Extracto
No-pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es una de las causas más principales de cáncer muertes relacionados con la PI en todo el mundo. Las terapias combinadas basadas paclitaxel han sido utilizados como tratamiento estándar en NSCLC agresivos. Pero la resistencia paclitaxel se ha convertido en un problema clínico importante en la lucha contra el cáncer de pulmón no de células pequeñas y la autofagia es uno de los mecanismos importantes involucrados en este fenómeno. En este estudio, hemos utilizado microARN (miARN) matrices para detectar miRNAs expresados diferencialmente entre sensibles las células de cáncer de pulmón A549 paclitaxel y su variante de células resistentes a paclitaxel (A549-T24). Se identificaron miR-17-5p era uno de la mayoría de los miRNAs regulación a la baja de manera significativa en las células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel en comparación con las células parentales sensibles a paclitaxel. Se encontró que la sobreexpresión de las células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel sensibilizado miR-17-5p a paclitaxel inducida por la muerte celular apoptótica. Por otra parte, en este informe hemos demostrado que el miR-17-5p se une directamente a la 3'-UTR del gen beclin 1, uno de los más importantes modulador de la autofagia. La sobreexpresión de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel redujo beclin1 expresión y un deceso concordantes en la autofagia celular. También hemos observado resultados similares en otro paclitaxel células de carcinoma de pulmón adenoescamosos resistentes (H596-TxR). Nuestros resultados indican que la resistencia a paclitaxel de cáncer de pulmón está asociado con la regulación negativa de la expresión de miR-17-5p que puede provocar la regulación positiva de la expresión BECN1
Visto:. Chatterjee A, Chattopadhyay D, G Chakrabarti (2014) miR-17 -5p regulación a la baja contribuye a la resistencia paclitaxel de las células del cáncer de pulmón mediante la alteración de la expresión Beclin1. PLoS ONE 9 (4): e95716. doi: 10.1371 /journal.pone.0095716
Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: December 2, 2013; Aceptado: March 29, 2014; Publicado: 22 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Chatterjee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por una subvención del Departamento de Biotecnología, Gob. de la India (N ° BT /PR12889 /AGR /36/624/2009) para GC. CA fue apoyado por una beca de la misma concesión, y, posteriormente, una beca del programa DST- MONEDERO, Universidad de Calcuta. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las enfermedades más comunes y una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en este mundo. Casi el 85% de los casos de cáncer de pulmón pertenecen a la no cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC) [1]. quimioterapias de combinación a base de paclitaxel ahora se han considerado como las terapias estándar para casi todos los pacientes diagnosticados con NSCLC [2]. Paclitaxel se une a la subunidad β- de α- heterodímero β tubulina, estabiliza los microtúbulos, reduce su dinamicidad en el huso mitótico, provoca G
2 detención del ciclo celular /M y las unidades de las células cancerosas a la muerte apoptótica, la activación de comprobación de huso mitótico punto [3]. Por desgracia, la afectividad clínico del paclitaxel es limitado porque algunos tumores muestran resistencia o se vuelven resistentes a ella después de repetidos ciclos de quimioterapia basada en paclitaxel, que en última instancia conduce a la recaída y de mal pronóstico. Los mecanismos más reportados de resistencia a paclitaxel implica la regulación positiva de la P-glicoproteína y bombas de eflujo de drogas relacionadas con el [4], [5], inadecuada interacción con los microtúbulos del huso debido a la modificación postraduccional o expresión alterada de los isotipos de tubulina y proteínas asociadas a los microtúbulos [6] - [8] o cambio funcional en la señalización celular y las vías de supervivencia celular [9] - [12]. Estudios recientes muestran que la inducción de autofagia por paclitaxel juega un papel importante en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel en células tumorales [13] - [15]
microARN, una familia altamente conservada de los ARN pequeños, no codificadoras que recientemente. surgido como nueva clase de moduladores de la expresión de genes a nivel postranscripcional [16] - [18]. Esto ocurre a través de apareamiento de bases perfecta o imperfecta en los elementos de reconocimiento miARN (MRE) dentro de la región no traducida 3 '(UTR) del ARNm diana, dando lugar a la desestabilización del ARNm y traslacional represión [16], [19], [20]. miARN expresión aberrante se ha observado con frecuencia en diversos cánceres humanos, incluyendo NSCLC [21], [22]. En los últimos años, se han hecho intentos de correlacionar la desregulación de la expresión particular miARN con la capacidad de respuesta del tumor a la quimioterapia, incluyendo paclitaxel [13], [23] - [26].
En este estudio, estábamos interesados para examinar el papel de miRNAs en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de pulmón relacionados con la autofagia. Se realizó arrays miARN para detectar miRNAs expresados diferencialmente entre paclitaxel sensible (A549) y paclitaxel células de cáncer de pulmón A549-resistentes (T24). Identificamos que el miR-17-5p se downregulated en las células resistentes a paclitaxel de cáncer de pulmón (A549-T24 y H596-TXR) y su sobreexpresión promover la citotoxicidad inducida paclitaxel y la apoptosis. Por otra parte, nuestros datos demuestran que beclin1, uno de los reguladores más importantes de la autofagia celular, era un objetivo directo de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón.
En su conjunto todos los hallazgos, concluimos que el miR-17 -5p jugó un papel crítico en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel mediante la regulación de la autofagia celular. Supresión de la expresión de miR-17-5p se asoció con la regulación al alza de la expresión y la autofagia beclin1 concordantes que jugó un papel cito-protector y protegido a las células de la apoptosis inducida por el paclitaxel y la muerte celular.
Materiales y Métodos
Materiales
mezcla de nutrientes medio de eagle modificado de Dulbecco (suplementado con 1 mM de L-glutamina), suero bovino fetal, penicilina-estreptomicina, anfotericina B y 0,25% de tripsina-EDTA se adquirieron de GIBCO (Invitrogen) . Paclitaxel se adquirió de Sigma, EE.UU.. kit de la apoptosis AnnexinV-FITC era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). JC-1 y H2-DCFDA se adquirieron de Sigma, EE.UU.. kit de estimación de proteínas de Bradford se adquirió de Genei, India. Todos los demás productos químicos y reactivos fueron de grado analítico y se compraron de Sisco Research Laboratories, India.
línea celular y cultivo celular
Humano no microcítico de pulmón de tipo epitelial línea celular de adenocarcinoma II, A549, se obtuvo a partir del repositorio de células del Centro Nacional para la Ciencia de la célula (NCCS), Pune, India. Pulmón humano línea celular de carcinoma adenoescamoso NCI-H596 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC). Tanto las células se caracterizaron mediante secuenciación de mt-rDNA para la identificación de especies, repeticiones cortas en tándem de perfiles y análisis de isoenzimas para la autenticación línea celular y se confirmó que eran negativos para contaminación por micoplasma por el repositorio. Se seleccionaron Tanto las células A549 y H596 para la resistencia a paclitaxel (Sigma, EE.UU.) en una manera escalonada esencialmente como se describe [27], [28]. Brevemente, las células A549 fueron expuestos inicialmente a 2 nM de paclitaxel y una vez se alcanzó el crecimiento normal de la dosis de la droga se incrementó en los múltiplos de dos, hasta una concentración final de 24 nM paclitaxel (A549-T24) se alcanzó. Para las células NCI-H596, que eran un poco más tolerante al paclitaxel, primero fueron expuestos 5 nM de paclitaxel y se mantiene a esta concentración hasta que se alcanzó un crecimiento normal. A partir de entonces la dosis de fármaco se mejoró en los múltiplos de tres hasta que se consiguió una dosis final de 15 nM de paclitaxel (H596-TxR). Tanto las células se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) suplementado con 1 L- mM glutamina, suero bovino fatal 10%, 3,7 g /L de NaHCO
3, 100 mg /ml cada uno de penicilina y estreptomicina y 2,5 mg /ml de anfotericina B. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Las células se cultivaron hasta el 70-80% de confluencia en frascos de cultivo de tejidos, y luego tratadas con tripsina con EDTA 0,25% de tripsina y se dividieron en placas de cultivo posteriores según sea necesario.
miARN Micro Análisis de expresión de matriz
perfiles de miARN de A549 y células A549-T24 se realizaron de Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). El ARN total incluyendo miARN se extrajo a partir de células A549 y A549-T24 utilizando Qiagen miRNeasy mini kit siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras de ARN total con la calidad adecuada para su análisis por microarray plataforma miRCURY LNA miARN se marcaron utilizando el Etiquetado Kit miRCURY LNA microARN Hi-Power, HY3 /hy5 y pares de muestras se hibridaron en la matriz de miRCURY LNA microARN (6ta GEN - HSA, la MMU & amp; RNO) y la matriz se leyó en el sistema de escáner serie Agilent G2505B Micro en un ambiente libre de ozono. Sólo aquellas miRNAs que fueron dysregulated por lo menos dos veces (ΔLMR ≥2) fueron tomados en consideración.
Pre-miARN transfección
mirVana miARN precursores imitan 17 (pre-miR-17-5p ) y mirVana miRNA mimic control negativo#1 (control pre-miR-negativo) fueron adquiridos de Ambion. Pre-miRNAs se transfectaron en líneas celulares en ~ 50% de confluencia en una concentración de 100 nM con el reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión de miR-17-5p fue detectado por PCR en tiempo real y la expresión de BECN1 fue probado por QRT-PCR y /o Western Blot.
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
Para el análisis de la expresión de los genes miARN, QRT-PCR se realizó utilizando el kit TaqMan micro ARN de transcripción inversa (Applied Biosystems) y TaqMan ensayos microARN kit (Applied Biosystems) siguiendo los protocolos del fabricante. U6 snRNA sirvió como control interno.
Para analizar la expresión de BECN1, Bax, Bcl-2, LC3-II y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y la caspasa-3 (Tabla 1), los ADNc se sintetizaron a partir 1 g de ARN total usando el kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Invitrogen). El ADNc fue mezclado con 2 × Dynamo ColorFlash SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific) y varios conjuntos de cebadores específicos de genes y después se somete a la cuantificación QRT-PCR usando el sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) StepOne- Plus. La expresión génica se calculó en relación con GAPDH (por BECN1, Bcl-2, Bax, LC3-II, caspasa-3, etc.) o U6 snRNA (para miR-17-5p) método que utiliza el tiempo de ciclo comparativa (Ct) (2
método -ΔΔCt) [29], [30].
células inhibición de proliferación de ensayo (ensayo MTT)
A549-T24 y H596-TXR celulares, ya sea transfectaron con 100 nM pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p y TxR-miR-17-5p respectivamente) o con 100 nM de ARN de control pre-miR-negativo (T24-miR-NC y TxR-miR-NC, respectivamente) se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (1 x 10
4 células por pocillo). Después de 24 h de incubación, el medio se reemplazó con medio fresco y las células se trataron con diferentes concentraciones de paclitaxel durante otras 24 h. MTT (5 mg /ml) disuelto en PBS y esterilizarse por filtración, a continuación se añadió 20 l de la solución preparada a cada pocillo. Esto se incubó hasta precipitado púrpura era visible. Posteriormente 100 l de Triton-X100 se añadió a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad durante 2 h a temperatura ambiente. La absorbancia se midió en un lector de ELISA (MultiskanEX, sistemas de laboratorio, Helsinki, Finlandia) a una longitud de onda de ensayo de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 650 nm. Los datos se calcularon como el porcentaje de inhibición mediante la siguiente fórmula:. (1)
A
T y A
s indican la absorbancia de las sustancias de ensayo y de control de disolvente, respectivamente [31]
ensayo de exclusión de azul de tripano para la viabilidad celular
Trypán ensayo de exclusión de azul [32] se utilizó para determinar el número de células viables y muertas después de la transfección pre-miR-17-5p y el tratamiento posterior de paclitaxel. Brevemente, las células T24-miR-17-5p o T24-miR-NC se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos (5 x 10
4 células por pocillo). Luego, las células se trataron con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante otras 24 h. Después se cosecharon 24 h las células a través de tripsinización, se lavaron dos veces con 1X PBS y después se tiñeron con 0,4% de azul de tripano en PBS. Las células fueron entonces preparados para el análisis por citometría de flujo.
Construcción de informador de luciferasa Las construcciones y Ensayo de la actividad de luciferasa
Las construcciones de reportero 3'UTR-luciferasa que contenían el 3'UTR de BECN1 con o sin MIR -17-5p sitio de unión se amplificó por PCR a partir de ADNc totales preparados a partir de ARN total obtenido a partir de células A549-T24. Los productos de PCR fueron clonados en
vector reportero
pCI-neo-RL-luc (un generoso regalo del Dr. SN Bhattacharyya, IICB, Calcuta, India.) Entre
Xba I y
No
sitios de restricción, inmediatamente aguas abajo del gen de la luciferasa de renilla. Todos los constructos de luciferasa fueron verificadas secuencia. Las células fueron transitoriamente co-transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa de Renilla (
pCI-neo-RL-Bec-3 de búsqueda: '
UTR-peso
o
pCI-neo-RL-Bec-3 de búsqueda: '
UTR-mut
), luciérnaga plásmido de luciferasa (
pGL3-FF
) y pre-miR-17-5p precursor y /o anti-miR-17-5p o pre -miR negativo ARN precursor de control usando el reactivo de transfección Lipofectamine2000 siguiendo el protocolo del fabricante. Después de 48 h de la transfección, se recogieron las células y se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega). Las actividades de luciferasa en los extractos celulares se determinaron mediante el uso de Promega Dual Luciferase kit de ensayo de reportero en un sistema de lector de placas VICTOR X3 (PerkinElmer). Las actividades relativas de luciferasa se calcularon por la relación de Renilla luc /actividad luc Firefly y normalizado a la de las células de control y doble se calculó la represión. vector pGL3-FF se utilizó como control interno.
Detección de Ácido vesicular orgánulos (AVO)
Para observar la reducción en la formación AVO, T24-miR-17-5p y T24-MIR -NC células fueron sembradas en cubreobjetos. Después de 48 h de transfección, las células se tiñeron con naranja de acridina (AO) (1 mg /ml) a 37 ° C en la oscuridad durante 15 min, después se lavaron dos veces con PBS. Imágenes de tinción AO fueron visualizadas inmediatamente usando microscopio de fluorescencia (Olympus IX70, Japón). El citoplasma y núcleo de células teñidas fluoresced verde brillante, mientras que las vacuolas ácidas autofágicas fluoresced rojo brillante. Experimentos similares se realizaron con células A549.
Para cuantificar el cambio en el número de vesículas ácidas (AVO) en el A549, T24-miR-NC y las células T24-miR-17-5p, se tiñeron con AO (1 mg /ml) en PBS a 37 ° C durante 15 min, se recogieron las células, se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 500 l de PBS y después se analizó inmediatamente por citometría de flujo ensayo. Los datos de citometría de flujo se analizó con el software de análisis CellQuest (Becton Dickinson) [33].
Etiquetado de la autofagia con vacuolas Monodansylcadaverine
p>
Flujo de análisis de citometría de células apoptóticas
T24-miR-NC y T24-miR 17-5p células fueron tratadas con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante 24 h. Aproximadamente 1 × 10
5 células fueron teñidas durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con FITC-conjugado AnnexinV (1 mg /ml) y yoduro de propidio (PI) (0,5 mg /ml) en un Ca
2 + enriquecida en tampón de unión y se analizaron mediante un ensayo de citometría de flujo de dos colores. Se detectaron las emisiones de AnnexinV y PI en el FL1 y FL2 canales de un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, EE.UU.), respectivamente [31]. Los datos fueron analizados utilizando el programa CellQuest de Becton-Dickinson.
Determinación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ)
Para evaluar el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ), 5,5 ', 6,6 '-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC-1), se utilizó una sonda fluorescente sensible para ΔΨ [35]. células T24-miR-NC y T24-miR-17-5p fueron tratados con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante 24 h. Las células se recogieron a continuación, se lavó dos veces con PBS, se tiñeron con 5 M JC-1 durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Las células se enjuagaron con PBS dos veces, se resuspendieron en 500 l de PBS y al instante evaluado para la fluorescencia roja (JC-1) con citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, EE.UU.).
Medición de especies reactivas de oxígeno (ROS)
ROS se determinaron utilizando el marcador fluorescente 2 ', 7 pies dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) [36]. En pocas palabras, T24-miR-NC y las células T24-miR-17-5p fueron tratados con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante 24 h. Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se incubaron con 10 mM DCFH-DA durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente y el cambio en la intensidad de fluorescencia verde, tal como se detecta en el canal FL1, fue seguido por citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, EE.UU.) y los datos se analizaron con el software de análisis CellQuest (Becton-Dickinson, EE.UU.).
análisis estadístico
QRT-PCR reacciones se realizaron por triplicado para cada muestra y se repitieron al menos 3 veces y los datos fueron analizados estadísticamente con la t de Student-test "o prueba de Wilcoxon de suma de rangos. IC
50 datos del ensayo MTT se analizaron con la prueba de Wilcoxon de suma de rangos. Todos los datos se muestran como la media ± S. E. (Error estándar). Dos mediciones fueron estadísticamente significativos si el valor de p correspondiente fue. & Lt; 0,05
Resultados
Perfiles de miRNAs en paclitaxel células sensibles y resistentes cáncer de pulmón
Hemos preparado paclitaxel pulmón resistente de células no pequeñas de cáncer (A549-T24) a partir de células sensibles a paclitaxel por la exposición continua de las células A549 a paclitaxel (Fig. S1A). Para buscar los miRNAs críticos implicados en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel, el ARN total, extraídos a partir de células de cáncer de pulmón (A549) y su variante resistente paclitaxel (A549-T24), fueron enviados a Exiqon, Dinamarca para miARN gama de perfiles. A partir de la matriz de resultados, se identificó que 23 miRNAs se expresan diferencialmente en células A549-T24 que las células A549 (Fig. 1).
perfiles de matriz de paclitaxel miARN sensibles (C1 y C2) y resistentes (TX1 y Tx2 se muestran) las líneas celulares de cáncer de pulmón. agrupación jerárquica supervisada de líneas celulares en función de su expresión diferencial de miRNAs con ΔLMR≥2 entre los dos grupos fue exhibida. Cada columna representa una línea de células y cada fila una sonda conjunto. El mapa de calor indica el nivel de expresión en relación con la media alta (rojo) o baja (azul) de acuerdo con la escala que se muestra en la figura.
Para identificar los genes diana de estos miRNAs expresados diferencialmente, nos miARN objetivo buscado bases de datos de predicción miRBase, microRNA.org y TargetScanHuman 6.2 y nos identificado miR-17-5p probablemente podría tener un papel en la autofagia apuntando a la proteína relacionada con la autofagia beclin 1 (BECN1) uniéndose directamente a su región 3 'UTR entre la posición 135 a 141. ya se informó que la inducción de la autofagia por tratamiento con paclitaxel juega un papel importante en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel en las células tumorales con la regulación positiva de BECN1 [13] - [15]. Se observó el aumento de nivel de la autofagia como se indica por la regulación positiva de BECN1 y el aumento de la conversión LC3-I a LC3-II y regulación a la baja de la expresión de p62 en las células A549-T24 en comparación con las células A549 (Fig. 2A). También medimos los niveles de ARNm relativos de BECN1 y LC3-II (Fig. 2B y 2C) y encontramos estos dos ARNm se upregulated en las células A549-T24 en comparación con las células A549. Para extender nuestro hallazgo nos preparamos otra línea celular de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel-H596 TxR de paclitaxel células NCI H596 sensibles
in vitro gratis (Fig. S1B) y se examinaron el estado de BECN1 y LC3 en esta celda resistente al cáncer de pulmón línea (H596-TxR). Encontramos la regulación positiva similar de BECN1 y el aumento de la conversión LC3-I a LC3-II en células H596 resistentes a paclitaxel (H596-TXR) en comparación con las células H596 parentales (Fig. S2A). Por otra parte, el análisis de los niveles de ARNm relativos de BECN1 y LC3-II (Fig. S2 B y Fig. S2C) también confirmó significativa regulación de la autofagia celular en células H596-H596 TXR en comparación con las células.
(A) Estado de Expresión de ciertas proteínas marcadoras de autofagia BECN1, MAP-LC3, p62 y GAPDH (control de carga) se midieron por Western Blot. (B-C) en relación BECN1 y LC3-II niveles de mRNA expresión se cuantificaron por análisis qRT-PCR en las células A549 y A549-T24,
barras representan la media ± S. E. (
*
p & lt; 0,03 frente al control, donde n = 3) (D) La regulación por disminución de la expresión de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel (A549-T24) en comparación con las células A549. Taqman QRT-PCR se realizó para detectar los niveles relativos de miR-17-5p en células A549 y A549-T24. Los resultados se normalizaron a nivel de expresión snU6 y representan como media ± S. E. a partir de tres repeticiones independientes.
(** p & lt; 0,001
versus control, n = 3) guía empresas
miARN-17-5p está regulado por disminución en células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel
. validado aún más la matriz de datos para miR-17-5p por Taqman QRT-PCR. QRT-PCR utilizando un ensayo basado probe- Taqman, se comparó el nivel de expresión de miR-17-5p en paclitaxel sensibles y resistentes a las células A549. Higo. 2D muestra una regulación a la baja ~7.2 veces en el nivel de expresión de miR-17-5p relativa en las células A549-T24 en comparación con las células A549, la validación de los resultados de micro-matriz. También estima que el nivel de expresión de miR-17-5p en células H596-TXR y la comparamos con la de las células H596. Encontramos que las células H596-TXR exhibieron casi ~2.62 downregulation veces de la expresión de miR-17-5p relativa en comparación con la de las células H596 sensibles de paclitaxel (Fig. S2D) que indica la asociación entre miR-17-5p y resistencia paclitaxel no era línea celular específica .
La sensibilidad a paclitaxel es modulada por la sobreexpresión de miR-17-5p
in vitro
para investigar si las células de miR-17-5p sobreexpresión sensibilizado A549-T24 a paclitaxel , transfectadas las células A549-T24 con 100 nM de pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) o 100 nM pre-miR ARN control negativo (T24-miR-NC) y 24 h después de la transfección las células estaban tratados con diferentes dosis de paclitaxel (0-200 nM). Se observó que, en comparación con el control negativo (T24-miR-NC), la sobreexpresión de miR-17-5p sensibilizado significativamente las células T24 A549- a paclitaxel (Figura 3A,
p. & Lt; 0,05
y
p & lt; 0,03
). Por ejemplo, las células T24-miR-17-5p exhibieron casi 86%, 51%, 31% y 6% de viabilidad celular cuando las células se trataron con 12 nM, 50 nM, 100 nM y 200 nM de paclitaxel durante 24 h, respectivamente. En condiciones similares células T24-miR-NC mostraron casi el 99%, 89%, 78% y 58% de viabilidad. Se obtuvieron resultados similares cuando overexpresed 100 nM pre-miR-17-5p en células H596-TXR (TxR-miR-17-5p) y se trataron las células con dosis similares de paclitaxel (0-200 nM) durante 24 h. Se observó que, en comparación con el control negativo (TxR-miR-NC), las células TxR-miR-17-5p exhiben mucho menor viabilidad celular cuando se trata con concentraciones crecientes de paclitaxel. curvas completas de respuesta a la dosis se muestran en la Fig. S3 A.
células A549-T24 (A) o bien se transfectaron con 100 nM de control pre-miR-negativo (T24-miR-NC) o pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p ) RNA precursor y fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10
4 células por pocillo. Después de 24 h, las células se trataron con 0, 12, 24, 50, 100, 200 nM de paclitaxel durante otras 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Los datos se presentan como% de la viabilidad celular medida en las células tratadas con paclitaxel.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes;
bares, media ± S.E. (* P & lt; 0,05 vs control negativo, p & lt; 0,03 vs control de A549, donde n = 4). (B-C) Las células (T24-miR-NC y T24-miR-17-5p) fueron tratados posteriormente con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante 24 horas y se sometió a análisis FACS después de haber sido manchado por azul tripán. Histograma representa la intensidad de fluorescencia roja (FL3-H) vs. recuentos parcela donde se produce aumento dependiente de la dosis de la muerte celular. Los resultados representan el mejor de los datos recogidos a partir de tres experimentos con resultados similares.
Esta pérdida de la viabilidad celular mediante la sobreexpresión de miR-17-5p y posterior tratamiento con paclitaxel fue evaluado por el ensayo de exclusión de azul de tripano usando colorante citómetro de flujo (Fig. 3B y 3C,
p & lt; 0,01
) con células A549-T24. Las células vivas poseen membranas celulares intactas que excluyen azul de tripano, sin embargo, las células muertas no y eventualmente ocupan azul de tripano. Higo. 3B y 3C muestra que con la sobreexpresión de miR-17-5p y tratamiento paclitaxel posterior (24 y 50 nM) durante 24 h, la viabilidad celular residual de las células T24-miR-17-5p se redujo en comparación con los respectivos controles negativos. Por ejemplo, mientras que la sobreexpresión de miR-17-5p y posterior tratamiento con 24 nM y 50 nM de paclitaxel durante 24 h causados casi 25% y la muerte celular 46%, correspondiente controles negativos exhibidos sólo el 4% y el 6% de muerte celular, respectivamente. Estos resultados indicaron que la sobreexpresión de miR-17-5p juega un papel clave en la sensibilización de las células A549-T24 resistentes al paclitaxel con paclitaxel.
Beclin 1 es un objetivo directo de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón
para determinar si miR-17-5p se une directamente a la región 3 'UTR del mRNA BECN1, hemos construido 3'-UTR de los reporteros BECN1 contiene putativo sitio de unión de miR-17-5p y construcción de mutantes correspondientes, a falta de miR 17-5p sitio de unión, aguas abajo del gen indicador de luciferasa (Fig. 4A). La co-transfección de pre-miR-17-5p con BECN1 silvestre constructo indicador tipo en las células A549-T24 reprimidos en gran medida la actividad de luciferasa de Renilla (Fig. 4B), mientras que el co-transfección con la construcción de reportero mutante no mostró ningún cambio significativo en la actividad de luciferasa relativa con la de control (Fig. 4B). Por otra parte, cuando se co células A549-T24 transfectadas con anti-miR-17-5p (100 nM) y 3'-UTR de los reporteros BECN1, con o sin putativo sitio de unión de miR-17-5p, ninguna disminución significativa en la actividad luciferasa relativa se observó (Fig. 4B). Estos resultados confirmaron que colectivamente BECN1 era un objetivo directo de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón.
(A) Representación esquemática de la 3'-UTR de la transcripción BECN1 humano. Predijo sitio de unión de miR-17-5p fue representado. Los números (+ 135-141) representan los nucleótidos que se prevé que el par de bases con la secuencia de semillas de miR-17-5p. (B) miR-17-5p se une directamente a la 3 'UTR de BECN1 génica en células A549-T24. Las células A549-T24 fueron co-transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa de Renilla (
pCI-neo-RL-Bec-3 de búsqueda: '
UTR-peso
o
pCI-neo-RL-Bec -3 de búsqueda: '
UTR-mut
), plásmidos luciferasa de luciérnaga (pGL3-FF) y pre-miR-17-5p precursor o precursor de control anti-miR-17-5p o pre-miR-negativo ARN usando reactivo de transfección Lipofectamine2000. Después de 48 h, se recogieron las células y se lisaron con tampón de lisis pasiva. La actividad de luciferasa se midió utilizando Promega Dual Luciferase kit de ensayo de reportero. Los resultados se representan como en relación pliegue represión (/actividad Firefly luc luc Renilla) en comparación con las células control. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,03 vs control, n = 4)
La sobreexpresión de miR-17-5p en células de cáncer de pulmón resistentes a paclitaxel conduce a la regulación a la baja Beclin 1
Para validar experimentalmente objetivo de predicción, se evaluaron los niveles de proteína de BECN1 siguientes sobreexpresión de miR-17-5p tanto en células A549-T24 y H596-TXR. Higo. shows 5A, la sobreexpresión de miR-17-5p disminuyeron significativamente la expresión BECN1 en comparación con el control negativo (T24-miR NC). Esto fue confirmado por la evaluación de los niveles de mRNA de BECN1 de QRT-PCR. Encontramos, miR-17-5p sobreexpresión nivel reducido BECN1 ARNm por ~5.6 veces (
p & lt; 0,01
) en las células A549-T24 en comparación con el control negativo. Hemos probado los niveles de expresión de otros dos marcadores autofágicas, LC3-II y p62 que son aguas abajo de BECN1 por transferencia de Western. La sobreexpresión de miR-17-5p en células A549-T24 reduce la conversión de LC3-I a LC3-II (Fig. 5A, segundo blot y la Fig. 5C) y el aumento del nivel de p62 (Fig. 5A, tercer blot). En el caso de las células H596-TXR, también encontramos que la sobreexpresión de miR-17-5p resultó en la regulación negativa concordantes de BECN1 y LC3-II en células H596-TXR (Fig. S3 B-D). Todos estos datos demostraron colectivamente que la sobreexpresión de miR-17-5p en células cancerosas resistentes a paclitaxel pulmón causó una reducción en la autofagia celular atacando directamente a la proteína relacionada con la autofagia BECN1.
células A549-T24 (A) fueron transfectadas ya sea con 100 nM de control pre-miR-negativo (T24-miR-NC) o pre-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) precursores de ARN. Después de 24 h, se prepararon lisados celulares para transferencia Western con anticuerpo contra BECN1, MAP-LC3, p62 y GAPDH se utilizó como control de carga. (B-C) en relación BECN1 y LC3-II niveles de mRNA expresión se cuantificaron por análisis de QRT-PCR en T24-miR-NC y las células T24-miR-17-5p,
barras representan la media ± S. E. a partir de tres experimentos independientes (** p & lt; 0,01 frente al control, donde n = 3) guía empresas
La sobreexpresión de miR-17-5p inhibe la autofagia en las células resistentes a paclitaxel A549-T24
. paclitaxel induce la autofagia en las células del cáncer [13] - [15]. Las células tumorales utilizan este autofagia citoprotector como una defensa de la muerte celular por apoptosis que a su vez contribuye al desarrollo de la resistencia a paclitaxel. Durante authophagy, autofagosomas se fusionan con los lisosomas para formar autophagolysosomes que son vacuolas ácidas (AVO) que se unen acridina-naranja dando fluorescencia roja y se pueden evaluar fácilmente por microscopía de fluorescencia y citómetro de flujo. Higo. 6A-B mostró mientras que las células A549 sensibles paclitaxel mostraron casi no vesículas rojas (Fig. 6A), se observaron gran número de vesículas fluorescentes rojas en el citoplasma de las células T24-miR-NC (Fig. 6B). Sin embargo, cuando las células A549-T24 se transfectaron con miR-17-5p (células T24-miR-17-5p), aparición de reducido significativamente (Fig. 6C) de AVO rojo. Estos resultados fueron reconfirmados por análisis de citometría de flujo (Fig. 6D-G). Hemos observado que las células T24-miR-NC mostraron mayores niveles de flujo autophagic comparación con las células A549 (Fig. 6D en comparación a la Fig. 6E). Sin embargo, cuando las células A549-T24 se sobreexpresa con miR-17-5p, formación de AVO de redujo significativamente en comparación con células T24-miR-NC (Fig. 6F en comparación a la Fig. 6E). Higo. 6G muestra una representación cuantitativa de AVO en las células que se calcularon a partir de los resultados citómetro de flujo.
T24-miR-NC y las células T24-miR-17-5p se tiñeron con AO para la observación AVO bajo microscopio de fluorescencia (B y C ). AO tinción de A549 sirvió como el control (A). (D-F) para cuantificar el cambio en% de las células en desarrollo AVO siguientes sobreexpresión de miR-17-5p en células A549-T24, Flow-estimación de citometría de AVO se realizaron en el A549, T24-miR-NC y T24-miR-17- 5p células respectivamente. (G) La cuantificación de células positivas medias AVO en las tres líneas celulares. Los datos presentados son la media ± S. E. Higo. Como se muestra en la Fig. Higo. Higo. Como se muestra en la Fig.