Extracto
La mayoría de los pacientes tratados con inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (EGFR-TKI) con el tiempo desarrollar resistencia adquirida. La pérdida de expresión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) proteína de unión-3 (IGFBP-3) ha sido sugerido como un posible mecanismo de resistencia a EGFR-TKI en el A431 y líneas de células HN11. A continuación, se investigó la IGFBP-3 en dos líneas celulares de cáncer de pulmón EGFR mutantes con resistencia a EGFR-TKI y examinamos el valor de la concentración sérica de IGFBP-3 como marcador de resistencia. También se evaluó el efecto de la inducción o supresión de la IGFBP-3 expresión en la resistencia. Se establecieron HCC827 sublíneas con resistencia a gefitinib (HCC827 /GR) y erlotinib (HCC827 /ER). La pérdida de la IGFBP-3 se detectó expresión por transferencia Western en ambas líneas celulares sin cambios en la actividad transcripcional, y ELISA mostró cantidades significativamente menores de IGFBP-3 secretada en los medios de cultivo de las líneas celulares mutantes que en la de la línea parental. A pesar de la pérdida de la IGFBP-3 expresión, actividad de señalización IGFR se mantuvo sin cambios. La expresión forzada de IGFBP-3 por transfección mediada por adenovirus o IGFBP-3 recombinante aumentó ligeramente los efectos inhibidores del crecimiento y apoptóticos de EGFR-TKI, mientras que la supresión de la IGFBP-3 no afectó a la sensibilidad a EGFR-TKI. Serum IGFBP-3 niveles medidos por ELISA antes y después del desarrollo de resistencia a EGFR-TKI en 20 pacientes no mostró cambios significativos (1815,3 ± 94,6 ng /ml antes del tratamiento frente a 1778,9 ± 87,8 ng /ml después de la resistencia EGFR-TKI). En resumen, aunque IGFBP-3 regulación a la baja se asocia con la adquisición de resistencia a EGFR-TKI independientemente del mecanismo, su efecto sobre la resistencia no fue significativa, lo que indica que la IGFBP-3 puede no jugar un papel importante en la resistencia a EGFR-TKI y concentración sérica de IGFBP-3 no es un indicador fiable de la resistencia
Visto:. Choi YJ, Parque GM, Rho JK, Kim SY, GS Así, Kim HR, et al. (2013) Papel de la proteína IGF-3 de unión en la resistencia de las células EGFR mutante del cáncer de pulmón de EGFR inhibidores de tirosina cinasa. PLoS ONE 8 (12): e81393. doi: 10.1371 /journal.pone.0081393
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 13 de mayo de 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: 5 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca (2011-467) del Instituto Asan de Ciencias de la vida, Seúl, Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
EGFR es un receptor transmembrana que pertenece a una familia de cuatro proteínas relacionadas, EGFR (ErbB-1), HER2 /neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) y HER4 (ErbB-4) [1]. Tras la unión del ligando, las formas de EGFR homo o heterodímeros con otros receptores ErbB que conducen a la activación de cascadas de señalización intracelular. Los dos principales vías intracelulares activadas por EGFR son la vía RAS-RAF-MEK-MAPK, que controla la proliferación de la transcripción de genes, la progresión del ciclo celular y la célula, y de la vía PI3K-Akt, que activa una cascada de señales anti-apoptóticas y prosupervivencia . [2]
no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) que albergan mutaciones activadoras y /o amplificación del locus EGFR son particularmente sensibles a los inhibidores de quinasa del EGFR-tirosina (TKIs), tales como gefitinib (Iressa; AstraZeneca Internacional) y erlotinib (Tarceva; OSI Pharmaceuticals) [3] - [9]. Aproximadamente el 70-80% de NSCLC que albergan una mutación somática en el dominio tirosina quinasa del responden gen EGFR a gefitinib /erlotinib [3], [4], [10]. Sin embargo, la resistencia adquirida a la terapia de TKI del EGFR-casi siempre se desarrolla después de una mediana de aproximadamente 10 meses desde el inicio del tratamiento, incluso en pacientes que presentan una respuesta dramática inicial a estos agentes. La resistencia adquirida se ha asociado con una mutación secundaria en el gen EGFR, T790M [11], [12], que ha sido detectado en aproximadamente el 50% de los cánceres con resistencia adquirida a EGFR-TKI [13], [14]. Además, la amplificación del oncogén MET fue identificado como otro mecanismo de resistencia adquirida mediada por la fosforilación de ErbB-3 y la consiguiente activación de PI3K [15], [16]. Del mismo modo, la sobreexpresión de la quinasa AXL se ha asociado con la resistencia a EGFR-TKI [17].
En un estudio reciente, la pérdida de la expresión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -la proteína de unión 3 (IGFBP 3) se ha sugerido como un posible mecanismo de resistencia en el A431 y líneas de células HN11 [18]. En ese estudio, la resistencia a EGFR-TKI adquirida fue modelada usando la línea celular de cáncer epidermoide A431, que alberga tipo salvaje amplificación del gen EGFR. La línea celular A431 gefitinib resistente A431 GR mantiene la señalización de PI3K en presencia de gefitinib mediante la activación de la vía del receptor IGF1 (IGF1R). La inhibición de la señalización de IGF1R restauró la capacidad de gefitinib para regular a la baja de señalización PI3K /Akt e inhibir el crecimiento de células A431 GR. Los análisis de expresión de genes mostró downregulation significativa de IGFBP-3 en células A431 GR, y la adición de IGFBP-3 recombinante restauró la capacidad de gefitinib para regular a la baja PI3K señalización /Akt y para inhibir el crecimiento celular. En un modelo diferente de resistencia a gefitinib adquirida establecido en el EGFR de tipo salvaje sensible a gefitinib expresar HN11 línea celular de cáncer de cabeza y cuello, la fosforilación de Akt se mantuvo en presencia de gefitinib, y la resistencia fue superada por EGFR y la inhibición combinada de IGF1R. En conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida de expresión de IGFBP en células tumorales tratadas con resultados EGFR-TKIs en la activación de la señalización de IGF1R, que a su vez media la resistencia a antagonistas de EGFR. Por lo tanto, se combina la inhibición terapéutica de EGFR y IGF1R puede derogar este mecanismo de resistencia adquiridos de drogas. Sin embargo, un modelo de resistencia adquirida a gefitinib no se ha desarrollado en células de cáncer de pulmón EGFR mutante, que es de importancia clínica.
La mayoría de los circulantes de IGF-1 se une al director de la proteína de unión a IGF-, IGFBP 3 [19]. concentraciones de IGF-1 en suero y IGFBP-3 se pueden medir fácilmente y podrían ser de valor como indicadores de riesgo de cáncer. Los estudios epidemiológicos han demostrado están asociados de forma independiente con un alto riesgo de cánceres comunes, como el cáncer de pulmón [20] que la alta IGF-1 y bajos niveles de IGFBP-3. IGFBP-3 se ha sugerido como un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer de pulmón, como la sobreexpresión mediada por adenovirus de IGFBP-3 inhibió el crecimiento de células de NSCLC in vitro e in vivo mediante la inducción de apoptosis a través de la inhibición de la PI3K /Akt /PKB y MAPK vías de señalización [21].
en el presente estudio, la expresión de IGFBP-3 se examinó en células de cáncer de pulmón EGFR mutante con resistencia adquirida a EGFR-TKI, y el valor de la concentración sérica de IGFBP-3 se evaluó como una marcador de resistencia. También se evaluó el efecto de la IGFBP-3 inducida en la superación de la resistencia.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
La línea celular HCC827 se adquirió en la American Type Culture Americana Collection (ATCC: Rockville, MD, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina y 100 unidades /ml de penicilina y estreptomicina, y se mantuvo a 37 ° C en una cámara humidificada que contiene 5% de CO
2. Gefitinib y erlotinib fueron la compra de productos químicos Selleck (Houston, TX, EE.UU.). IGFBP-3 humana recombinante (rh IGFBP-3) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El vector adenoviral que expresa humana IGFBP-3 (Ad /IGFBP3) fue proporcionado amablemente por el Dr. Ho-Young Lee (La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center) [21].
Establecimiento de la Gefitinib- y erlotinib Líneas celulares resistentes
gefitinib y erlotinib variantes resistentes de HCC827 se aislaron por la exposición paso a paso a dosis crecientes de gefitinib y erlotinib. HCC827 células fueron tratadas con 10 nM gefitinib y erlotinib para 72 h. Las células fueron expuestas continuamente a aumentar las concentraciones de fármaco de hasta 1 M durante 8 meses. EGFR-TKI-resistentes colonias fueron seleccionados a concentraciones de exposición de 5 micras y con los dos clones aislados fueron designados como HCC827 /GR y HCC827 /ER, respectivamente. Generación de línea celular HCC827 /ER se ha descrito anteriormente [17]. Las células resistentes se mantuvieron en medio libre de fármaco durante al menos 2 semanas antes de los experimentos para eliminar los efectos de los fármacos.
viabilidad celular Ensayo
Se midió la viabilidad de las células utilizando el MTT ensayo y el recuento de células con azul de tripano. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos estériles de plástico y se expusieron a concentraciones variables de los fármacos en medio que contiene 1% de FBS. Después de 72 h, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) se añadió solución y formazan cristalino se solubilizaron con una solución de dodecilsulfato de sodio (SDS).
los efectos de la combinación se evaluaron con el recuento de células con azul de tripano. células HCC827 /GR y HCC827 /ER se sembraron en placas de 60 mm y se trataron con EGFR-TKI y Ad infección /IGFBP-3 o rh IGFBP-3 durante 72 h en medio que contiene 1% de FBS. Los números de células se determinaron con un contador de células automático ADAM-MC (NanoEnTek, Seúl, Corea), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y las barras de error significan desviaciones estándar (DE).
Western Blot
Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida-SDS, y electrotransferred a membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Se obtuvieron los anticuerpos específicos para p-EGFR, EGFR, MET, Her2, Her3, IGF1R, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, Axl, IGFBP-3 y actina de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), y los de p-HER2, ErbB3-p, p-MET y p-IGF1R (Tyr1131 y Tyr1135 /1136) de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). Las proteínas se detectaron con un aumento de quimioluminiscencia kit de transferencia de Western (Amersham Biosciences, NJ, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
semi-cuantitativa reacción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
aislamiento de ARN total y la síntesis de cDNA se realizaron utilizando el protocolo de RNA mini-kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) y el reactivo mezcla AccuPower RT, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bioneer Corp., Seúl, Corea). Las secuencias de oligonucleótidos para la amplificación fueron las siguientes: cebador directo, 5 'ATATGGTCCCTGCCGTAGA-3', y cebador inverso, 5 'AAATCGAGGCTGTAGCCAG-3', para IGFBP-3; cebador directo, 5'-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 'y el cebador inverso, 5'-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3', para β-actina.
La transfección de ARN interferente pequeño
pequeños ARN de interferencia (siRNA ) oligonucleótidos específicos de IGFBP-3 se obtuvieron de Thermo (Thermo Electron Corp., Waltham, MA; IGFBP-3 siRNA-1) y Qiagen (IGFBP-3 siRNA-2). Transfección de ARNsi se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. expresión del gen diana se midió 24 h más tarde mediante análisis de Western blot. Para el ensayo de MTT, se sembraron las células en placas de 96 pocillos después de siRNA transfección, después se trataron con los fármacos indicados para 72 h.
ELISA para suero IGFBP-3 ELISA
suero residual después de la rutina se recogió examen de química de 20 pacientes antes de la terapia EGFR-TKI y después de la adquisición de resistencia a EGFR-TKI con el consentimiento informado por escrito. Se almacenó a -80 ° C hasta el ensayo. IGFBP-3 concentraciones en el medio de cultivo celular y en suero se midieron usando un IGFBP-3 humana kit ELISA (R & amp; D Systems, MM, USA) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero se diluyeron a 1:100 en tampón diluyente incluido en el kit y se analizaron por duplicado. Este ensayo se realizó en un laboratorio de investigación de Asan Medical Center y el protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Asan (IRB n; 2010-0267)
Análisis estadístico
. a menos que se indique lo contrario, todos los valores se dan como media ± desviación estándar para las variables continuas o frecuencias y porcentajes para las variables categóricas. Las variables continuas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS (versión 12.0, SPSS-IBM, Armonk, Nueva York).
Resultados
Establecimiento y caracterización de gefitinib y erlotinib HCC827 Las células resistentes con una mutación por deleción del exón 19 del EGFR gene
Dos sublíneas EGFR-TKI-resistentes, HCC827 /GR y HCC827 /ER, se establecieron a partir de células parentales HCC827 por la exposición continua a gefitinib y erlotinib en un período de 8 meses. Los efectos de erlotinib sobre la viabilidad celular se determinó con el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura 1, el IC
50 valores para gefitinib y erlotinib fueron 1.000 veces mayor en la HCC827 GR y de células HCC827 /ER /líneas que en las células parentales HCC827, y las sublíneas EGFR-TKI resistentes exhibió cruzada resistencia a cada inhibidor. La expresión y la fosforilación de proteínas relacionadas con la señalización de EGFR-implicados en la sensibilidad a EGFR-TKI se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. expresión de MET y la activación se incrementaron en HCC827 /células de GR (Figura 2A) que alberga la amplificación del gen MET (datos no mostrados), lo que sugiere que la amplificación MET contribuye a la resistencia en las células HCC827 /GR. Esto fue apoyado por el tratamiento de combinación con EGFR-TKI y PHA665752, un inhibidor de MET, que suprime eficazmente el crecimiento de células HCC827 /GR (datos no mostrados). En HCC827 células /ER, se downregulated total y EGFR activado, y los niveles de receptor HER2, HER3 y MET fueron significativamente inferiores a los de las células parentales (Figura 2A). Sin embargo, la expresión de la quinasa Axl fue significativamente mayor en las células HCC827 /ER que en la línea parental, como se informa en nuestro estudio anterior (17). La mutación T790M secundaria no se detectó en los HCC827 /GR y de células HCC827 /ER líneas por secuenciación (datos no mostrados). Para evaluar los efectos inhibidores de EGFR-TKI en MET más, EGFR y sus señales descendentes, HCC827, HCC827 /GR y las células HCC827 /ER fueron tratados con gefitinib y erlotinib durante 72 h. Como se muestra en la Figura 2B y C, la EGFR-TKI inhibe la fosforilación de EGFR en las células de los padres y resistentes pero no suprimió la activación de Met en HCC827 /GR, que difería de las otras líneas celulares; la señalización Akt aguas abajo se activó de forma persistente en las sublíneas resistentes HCC827 /GR y HCC827 /ER.
células
HCC827, HCC827 /GR y HCC827 /ER2 se trataron con las concentraciones indicadas de gefitinib y erlotinib durante 72 h en medio que contiene 1% de FBS. La viabilidad celular e IC
50 valores se determinaron utilizando el ensayo MTT.
(A) La expresión basal de EGFR y moléculas de señalización en HCC827 relacionados con EGFR, las células HCC827 /GR y HCC827 /ER eran evaluado mediante transferencia de Western. También se examinaron los efectos de gefitinib (B) y erlotinib (C) en la señalización relacionada con EGFR. células HCC827, HCC827 /GR y HCC827 /ER fueron tratados con 0,1 y 1 M gefitinib y erlotinib durante 72 h en medio que contiene 1% de FBS. Proteínas (30 g) a partir de lisados de células se sometió a análisis de Western blot de las proteínas indicadas.
Pérdida de IGFBP-3 en HCC827 /GR y Células /ER HCC827
Evaluación de la IGFBP-3 de expresión y de IGF1 R señalización en líneas celulares de sus padres y resistentes mostraron que la IGFBP-3 de expresión se downregulated significativamente en HCC827 /GR y células /ER HCC827; sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en IGF1R total y activa entre las células resistentes y parentales (Figura 2). IGFBP-3 secreción se redujo significativamente en las células HCC827 /GR y HCC827 /ER en paralelo con su disminución del nivel de expresión (Figura 3B). Sin embargo, no hay correlación entre la proteína IGFBP-3 y los niveles de mRNA se detectó (Figura 3A), lo que sugiere que la regulación a la baja de IGFBP-3 se produce a nivel post-transcripcional.
IGFBP-3 mRNA (A) y se secreta IGFBP-3 (B) se determinaron por RT-PCR y ELISA en HCC827, HCC827 /GR y HCC827 /ER. El ELISA se repitió tres veces y las barras de error representan la desviación estándar (SD). *
P
. & Lt; 0,001 en comparación con las células HCC827
La sensibilidad a EGFR-TKI en las células resistentes no fue restaurada por inducción de la IGFBP-3
Para investigar la participación de IGFBP-3 en la resistencia a EGFR-TKI, las células HCC827 /GR fueron modelo de infectados o infectados con Ad /IGFBP-3, y la inducción de la expresión de IGFBP-3 se evaluó por transferencia Western. Como se muestra en la Figura 4A, IGFBP-3 niveles fueron significativamente mayores en HCC827 /células GR infectados con diversos títulos de ad /IGFBP-3 que en las células infectadas, lo cual fue confirmado mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-flag. Por otra parte, IGFBP-3 secreción en el medio de cultivo de HCC827 infectado /GR y HCC827 /ER se aumentó como se mide por ELISA (Figura 4B). Para examinar el efecto de EGFR-TKI de IGFBP-3 células que sobreexpresan, las células fueron infectadas con Ad /IGFBP-3 a 100 MOI y tratados con EGFR-TKI. Sin embargo, co-tratamiento con Ad /IGFBP-3 y EGFR-TKI no inhibe eficazmente la proliferación celular (Figura 4C). Para examinar el papel de IGFBP-3 en la resistencia adicional, las células HCC827 /GR y HCC827 /ER fueron tratados con 1 mg /ml recombinante humana (rh) IGFBP-3 y 1 M EGFR-TKI por 72 h. El tratamiento combinado resultó en la inhibición del crecimiento modesto en HCC827 /GR y HCC827 /ER (37,0% y 32,8%, respectivamente) a pesar de la alta concentración de rh IGFBP-3 (Figura 4D). Aunque la restauración de la IGFBP-3 inhibió la actividad de IGF1R, no podría reducir la actividad de Akt (Figura 4E y F). Del mismo modo, la supresión de la IGFBP-3 mejorado ligeramente la actividad IGF1R (datos no presentados), pero la sensibilidad a EGFR-TKI no se vio afectada (Figura 4G y H). Estos resultados mostraron que a pesar de la inducción de la IGFBP-3 aumentó ligeramente el efecto de EGFR-TKI, era insuficiente para vencer la resistencia adquirida-EGFR-TKI, lo que indica que la pérdida de IGFP-3 puede no ser el principal mecanismo de resistencia en HCC827 células.
Las células resistentes se infectaron con Ad /IGFBP-3 a MOIs de 0 a 100 UFP /célula durante 48 h y IGFBP-3 de expresión se determinó por transferencia Western (a) y ELISA (B). (C) HCC827 /GR y células HCC827 /ER se trataron con la concentración indicada de EGFR-TKI durante 72 h después de la infección con 100 MOI de Ad /IGFBP-3. HCC827 células /GR y HCC827 /ER (D) fueron tratados con 1 mM de EGFR-TKI y 1 mg /ml de rh IGFBP-3 durante 72 h. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes, y las barras de error representan la desviación estándar (DE). Las células (E y F) fueron tratados con drogas, rh IGFBP-3 o Ad /IGFBP-3 como en el panel C y D. Después de 24 h, se recogieron las células y la modulación de EGFR y IGF1R señalización en las líneas celulares indicadas se detectó mediante transferencia Western. (G) de control y la IGFBP-3 siRNAs (100 nM) se introdujeron en células HCC827, y la supresión de IGFBP-3 se confirmó mediante transferencia Western. (H) La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo MTT 72 horas más tarde.
niveles séricos de IGFBP3 no están correlacionadas con la resistencia a EGFR-TKI
Suero nivel de IGFBP-3 se midió ELISA en 20 pacientes con CPNM que mostraron una respuesta parcial al tratamiento EGFR-TKI. De estos 20 pacientes, 16 tenían mutaciones de EGFR y cuatro no fueron evaluados. Suero IGFBP-3 niveles no fueron alterados en respuesta a la aparición de resistencia a EGFR-TKI (1815,3 ± 94,6 ng /ml antes del tratamiento vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml después de la resistencia EGFR-TKI, p = 0,678, figura 5).
IGFBP-3 niveles se determinaron por ELISA en el suero de pacientes con NSCLC. La resistencia adquirida desarrolló en todos los pacientes que respondieron inicialmente a EGFR-TKI.
Discusión
La vía IGF desempeña un papel en la regulación del desarrollo fetal, el crecimiento del tejido y el metabolismo. Dos ligandos distintos (IGF-1 y IGF-2), además de la insulina, y dos receptores (IGF-1R y el receptor de insulina), capaces de tanto homo- y heteropolymerisation median las acciones de esta vía [22]. IGF-1R tiene una de 15 a 20 veces mayor afinidad por IGF-1 que para IGF-2, y todas las IGFBPs tener una mayor afinidad por el ligando de IGF que los correspondientes de IGF-receptores. Por lo tanto, las actividades de IGF están estrictamente reguladas por una familia de IGFBP, y se han identificado al menos seis IGFBPs (IGFBP-1 a IGFBP-6). Entre ellos, IGFBP-3 es la pareja de unión de circulación dominante de IGF, que representan el 70-80% de IGF-1 de unión [23]. IGFBP-3 ha sido establecido como un potente regulador negativo de la activación de IGF-1R y se cree que bloquear la unión de ligando, aunque también pueden tener actividades antiproliferativas de IGF-independiente [24].
La desregulación de la señalización de IGF tiene han descrito en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón. Recientemente, se demostró la inhibición de IGFR para mejorar los efectos inhibidores del crecimiento y apoptóticos de geftinib en H1650 células, que muestran resistencia primaria a EGFR-TKI pesar de tener una mutación por deleción en el exón 19 del gen EGFR. Este resultado sugiere que la inhibición combinada de IGFR podría ser útil para superar la resistencia a EGFR-TKI en el cáncer de pulmón [25]. Una serie de inhibidores del receptor de IGF, incluyendo anticuerpos monoclonales e inhibidores de moléculas pequeñas se encuentran actualmente en ensayos clínicos.
IGFBP-3 de expresión es downregulated notablemente en las células resistentes a gefitinib-A431, que se desarrollan en condiciones de EGFR crónica inhibición [ ,,,0],18], y el tratamiento de estas células con AG1478, un EGFR-TKI, regula a la baja IGFBP-3 [26]. Estos resultados pueden explicar la adaptación de las células cultivadas en condiciones de inhibición de EGFR, que activan la vía de IGFIR que conduce a la señalización /AKT PI3K. Re-exposición de las células A431 GR a IGFBP-3 resensitised tanto la vía PI3K y la supervivencia celular a los efectos de gefitinib [18]. Sin embargo, un modelo de resistencia adquirida a gefitinib en las células de cáncer de pulmón mutante de EGFR no se ha desarrollado hasta la fecha, a pesar de que la adquisición de la resistencia a EGFR-TKI en pacientes con CPNM con mutaciones de EGFR subraya su relevancia clínica. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos establecido dos sublíneas EGFR-TKI-resistentes (HCC827 /GR y HCC827 /ER) de las células HCC827 parentales, que son sensibles a EGFR-TKI debido a la mutación por deleción en el exón 19, por la exposición continua a gefitinib y erlotinib.
Ambas líneas celulares mostraron regulación a la baja de IGFBP-3 de expresión por Western Blot y sin cambios en la actividad transcripcional y sin tener en cuenta el mecanismo de resistencia. Además, el nivel de IGFBP-3 secretada en el medio de cultivo de las células resistentes se redujo significativamente como se muestra por ELISA. Sin embargo, no se detectaron cambios en la señalización de IGFR a pesar de la pérdida de IGFBP-3. Este resultado contradice la de un estudio previo que muestra que la pérdida de expresión de IGFBP en células tumorales tratadas con EGFR-TKI activa IGFIR señalización [18]. Esta discrepancia podría haber sido causado por cambios simultáneos en ligandos tales como IGF-1 o IGF-2, nivel de IGFBP-3, aunque esta noción debe estudiarse más a fondo.
Lee et al. examinado los efectos de IGFBP-3 en células de NSCLC después de la infección con un adenovirus que expresan constitutivamente IGFBP-3 bajo el control del promotor de citomegalovirus (Ad5CMV-BP3). IGFBP-3 sobreexpresión inhibe la fosforilación de Akt y glucógeno sintasa quinasa-3β y la actividad de MAPK. Además, IGF-1 rescatado las células de NSCLC de apoptosis en suero inducida por el agotamiento, y este rescate fue bloqueada en las células H1299 NSCLC infectados por Ad5CMVBP-3 [21]. Sin embargo, en el presente estudio, la expresión de IGFBP-3 forzada por la infección con un vector adenoviral o adición de IGFBP-3 recombinante sólo ligeramente aumentó los efectos inhibidores del crecimiento y apoptóticos de EGFR-TKI. Un estudio realizado por Chang et al. mostró que la disminución de la expresión de IGFBP-3 se asoció significativamente con la supervivencia específica de la enfermedad más corta en pacientes con CPNM en estadio I e indicó que la hipermetilación del promotor de la IGFBP-3 podría estar asociado con la regulación a la baja de IGFBP-3 [27], [28]. La importancia de la IGFBP-3 en la regulación de la proliferación de células NSCLC, clonogenicidad, y el crecimiento del tumor se demostró en un estudio in vitro por el mismo grupo. Sin embargo, en un estudio más reciente, IGFBP-3 de expresión no estaba correlacionado con las variables clínicas y no se asoció significativamente con la respuesta a la quimioterapia y la supervivencia [29], [30].
En general, una asociación entre el EGFR -TKI tratamiento y los cambios en los niveles de IGFBP-3 no ha sido apoyada por los datos actuales. En el presente estudio, la IGFBP-3 en suero mide los niveles antes del tratamiento EGFR-TKI y después del desarrollo de EGFR-TKI resistencia en 20 pacientes con CPNM no mostró cambios significativos (1815,3 ± 94,6 ng /ml antes del tratamiento frente a 1778,9 ± 87,8 ng /ml después de la resistencia EGFR-TKI). IGFBP-3 se produce principalmente y liberada por Kupffer hepáticas y células endoteliales en la circulación sistémica para afectar el crecimiento auxológicos a través de la regulación endocrina [31]. Por lo tanto, la proporción de circulante IGFBP-3 secretada a partir de células de cáncer de pulmón puede ser demasiado pequeño para la detección de cambios significativos relacionados con el desarrollo de resistencia, a pesar de la pérdida de la IGFBP-3 en células de cáncer de pulmón.
Finalmente , repetimos mismos experimentos en células PC-9 con una mutación por deleción en el exón 19 de EGFR para validar nuestra observación. Anteriormente, establecimos células resistentes a gefitinib-(PC-9 /GR) de PC-9 células [32]. Aunque PC-9 /GR células adquirido resistencia T790M mediada, disminución de la expresión de IGFBP-3 también se encontró en ellos (Figura S1). En consecuencia, la reintroducción de la IGFBP-3 en 9-PC /GR células o silenciamiento de IGFBP-3 en las células PC-9 no afectó la sensibilidad a EGFR-TKI.
En resumen, a pesar de la IGFBP-3 se asocia regulación a la baja con la adquisición de resistencia a EGFR-TKI independientemente del mecanismo subyacente, su modesto efecto sobre la resistencia detectada en el presente estudio sugiere que IGFBP-3 no juega un papel importante en la resistencia de las células de NSCLC a la terapia de TKI de EGFR-. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que la IGFBP-3 en suero no es un marcador útil de la resistencia en NSCLC avanzado.
Apoyo a la Información
Figura S1.
IGFBP-3 de expresión no afectó la sensibilidad a EGFR-TKI en células PC-9. expresión basal y de ARNm de IGFBP-3 en PC-9, PC-9 /GR y PC-9 /ER células se evaluaron mediante transferencia Western (A) y RT-PCR (B). (C) las células PC-9 /GR se infectaron con Ad /IGFBP-3 a MOIs de 0 a 100 PFU /células durante 24 h y IGFBP-3 de expresión se determinó por transferencia Western. (D) PC-9 /GR células fueron tratadas con la concentración indicada de gefitinib y 1 mg /ml rh IGFBP-3 para 72 h después de la infección con 100 MOI de Ad /IGFBP-3. La viabilidad celular se midió usando un contador de células automático ADAM-MC. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes, y las barras de error representan la desviación estándar (DE). (E) Control y IGFBP-3 siRNA (100 nM) se introdujeron en células PC-9, y la supresión de IGFBP-3 se confirmó mediante transferencia Western. (F) La viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT de 72 h más tarde
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081393.s001
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