confirmó tanto en modelos isogénicas como se muestra por la fosforilación de AKT.
crecimiento de células PIK3CA mutante es selectivamente Dependiendo de glucosa Mientras glutamina es esencial en ambos WT y PIK3CA células mutantes
los resultados del perfil de expresión génica fueron indicativos de una serie de alteraciones en el metabolismo celular como resultado de mutado
PIK3CA
, aumento de la glucólisis y específicamente glutaminolysis alterado. Para explorar la posibilidad de que las células pueden ser más dependiente no sólo de las vías específicas, sino también demostrar la dependencia fuente de nutrientes, se investigó el efecto del agotamiento de los nutrientes en el crecimiento celular, centrándose en la dependencia celular de glucosa y glutamina. Más de 120 horas, la retirada completa de la glucosa (en la presencia de glutamina) afectados negativamente la capacidad de MCF10A PI3Kα (H1047R /+) para proliferar y crecer, mientras que no tiene efecto sobre el crecimiento de MCF10A PI3Kα (+ /+) células (Figura 3A). Este impacto diferencial también es cierto para una segunda línea de células MCF10A que contiene una alternativa
PIK3CA mutación
, MCF10A PI3Kα (E545K /+) (Figura 3A). Asimismo, el crecimiento de HCT116 PI3Kα (H1047R /+) se vio afectado más gravemente tras el agotamiento de la glucosa y la retirada de HCT116 PI3Kα células (+/-) (Figura 3B). Esta observación sugiere que el
PIK3CA
células WT eran más capaces de tolerar la retirada de la glucosa que
PIK3CA
células mutantes, aunque en la presencia de glutamina. Para entender mejor la implicación de glutamina, se realizó una matriz de estudios, la evaluación de agotamiento de la glucosa y la retirada en relación con el agotamiento de la glutamina y la retirada. El crecimiento de las células MCF10A, independientemente de
PIK3CA
estado de la mutación se vio gravemente comprometida por la retirada completa de la glutamina, incluso en presencia de glucosa (Figura 3C). agotamiento parcial de glutamina también afectó negativamente el crecimiento de las células, pero el grado de dependencia no parece correlacionarse a
PIK3CA
estado de la mutación. Del mismo modo, la retirada completa glutamina comprometida severamente el crecimiento de las células HCT116. En contraste con las células MCF10A, las células HCT116 fueron más capaces de tolerar un nivel intermedio de la retirada glutamina, sin deterioro del crecimiento visto en cualquiera de
PIK3CA
WT o células mutantes (Figura 3D). El patrón de sensibilidad a la glucosa se mantuvo con este nivel intermedio de glutamina (Figura S1).
La glucosa dependencia exhibida por células PIK3CA mutante puede no ser anulado por la suplementación con otros nutrientes
Para más caracterizar el fenotipo glucolítico y aparente dependencia de la glucosa
PIK3CA
células mutantes, se utilizó el sistema de modelo isogénicas MCF10A para evaluar si las fuentes alternativas de nutrientes podrían compensar la glucosa y anular la dependencia. Cambio de la fuente de nutrientes con un monosacárido alternativo (fructosa o galactosa) fue incapaz de compensar la retirada de la glucosa en MCF10A PI3Kα células (H1047R /+), mientras que las células de crecimiento de MCF10A PI3Kα (+ /+) no se vio afectado por la eliminación de la conmutación de la glucosa o de nutrientes (Figura 4). Puesto que los datos de expresión génica sugerido que
PIK3CA
células mutantes pueden tener alteraciones en las rutas metabólicas distintas a la glucólisis, se investigó más a fondo si la dependencia del crecimiento de la glucosa podría ser anulado por la suplementación con nutrientes que pueden promover estas vías alternativas. Sobre la base de los cambios de expresión de genes en la asparagina sintetasa y los transportadores de ácidos grasos, que se complementó células con ácido aspártico o una mezcla de ácidos grasos. Ni suplemento fue capaz de anular los efectos de la retirada de la glucosa en el crecimiento de MCF10A PI3Kα (H1047R /+) células (Figura 4). Se observaron resultados similares cuando el MCF10A PI3Kα (E545K /+) y HCT116 PI3Kα (H1047R /+) fueron perfilados células (Figura S2).
La interrupción de la glicolítica Camino Demuestra efectos antiproliferativos en las células mutantes PIK3CA
el MCF10A PI3Kα (H1047R /+) células muestran un alto nivel de dependencia de la glucosa y son incapaces de compensar la ausencia de la glucosa mediante la utilización de otros nutrientes. En conjunto con nuestro datos que demuestren que
PIK3CA
células mutantes muestran una mayor expresión de la enzima clave HK2 la glucólisis, la hipótesis de que la interrupción de la vía glucolítica debe ser suficiente, incluso en presencia de glucosa, para inhibir el crecimiento de la células mutantes. Por lo tanto, se evaluaron los efectos de la alteración dirigida de la glucólisis utilizando dos moléculas de siRNA para derribar los niveles de HK2 en las células MCF10A isogénicas. El uso de una molécula no específica siRNA como control, encontramos que desmontables HK2 específica en efecto, da lugar a efectos antiproliferativos, selectivo para el
PIK3CA
células mutantes (Figura 5A). Caída de los niveles de proteína en tanto HK2
PIK3CA
WT y células mutantes líneas se confirmó por Western Blot (Figura 5B), con especificidad de derribo confirmado mediante el control de la expresión HK1.
La glucosa se ve en dependencia otras líneas celulares de cáncer Albergar endógeno las mutaciones PIK3CA
Nuestras investigaciones han utilizado un sistema preciso y definido genéticamente para investigar los efectos de un
PIK3CA
mutación sobre el metabolismo celular en forma aislada. Hemos ampliado nuestros estudios para comprender si estos hallazgos eran verdad a través de un panel más amplio de líneas celulares de cáncer. Por lo tanto, se determinó la dependencia del crecimiento de la glucosa de seis líneas celulares de cáncer de colon y de mama, que contiene toda endógena de
PIK3CA
mutaciones (Tabla 1). Sin embargo, estas líneas también tienen la salvedad de que tiene un número de otras diferencias genéticas, que pueden modular o evitar la dependencia de la glucosa putativo determinado de células-sistemas isogénicas. La medida en que el crecimiento se vio afectada varió entre las líneas, con 3 de las 6 líneas celulares (T47D, BT20 y DLD-1) que demuestran un crecimiento reducido tras el agotamiento de la glucosa parcial (Figura 6). Sin embargo, el crecimiento de todas las 6 líneas celulares se vio comprometida por la retirada completa de la glucosa incluso en la presencia de glutamina, apoyando el concepto de que
PIK3CA
cánceres mutantes dependen en gran medida de glucosa para apoyar el crecimiento celular.
Discusión
el interés en el estudio del metabolismo del cáncer y el desarrollo de agentes metabólicos apuntado como terapias ha crecido en los últimos años, y por lo tanto una mejor comprensión del metabolismo único de las células cancerosas es imperativo para el diseño de fármacos eficaces y el tratamiento racional de los pacientes , así como la etiqueta de visualización de nutrientes y el tratamiento de vigilancia de respuesta. A pesar de la activación de la vía PI3K-AKT-mTOR ser una característica común de muchos tipos de cáncer, y la activación de esta vía está asociada con la regulación de una serie de efectos metabólicos, perfiles integral de la consecuencia de
PIK3CA
mutaciones sobre metabólica dependencias no se ha estudiado. Mediante el uso de modelos celulares isogénicas genéticamente definidos, hemos sido capaces de definir con precisión como
PIK3CA
mutaciones pueden influir en las rutas metabólicas dentro de un tumor.
La regulación de los procesos metabólicos y la utilización de los nutrientes son procesos complejos. La expresión de genes en este estudio ha revelado que la consecuencia general de
PIK3CA mutaciones
es un cambio hacia un mayor fenotipo glucolítico. Sin embargo, la forma exacta a efectos celulares este cambio puede variar. En lugar de una única molécula de limitación de velocidad, varios pasos que crean una "vía de reglamentación 'pueden compartir el control homeostático del metabolismo energético. el control de varios pasos se destacó por el diferencial de genes sobre regulación de las enzimas clave glucólisis en los diferentes modelos isogénicas. Aunque se observaron diferencias, el efecto neto es sugestiva de la regulación de la glucólisis en ambos casos. Este vínculo entre la
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mutaciones pertinentes a los pacientes y que resulta fenotipo glucolítico es consistente con estudios previos que han asociado la activación de la vía de señalización AKT con la estimulación del efecto Warburg [11], [13]. Este concepto se basa en y fortalecido por haber revelado una clara dependencia de
PIK3CA
células mutantes de la glucosa para el crecimiento continuo. A pesar de las sugerencias de que las células cancerosas son expertos en la utilización de otras fuentes de nutrientes, este estudio ha demostrado que
PIK3CA
células mutantes no son fácilmente capaces de compensar la retirada de la glucosa, ya sea a través del uso de la glutamina, monosacáridos alternativos u otros nutrientes. La dependencia de la glucosa para el crecimiento también se demostró a través de un panel más amplio de líneas celulares de cáncer de albergar endógenos
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mutaciones. Los resultados de este estudio podrían proporcionar información crítica para el diseño de estrategias terapéuticas, ya que han puesto de relieve nodos críticos dentro de las vías metabólicas que pueden ser clave para apuntar. De hecho, desmontables estudios confirmaron que la orientación de la vía glucolítica resultados interrupción en los efectos antiproliferativos, específicos para
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células mutantes, lo que sugiere que esto podría ser una estrategia terapéutica para dirigir específicamente a los pacientes con
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tumores mutantes. La dependencia de la glucosa abierta de células con esta mutación también ofrece rutas de imagen no invasiva de los tumores activados vía PI3K.
A través de la caracterización del fenotipo metabólico de las células isogénicas genéticamente compatibles, hemos sido capaces de definir el metabólica consecuencias de una única alteración genética ingeniería, en este caso, una mutación activadora en el
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gen. Al tiempo que confirma que la activación de la vía PI3K-AKT resultados-mTOR en un aumento del fenotipo glucolítico, también hemos demostrado una dependencia específica para
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células mutadas sobre la glucosa e ilustrado que la orientación de esta vía ofrece un potencial terapéutico y visualización de tumores perspicacia.
Apoyo a la Información
Figura S1.
sensibilidad a la glucosa de HCT116 PI3Kα (H1047R /+) las células se mantuvo cuando se cultivan en medios glutamina 0,5 mM. células isogénicas HCT116 (+/- y H1047R /+) se cultivaron durante 120 horas en medio que contenía glutamina 0,5 mM y las concentraciones indicadas de glucosa. El crecimiento celular se evaluó mediante tinción con SRB. El crecimiento de cada línea celular se expresa en relación al crecimiento en medios que contienen glutamina 0,5 mM y glucosa 25 mM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0045061.s001
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Figura S2. Francia El dependencia de la glucosa de
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células mutantes no puede ser anulado por la suplementación con nutrientes alternativos. células isogénicas MCF10A PI3Kα (+ /+ y E545K /+) y células HCT116 isogénicas (+/- y H1047R /+) se cultivaron durante 120 horas en medio que contiene glutamina 2 mM y las concentraciones indicadas de glucosa (A y B respectivamente). Además, las células cultivadas sin glucosa fueron suplementados ya sea con suplemento de ácidos grasos de cultivo celular (+ FA) o 0,1 mM de ácido aspártico (+ AA). El crecimiento celular se evaluó mediante tinción con SRB
doi:. 10.1371 /journal.pone.0045061.s002 gratis (TIF)