Extracto
Objetivos
polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en putativo sitios de unión microARN (miRSNPs) modulan la susceptibilidad al cáncer a través de la unión que afecta a los genes miARN. Aquí, hemos tratado de investigar la asociación entre miRSNPs y el riesgo de cáncer de cuello uterino.
Métodos
En primer lugar, con genotipo 41 miRSNPs de 37 genes relacionados con el cáncer en 338 pacientes y 334 controles (Estudio 1), y replicado las asociaciones significativas en 502 pacientes y 600 controles (Estudio 2). Hemos probado los efectos de la interacción miRSNPs en microRNA-mRNA de ensayo indicador de luciferasa.
Resultados
Cinco SNPs se muestra notable asociación con el riesgo de cáncer de cuello uterino en el Estudio 1. Sólo
IL-16
rs1131445 mantiene una asociación significativa con el cáncer de cuello de útero (CT /TT vs CC, OR ajustada = 1,51,
P
= 0,001) en el Estudio 2. Esta asociación fue más evidente en los datos combinados de dos estudios ( OR ajustada = 1,49,
P = 0,00007
). También se encontró que imita el miR-135b interactuaron con
IL-16
3'-UTR para reducir la expresión de genes y que el rs1131445 T a C de sustitución a putativo sitio de unión, alteró la interacción de miR-135b con
IL-16
3'-UTR. Un ELISA indicó que el suero de IL-16 de los pacientes con cáncer de cuello uterino fue elevado (frente a los controles,
P
= 0,001) y se correlacionó con el genotipo rs1131445. Los pacientes que llevaban el alelo rs1131445 C tuvieron mayor suero de IL-16 que los no portadores (
P Hotel & lt; 0,001).
Conclusiones
Estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que miRSNPs constituir un factor de susceptibilidad para el cáncer de cuello uterino. rs1131445 afecta a
IL-16
expresión al interferir con la función supresora de miR135b y esta variante se asocia significativamente con el riesgo de cáncer de cuello uterino
Visto:. Mi Y, Wang L, Zong L, M Pei , Lu Q, P Huang (2014) variantes genéticas en microRNA sitios de destino de 37 genes relacionados con el cáncer seleccionado y el riesgo de cáncer cervical. PLoS ONE 9 (1): e86061. doi: 10.1371 /journal.pone.0086061
Editor: Qing Yi-Wei, el Instituto del Cáncer de Duke, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de noviembre de 2013; Aceptado: 9 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Mi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de Xi'an Ciencia y Tecnología Programa de Investigación (Subvenciones XASTR1125), la Fundación de Investigación Científica de los eruditos chinos de Ultramar Repatriados (Ministerio de Educación del Estado) ". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical, el tercer cáncer más común en las mujeres [1], es causada principalmente por el virus del papiloma humano (VPH) [2]. Aunque las infecciones por VPH son frecuentes en las mujeres sexualmente activas, sólo una minoría de las infecciones persisten y se desarrollan en neoplasia cervical intraepitelial grado 2/3 (CIN 2/3) o cáncer de cuello uterino, incluso [3]. Varios cofactores afectan a la transición de la infección inicial por VPH con el cáncer de cuello de útero, incluyendo el estilo de vida, la respuesta inmune del huésped, y la susceptibilidad genética [4], [5]. Las funciones importantes de los factores genéticos en la patogénesis del cáncer cervical son impulsadas por los resultados que exhibe cáncer de cuello uterino de una agrupación familiar importante y los familiares de primer grado de pacientes tienen el doble de riesgo de desarrollar cáncer [6]. Unas variantes de riesgo de modulación para el cáncer de cuello uterino han sido identificados por un estudio de asociación del gen candidato. Los genes que están asociados con la susceptibilidad al cáncer cervical están implicados en la reparación del ADN, el ciclo celular y la apoptosis, la proliferación y la diferenciación celular, el sistema de antígeno leucocitario humano y la respuesta inmune [7], [8].
reciente evidencia convincente indica que los polimorfismos en microARN (miARN) los sitios de unión de los genes relacionados con el cáncer son una fuente importante que alberga las variantes genéticas causantes de cáncer [9]. miARN, a menudo 19-25 nucleótidos de longitud ARN no codificante, se une dentro de la región no traducida 3 '(UTR) de la transcripción de genes diana para inhibir e incluso abolir su traducción a proteína. Se estima que aproximadamente el 30% de los genes humanos están regulados por miRNAs [10]. desregulación de genes es uno de los principales mecanismos por los cuales las células pueden convertirse en cáncer [11]. miARN puede participar en la carcinogénesis a través de la regulación post-transcripcional de muchos genes relacionados con el cáncer, incluyendo los oncogenes y genes supresores de tumores. La expresión aberrante de miRNAs contribuye a la etiología de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de cuello de útero [12]. análisis de perfil de miARN de cáncer cervical reveló que miRs-9, 21, 135b, 146a, 199a, 203 y 205 se sobreexpresa frecuentemente en tejidos de cáncer o líneas celulares [12]. Por otra parte, miR-205 actúa como un oncogén para promover la proliferación celular y la migración de células de cáncer cervical humano [13]. Por el contrario, miR-214 se dirige directamente el gen GALNT7 para suprimir el crecimiento y la invasividad de las células de cáncer cervical al funcionar como un supresor de tumor un supresor de tumores [14]. El cambio de pares de base dentro de la región de los genes miARN objetivo de genes relacionados con el cáncer podría destruir o crear un sitio de unión o alterar la afinidad de unión y post-transcripcional de control de mRNA por miRNA y, por lo tanto, podría afectar a la transformación de las células normales a células cancerosas [9].
Bioinformática análisis ha identificado muchos SNPs que se encuentran en los sitios de unión miARN putativo de genes candidatos cáncer y que afectan de manera significativa la energía de enlace de los genes miARN putativo :: dúplex de ARNm [15]. Una pequeña fracción de ellos ha sido probado aún más para alterar la expresión de genes diana por el ensayo de indicador de luciferasa y mostrar una asociación significativa con la susceptibilidad a cáncer [16], [17]. Landi et al. proyectada fuera 57 SNPs dentro de los sitios miARN vinculante de 104 genes candidatos para el cáncer colorrectal, encontraron ocho SNPs de ellas que muestran varias energía libre de Gibbs de unión entre los dos alelos de cada SNP, y finalmente demostraron un SNP, rs17281995, dentro del miARN vinculante sitios de CD86, como la variante de riesgo de modulación para el cáncer colorrectal [16]. Utilizando una estrategia de investigación similar, SNPs en los genes miARN sitios de otros genes importantes candidatos de cáncer, como los genes de reparación del ADN [17] vinculante, la integrina genes [18] y los genes de caspasas [19], también se han identificado y evaluado como variantes de susceptibilidad para una mayor cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal y cáncer de cabeza y cuello de riesgo. Recientemente, Shi et al. demostrado que el alelo G rs11064 dentro de la
TNFAIP8
gen debilita la afinidad de unión de miR-22 a la UTR 3 'TNFAIP8 y se asocia con un mayor riesgo de cáncer de cuello uterino [20], lo que sugiere que miRNA- sitios de unión son también los puntos calientes que albergan las variantes de susceptibilidad al cáncer de cuello uterino.
en el presente estudio, hemos tratado de identificar nuevas variantes de riesgo para el cáncer de cuello uterino entre los sitios miARN objetivo en los genes relacionados con el cáncer. Mediante la revisión de las bases de datos bibliográficas y bioinformática, hemos encontrado 37 genes relacionados con el cáncer con variaciones en supuestos sitios de unión 3'-UTR de los genes miARN. La fuerza de asociación de estas variantes con cáncer de cuello uterino se evaluó mediante un estudio de casos y controles en dos etapas. Para la variante asociada, su influencia funcional en la regulación mediada por la expresión de los genes miARN de los genes diana se investigó mediante el ensayo indicador de luciferasa.
Materiales y Métodos
1 Población de estudio
se reclutaron 840 pacientes con cáncer de cuello uterino de los pacientes que recibieron tratamiento de pacientes internados en tres hospitales entre mayo de 2008 y abril de 2012. entre ellos, 338 sujetos de hospital Popular Liaocheng (LCPH) fueron utilizados en el estudio de la primera etapa (estudio 1), que investigó todo de los SNPs seleccionados, y 502 sujetos de la primer hospital Afiliado de la Universidad Jiaotong de Xi'an (TFAHXJTU) y el hospital de la Salud Materno-infantil de la provincia de Shaanxi (MCHHSP) se utilizaron en la segunda fase del estudio (estudio 2), que era replicar el hallazgos notables (
P Hotel & lt; 0,05) de Estudio 1. Todos los pacientes fueron diagnosticados mediante examen histológico de biopsia bajo colposcopio y /o tejidos resecados. El estadio clínico y el tipo histológico de cáncer de cuello uterino de los pacientes se obtuvieron de los registros médicos y se muestran en la Tabla 1. Un total de 934 controles sanos fueron reclutados de las mujeres que participaron en el examen físico de rutina en estos tres hospitales, 334 sujetos de estudio en LCPH 1 y 600 sujetos de TFAHXJTU y MCHHSP en el estudio 2. Todos los controles que no tenían antecedentes de enfermedad neoplásica o asociada a cáncer, y tenían la citología cervical normal en al menos dos exámenes anuales consecutivos. Todos los sujetos estaban relacionados genéticamente, y su edad, la raza, el tabaquismo, el estatus socioeconómico y el estado civil también fueron investigados por la lectura del doctor o mediante entrevistas. Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética Médica de LCPH, TFAHXJTU, y MCHHSP y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
2 selección polimorfismo y genotipado
Los estudios anteriores han sistemáticamente proyectado los SNPs en los genes miARN sitios de muchos genes relacionados con el cáncer de unión. En pocas palabras, primero se seleccionaron los genes relacionados con el cáncer de búsquedas de bases de datos y literatura y, a continuación, se identifican los sitios putativos miARN en estos genes mediante algoritmos especializados (tales como miRBase, Miranda, PicTar y TargetScan) y se seleccionaron los SNPs que residen en el sitios de búsqueda BLAST y dbSNP miARN vinculante, finalmente, la identificación de los SNPs cuyos alelos que tienen la secuencia diana diferencial significativamente la energía de enlace de miARN en un modelo predictivo de ordenador [16], [18]. Debido a que muchos genes relacionados con el cáncer son compartidos por múltiples tipos de cáncer [21], se seleccionaron los SNPs de la literatura previa que cubre los temas sobre el sitio de miARN vinculante /genes miARN sitios objetivo, polimorfismos y el cáncer /tumor. La base de datos Medline /PubMed se realizaron búsquedas para encontrar la literatura que se publica a partir de 2000 Enero de 2013 abril. Nosotros, por último, seleccionamos 41 SNPs en los sitios de unión miARN-predichos un radio de 37 genes relacionados con el cáncer alelo con menor frecuencia mayor que 0,1 en la población china Han (Tabla 2). ADN genómico fue extraído de leucocitos de sangre periférica utilizando el DNA Midi Kit Blood (Omega Biotech, Norcross, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los SNPs seleccionados fueron genotipo en pacientes y controles usando MALDI-TOF dentro del sistema MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, EE.UU.) [22].
3 VPH genotipado
humano VPH de frotis de raspado del cuello uterino y /o tejidos resecados se genotipo utilizando el kit de prueba de VPH GenoArray (HybriBio Ltd, Guangdong, china). En primer lugar, el ADN del VPH se amplificó con los cebadores L1 de HPV consenso MY09 /MY11 y HMB01. A continuación, el producto de PCR procesado hibridación de flujo a través de la forma de un formato macrochips con una membrana de nylon sobre la cual se inmovilizaron VPH sondas de oligonucleótidos específicas del genotipo. Esta técnica puede identificar 21 genotipos de VPH, incluyendo 5 tipos de bajo riesgo (6, 11, 42, 43, y 44), 14 tipos de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 , 56, 58, 59, 66 y 68), y 2 tipos de riesgo intermedio (CP8304 y 53).
4 séricos de IL-16 niveles
'sangre y controles de los pacientes se recogieron muestras de entre 8 y 10 am Los sueros se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min y se congeló a -80 ° C. Los niveles séricos de IL-16 se midieron mediante kits disponibles en el mercado ligados a enzimas ensayo inmunoenzimático (ELISA) (PIERCE Endogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel mínimo de detección para IL-16 era 0,10 pg /ml. No se observó detección cruzada de otras citoquinas. La variación intra-ensayo fue. & Lt; 10% Francia culture
5 de la célula
líneas celulares de cáncer cervical humano, HeLa [23] y SiHa [24], se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Estas células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% y se cultivaron a 37 ° C en un incubador de dióxido de carbono al 5% humidificada.
6 transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
el 3'-UTR de IL-6 mRNA, incluyendo el alelo C o T alelo de rs1131445, se amplificaron usando los cebadores de 5 'TGGCCTGGGCCTCCTCACAA-3' (hacia adelante) y 5'-CTCCACCACCCTTCCCTA -3 '(inverso). Los fragmentos amplificados fueron clonados en la corriente abajo del gen de luciferasa de luciérnaga en el vector pGL3-basic (Promega, Madison, EE.UU.). Estos plásmidos de recombinación se secuenciaron para confirmar su exactitud. Para los ensayos de reportero de la luciferasa, HeLa y SiHa se sembraron en placas de 24 pocillos a ser co-transfectadas con 100 ng de pGL3-C o pGL3-T construye, 50 pmol /l de sintetizado químicamente miRNAs miR-135b (GenePharma, Shanghai, China) o miRNA de control negativo usando Lipofectamine 2000 transfección reactivo (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). En cada transfección, se utilizó 20 ng de pRL-TK plásmido (Promega, Madison, EE.UU.) para corregir la eficiencia de transfección. Cada transfección se llevó a cabo por triplicado. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, y la actividad luciferasa se midió con un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega, Madison, EE.UU.) y se normalizaron frente a la actividad del gen de luciferasa de Renilla.
7. El análisis estadístico
Se calculó el poder estadístico como se describe anteriormente [25]. Se realizó un χ
2 de prueba para realizar una comparación de las variables categóricas, incluyendo la frecuencia del genotipo y algunas características demográficas. La prueba t de Student, Mann-Whitney U-test o análisis de la varianza se realizó para comparar las variables continuas, tales como la edad, el suero de IL-16 Nivel y el reportero de la expresión, en su caso. Las asociaciones entre el
se estimaron IL-16
variantes y el riesgo de cáncer de cuello uterino por el cálculo de las RUP y sus IC del 95% a partir de los análisis de regresión logística multivariable con un ajuste por la edad, índice de masa corporal, el tabaquismo y la familia antecedentes de cáncer. Para evitar una falsa asociación causada por múltiples pruebas, la probabilidad informe de falsos positivos (FPRP) se calculó de acuerdo con el método descrito por Wacholder et al. [26]. Hemos establecido un umbral de 0,2 como FPRP y se le asigna una probabilidad a priori de 0,01 para detectar un OR de 1,50 (para los efectos de riesgo) o 0,67 (para los efectos protectores) para una asociación con los SNPs o características clínico-demográficas. El equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) de los SNPs entre los controles se evaluó por el χ
2 de prueba. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS (versión 13.0, Chicago, IL, EE.UU.). Un valor de
P
. & Lt; 0,05 se consideró significativo (dos colas)
Resultados
1 Características de la población
Se analizaron en total 840 pacientes con cáncer de cuello uterino y 934 controles en los Estudios 1 y 2. las características demográficas y clínicas de los pacientes y los controles se presentan en la Tabla 1. no hubo diferencias significativas en la distribución de la edad, la raza, el tabaquismo, nivel de educación, y estado civil estado entre los controles y los casos en el Estudio 1, Estudio 2 y todos los sujetos combinados. Sin embargo, los casos tenían más probabilidades de ser más jóvenes en la edad al primer parto (
P = 0,038
) y con la infección por el VPH (
P Hotel & lt; 0,001) que los controles. infección por el VPH todavía se mantuvo significativamente asociada con el cáncer de cuello uterino después de considerar la FPRP que era inferior a 0,2. Estas dos variables se ajustaron para que cualquier efecto de confusión residual en regresión logística multivariante análisis posteriores.
2 Asociación de los SNP dentro de los sitios de los genes relacionados con el cáncer de cuello uterino con el riesgo de cáncer
miARN vinculante
Más de 99% de las muestras se genotipo con éxito para cada SNP, y el experimento paralelo, con la seleccionados al azar 300 muestras adquiridas genotipo de datos totalmente consistentes con el análisis original. La Tabla 2 muestra la lista de SNPs seleccionados dentro de los sitios de unión de miARN-en la 3'-UTR de 37 genes relacionados con el cáncer, el miARN vinculante que potencialmente afectan, y sus frecuencias genotípicas y asociaciones con cáncer de cuello uterino en el Estudio 1. Todos las distribuciones genotípicas observadas entre los controles de Estudio 1 estuvieron en línea con el HWE. Entre los 41 SNPs que se incluyeron en el estudio 1, cinco SNP (rs465646 en
REV3L
gen, rs2239680 en
BIRC5
gen, rs1476215 en
FGF2
gen, rs3213180 en
E2F1
gen, rs1131445 en
IL-16
gen) exhibió una distribución de los genotipos marcadamente diferente entre los casos de cáncer cervical y los controles (
P =
0.003~0.030). Para determinar si existían verdaderas asociaciones significativas o si hubo resultados espurios, se realizó una réplica de analizar estos SNPs en otra población que reside en Shaan Xi, provincia del norte de China. En el Estudio 2, sus frecuencias genotípicas observadas también fueron consistentes con HWE (Tabla 3). Por otra parte, se observa que sólo
IL-16
rs1131445 continuaron mostrando una asociación significativa con el cáncer de cuello uterino. Los sujetos con su TC o CC alelo tenían un mayor riesgo de cáncer de cuello uterino (OR ajustada = 1,51, IC 95% 1,18 a 1,93,
P
= 0,001) con un ajuste por edad, tabaquismo, nivel de estudios, edad a la primiparidad, estado civil, y el estado de la infección por VPH. La asociación entre rs1131445 y el cáncer cervical fue más significativa en los datos que combina Estudio 1 y 2 (OR ajustada = 1,49, IC 95% 1,22 a 1,81,
P = 0,00007
) con el ajuste de las variables antes mencionadas. A continuación, calcula los valores FPRP para todas las asociaciones significativas observadas. Cuando el supuesto de probabilidad previa fue de 0,01, la asociación con el
IL-16
rs1131445 (TC /CC vs.TT) seguía siendo notable en ambos sujetos de estudio (1 FPRP = 0,171) y todos los sujetos (FPRP = 0,011). Dada una OR de 1,5 a un valor nominal de
P = 0,05 para
genotipo frecuencias que van desde 0.20 a 0,40, el poder estadístico de nuestro estudio para detectar una asociación de cada SNP con el cáncer de cuello de útero en el Estudio 2 y el Estudio 1 y 2 combinados se estimó en 81,0 a 91,5% y 95,0 a 98,9%, respectivamente. El análisis de la estratificación no reveló una interacción significativa de las características demográficas y clínicas y el genotipo rs1131445 en el riesgo de cáncer de cuello uterino (datos no mostrados). Además, no hubo correlaciones significativas entre los genotipos de rs1131445 y el estadio clínico y el tipo histológico de cáncer de cuello uterino (datos no mostrados).
3 Suero nivel de IL-16 y su correlación con el
IL-16
rs1131445 genotipo
Dado el notable asociación observada entre la rs1131445 y el riesgo de cáncer de cuello uterino, que investigar más a los IL-16 niveles en suero en los controles y los pacientes con cáncer de cuello uterino, así como el potencial de reglamentación efectos del genotipo rs1131445 en IL-16 en suero. Se seleccionaron 100 pacientes con cáncer de cuello uterino y 80 controles de los sujetos de estudio 2 y examinamos sus niveles séricos de IL-16 por ELISA. El suero de IL-16 de los pacientes con cáncer de cuello uterino aumentó significativamente en comparación con los controles (
P
= 0,001, Figura 1A). Por otra parte, en pacientes con cáncer cervical, había una marcada correlación entre el suero de IL-16 y rs1131445 genotipo (
P
= 0,001). Los pacientes de alelos de transporte de rs1131445 C tenía un suero mayor de IL-16 que los no portadores (
P
& lt; 0,05, Figura 1B). Por otra parte, no se registraron ninguna asociación estadísticamente significativa de IL-16 con el estadio clínico y el tipo histológico del cáncer de cuello uterino en suero (datos no mostrados).
A. Serum IL-16 niveles en los controles y los pacientes con cáncer de cuello uterino, medidos por ELISA. B. Las correlaciones de los niveles séricos de IL-16 con genotipo en los controles y pacientes. Los datos se expresaron como la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a los controles de grupo. +
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con los pacientes con genotipo TT
4 El efecto de rs1131445 en la interacción entre el miR-135b y
IL-16
3. "-UTR
Un supuesto sitio de unión dentro de la 3'-UTR de
IL-16 Opiniones de miR-135b ha sido identificado utilizando miRBase, Miranda, y el software PicTar. También se predijo que la sustitución de la T para el alelo C en rs1131445 podría disminuir la energía libre de Gibbs de los genes miARN-mRNA de unión por 3,93 KJ /mol [16], lo que sugiere que este SNP podría afectar a la
IL-16
la expresión génica mediante la alteración de la afinidad de unión de los genes miARN-mRNA (Figura 2A). Para probar esta hipótesis, un ensayo de luciferasa se realizó en las líneas celulares de cáncer cervical HeLa y SiHa, que transfectadas con el pGL3-C-alelo o construcciones de pGL3-T-alelo acompañado por sintetizado químicamente miRNAs miR-135b o un control negativo miRNA ( Figura 2A). Para ambos constructos, en presencia de miméticos de miR-135b, la expresión de luciferasa se redujo significativamente (Figura 2B-C), lo que confirma el potencial funcional de la interacción de los genes miARN-mRNA. En contraste, los miARN de control negativo sin sitio de unión predecir en el
IL-16
3'-UTR no tiene efecto en la expresión de la luciferasa (Figura 2B-C). Por otra parte, se encontró que el alelo C resultó en un incremento modesto pero estadísticamente significativa de la expresión de luciferasa en comparación con la del alelo T (Figura 2B-C).
A. Esquema de
IL-16
3'-UTR que alberga un sitio putativo de unión a miR-135b, la posición de rs1131445, y el constructo de pGL3-IL-16-3'-UTR-T /C. la actividad de luciferasa relativa C. B y en la presencia de miR-135b o el control negativo miARN se muestra para el
IL-16
3'-UTR con el alelo T y C en el alelo HeLa (B) y SiHa (C) células de cáncer; los datos se muestran como el porcentaje relativo a la actividad de luciferasa de las células transfectadas con el alelo NC y T; la barra de error representa S. E. de tres experimentos independientes; *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,05, ***
P Hotel & lt; 0,01. Carolina del Norte representa el control negativo.
Discusión
En el presente estudio, se proyectó fuera una variante de susceptibilidad al cáncer de cuello uterino desde el sitio de unión miARN-SNPs en 37 genes relacionados con el cáncer por una estudio de dos etapas. Se encontró que el alelo SNP rs1131445 C en la 3'-UTR de
IL-16
se asoció con un mayor riesgo de cáncer de cuello uterino. El uso de un ensayo de luciferasa, se encontró que los genes miARN-135b disminuyó marcadamente la expresión de la luciferasa de pGL3-IL-16-3'-UTR construye en las líneas celulares de cáncer cervical HeLa y SiHa. Más importante, estos efectos inhibitorios de los genes miARN-135b se debilitaron por la sustitución de la T para el alelo C en rs1131445. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las variaciones en los sitios diana putativo miARN podrían constituir un factor de susceptibilidad para el cáncer de cuello uterino.
IL-16 se sintetiza por diversas células del sistema inmune y del parénquima, incluyendo CD4 y CD8 células T, eosinófilos, /células dendríticas de los macrófagos, mastocitos, epitelio bronquial, y fibroblastos [27]. La proteína traducida directamente de
IL-16
ARNm es una molécula precursora y debe escindirse en dos fragmentos por la caspasa-3. La IL-16 escindido bioactivo es liberado después de la estimulación por la histamina o la serotonina y actúa como un factor quimioatrayente para regular la respuesta inflamatoria [27]. Recientemente, IL-16 se ha reconocido como un factor de promoción importante para los tumores [28], [29], [30], [31]. La producción de IL-16 se correlaciona con el inicio y la progresión de diversos cánceres hematopoyéticos y cánceres sólidos [28]. El constitutiva la expresión de IL-16 también se ha encontrado para regular al alza en los gliomas [29] y el cáncer de próstata [31]. Además, su expresión en el tejido de cáncer de próstata fue correlacionada con la agresividad del tumor y la recaída bioquímica de la enfermedad [31]. Serum IL-16 de elevación de nivel se ha observado en varios tipos de cáncer [32], [33]. Serum IL-16 es un predictor para el desarrollo de metástasis a distancia del cáncer de mama [32]. Además, en el cáncer de mama, la regulación al alza de secretada IL-16 aumenta la infiltración de monocitos en el tejido del tumor [30]
.
Las funciones de IL-16 en la fisiopatología del cáncer cervical siguen siendo en gran medida poco clara. Nuestros resultados de suero de IL-16 en alzado siguientes carcinogénesis cervical y la asociación notable de
IL-16
con el riesgo de cáncer de cuello uterino sugieren que la IL-16 podría regular la carcinogénesis cervical. Esta hipótesis está apoyada por los efectos cancerígenos de la persistencia de la inflamación en el cuello del útero. infiltración de células inmunes en tumores es un determinante crítico para la carcinogénesis cervical [30], [34]. El macrófagos infiltrantes en el cuello del útero se incrementa linealmente con úteros progresión de la enfermedad de cuello de útero, de cuello uterino normal, de bajo grado de lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado, a cáncer invasivo [35]. macrófagos asociados a tumores contribuyen a la progresión del tumor ejerciendo sus múltiples funciones en la proliferación de células tumorales, invasión de células tumorales y la angiogénesis del tumor [36]. Además de los macrófagos, las células T reguladoras CD4
+ puede contribuir a la carcinogénesis mediante la reducción de la eficacia de la respuesta inmune de células T contra el cáncer [37]. En el cáncer cervical, HPV-específico CD4
+ células T suprimen de citoquinas (IFN-γ, IL-2) producción de interferir con la respuesta inmune anti-tumor [38]. IL-16 puede ser expresado por las células epiteliales en condiciones inflamatorias [39] y sirve para chemoattract monocyptes /macrófagos y CD4
+ células T al sitio de la infección [40]. Por otra parte, secretada IL-16 estimula monocyptes /macrófagos para producir diversas citocinas proinflamatorias [41]. Por lo tanto, es plausible que la regulación positiva de IL-16 en la inflamación inducida por el VPH podría promover la carcinogénesis por la hiperfunción de los macrófagos, VPH específicos CD4
+ células T u otras células inflamatorias.
Aquí, nos proporcionan la primera evidencia de que rs1131445 en el sitio de unión de miR-135b de
IL-16
3'-UTR, que puede afectar a la IL-16 expresión de la proteína al interferir con la función supresora miR135b, se asoció significativamente con el riesgo del cáncer de cuello uterino. Un ensayo funcional in vitro indicó que la transfección de células HeLa y SiHa que lleva la
IL-16
3'-UTR con miR-135b imitan reduce significativamente la expresión de luciferasa, lo que sugiere que la IL-16 podría estar dirigida por miR-135b. El rs1131445 cambio de T a C inhibe la interacción de miR-135b con
IL-16
3'-UTR y regula al alza su expresión. En consonancia con esta especulación, el análisis in vivo reveló que los pacientes que portan el alelo rs1131445 C tuvieron un suero niveles de IL-16 que los no portadores, lo que llevó a un suero de IL-16 de los pacientes en comparación con los controles sanos elevada. La regulación al alza de miR-135b se ha encontrado en el cáncer cervical [42], lo que podría inhibir la expresión de
IL-16
apuntando su extremo 3 'UTR. El alelo rs1131445 C perjudica la unión de miR-135b a la diana y conduce a una mayor expresión constitutiva de
IL-16
y posterior liberación de suero. Dadas las importantes funciones reguladoras de la liberación de IL-16 en la respuesta inmune y el consiguiente nivel del microambiente inflamatoria local, se esperaría que los individuos que portan el alelo C rs3134615 tener un riesgo elevado de cáncer de cuello uterino. En conclusión, nuestros datos sugieren que rs1131445, como una variante funcional, podría modular el riesgo individual de cáncer de cuello uterino probablemente por la desregulación de la regulación post-transcripcional de los genes miARN-135b en
IL-16
expresión. Aunque nuestro estudio se utilizó un número razonable de los pacientes y los controles y métodos estadísticos rigurosos, no podríamos descartar completamente la posibilidad de que los resultados falsos surgieron de nuestro diseño de estudio de asociación caso-control debido a la casualidad o la estratificación de la población. Por lo tanto, se requiere un mayor estudio de replicación a gran escala utilizando diferentes poblaciones étnicas, o el análisis basado en la familia, o el diseño de cohorte prospectivo para producir resultados muy concluyentes. También se requiere que los análisis funcionales adicionales para aclarar las funciones exactas de IL-16 en la génesis del cáncer de cuello uterino y la progresión en el futuro.
Reconocimientos
Agradecemos profundamente a todos los pacientes y voluntarios para participar en este estudio.