Extracto
La proteína del citoesqueleto wave3 promueve la invasión y la metástasis del cáncer. Hemos demostrado que la activación mediada por wave3 de la invasión de células de cáncer se debe, en parte, a su regulación de la expresión y actividad de metaloproteinasas de la clave (MMPs), incluyendo MMP9, que está implicado en el centro de la degradación invadopodios mediada de la matriz extracelular ( ECM). MMP9 es también un importante gen diana NFkB, lo que sugiere una posible relación de wave3 de esta vía, que tratamos de investigar. Mecánicamente, se encontró que la pérdida de wave3 en células de cáncer conduce a la inhibición de NFkB señalización como resultado de una disminución de la translocación nuclear de NFkB y por lo tanto pérdida de la activación de NFkB genes diana. Por el contrario, la sobreexpresión de wave3 fue suficiente para mejorar la actividad de NFkB. Ambos manipulaciones farmacológicas y genéticas de moléculas efectoras NFkB muestran que la consecuencia biológica de pérdida de la función wave3 en la vía de NFkB resultado la inhibición de la formación y la degradación de ECM invadopodios por las células cancerosas, y estos cambios son una consecuencia de disminución de la expresión y la actividad de MMP9. La pérdida de wave3 también sensibiliza las células cancerosas a la apoptosis y la muerte celular impulsada por TNFa, a través de la inhibición de la vía pro-supervivencia AKT. Nuestros resultados identifican una función novedosa de wave3 en la señalización de NFkB, donde su actividad es esencial para la regulación de invadopodios y la degradación de ECM. Por lo tanto, la inhibición específica terapéutico de wave3 se sensibilizar a las células cancerosas a la apoptosis y la muerte celular, y suprimir la invasión del cáncer y la metástasis
Visto:. Davuluri G, Augoff K, Schiemann WP, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2014 ) wave3-NFkB interacción es esencial para la supervivencia y la invasión de las células cancerosas. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10.1371 /journal.pone.0110627
Editor: Chengfeng Yang, de la Universidad del Estado de Michigan, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Julio, 2014; Aceptado: September 16, 2014; Publicado: 16 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Davuluri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones P01 HL073311 y R01 HL096062, Instituto Nacional de Salud, NIH.gov, EFP; y CA43703 subvención P30, Caso del Centro de Cáncer Integral, Case.edu, a KS-A y WPS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es un proceso complejo que requiere de células de cáncer de escapar de su sitio primario, sobrevivir en el sistema de la sangre /linfático y después de establecer un nuevo nicho en un sitio distante [1]. Durante este proceso, también se conoce como la cascada de la invasión de metástasis, las células cancerosas utilizan protuberancias ricos F-actina especializadas llamadas invadopodios, para concentrar la actividad enzimática de MMP para degradar el ECM, permitiendo así que las células cancerosas de invadir y migran a través de su microambiente [2], [3]. Las proteínas WASP /WAVE desempeñan papeles centrales en múltiples procesos celulares, incluyendo la forma celular, la motilidad, la citocinesis, así como la invasión de células de cáncer [4] - [6]. Wave3, en particular, ha demostrado ser esencial para la motilidad y la invasión de células de cáncer [7] - [9], contribuyendo a la formación de extensiones lamellipodia en el borde de ataque de las células invasoras [8], [10]. La expresión de wave3 también está fuertemente enriquecido en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama (CM) [11] - [14]. De hecho, el aumento de la expresión y la actividad de wave3 se demostró que contribuirá la metástasis del cáncer de mama triple negativo (forma de cáncer), el subtipo más agresivo de BC [14] - [16].
la activación de NFkB El factor nuclear es bien conocido por estar implicado en la supervivencia, la invasión y la metástasis de diversos tipos de cáncer [17], [18]. La activación de la vía de NFkB es necesario para diversas respuestas fisiológicas y patológicas que van desde el montaje de una respuesta inmune de éxito y a la supervivencia y proliferación de células del cáncer [19] - [21]. La familia de factores de transcripción NFkB de compone de cinco miembros, p50, p52, de RelA (p65), RelB y c-Rel, que forman dímeros homomeric o heteroméricos para activar la transcripción de los genes diana [22]. En las células en reposo, NFkB se mantiene en un estado transcripcionalmente inactivo al ser secuestrado en el citoplasma de los complejos de proteínas con los miembros de los inhibidores de la familia IkappaB (I? B), incluyendo I? B?, IκBβ, IκBε. En la vía clásica, TNFa puede inducir I? B quinasa (IKK) mediada por la fosforilación y degradación de I? B? Proteasomal, seguido por la fosforilación y la translocación nuclear del heterodímero p50-p65 para activar la transcripción de NFKB genes diana [23]. NFkB se ha demostrado que estimula la producción de MMPs, incluyendo MMP1, MMP3, y MMP9 [24] - [26]. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que wave3 también puede regular la expresión y actividad de estas MMP, lo que sugiere el papel potencial wave3 /NFkB interacción en la regulación de la actividad de MMP9 y invadopodios en células de cáncer [8], [10].
a continuación se presentan pruebas de que la actividad de promoción de la metástasis de wave3 se logra en parte a través de su regulación de la señalización de NFkB en las células cancerosas. Se demuestra que la pérdida de wave3 en el BC metastásico MDA-MB-231 células como resultado la inhibición de la actividad de NFkB. Por el contrario, la sobreexpresión de wave3 mejora la señalización de NFkB. Se demuestra que se requiere la modulación mediada por wave3 de NFkB para la formación de invadopodios así como la expresión y la actividad de MMP9 que son necesarios para las células cancerosas para degradar la ECM. Finalmente, se muestra que la inhibición de la focalizado wave3 sensibiliza a las células cancerosas a la apoptosis y muerte celular a través de la inhibición de Akt y la supervivencia de la caspasa vías descendentes de NFkB. En consecuencia, nuestros datos establecen una nueva función para wave3 que es fundamental para la regulación de la señalización de NFkB y apoyan el uso de inhibidores de wave3 en terapias de combinación para dirigirse específicamente a la metástasis del cáncer.
Procedimientos Experimentales
Los anticuerpos
conejo anti-wave3 (1:1000), de conejo anti-MMP9 (1:1000), de conejo anti-MMP-2 (1:1000), de conejo anti-p38 (1:1000), de conejo anti fosfo p38 (1:1000), ERK fosfo conejo (1:1000), ERK conejo (1:1000), de conejo anti fosfo AKT (Ser473; 1:1000), de conejo anti panAKT (1:1000), de conejo anti fosfo JNK (1 :1000), de conejo anti-JNK (1:1000), p65 de ratón anti-fosfo (Ser536) (1:1000), de conejo anti-Cortatcin son de Tecnologías de señalización Celular. (Danvers, MA); ratón anti-GFP, ratón anti-WAVE2 (1:3000), ratón anti-WAVE1 (1:3000) son de Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA); p65 de conejo anti-NFkB (1:5000) de Biolegend (San Diego, CA), de conejo anti NAP1 (1:2000), de conejo anti Abi1 (1:5000), de conejo anti CYFIP2 (1:3000), ratón anti-actina (1:5000), de conejo anti-Myc (1:1000) son de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón IgG (1:5000) y de cabra de rábano picante IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa (1:5000) de Calbiochem; y Alexa 488 conjugada con IgG anti-conejo y Alexa 568-conjugado anti-IgG de ratón, Alexa 568 faloidina conjugada son de Invitrogen. Vecta-escudo con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol era de Vector Laboratories (Burlingame, CA). reactivos de electroforesis en gel eran de Bio-Rad (Hercules, CA).
siRNA y shRNA expresión de genes desmontables
Se utilizó el on-Targetplus SmartPool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), y I? B? SignalSilence siRNA (Cell Signaling Technology) para knockdown transitoria de la expresión de WAVE2, wave3, CYFIP2 y Abi1, respectivamente, como se describe anteriormente (14). caída estable de wave3 se logró a través de la transfección de células MDA-MB-231 y BT549 BC ya sea con el control no la orientación shRNA o los clones wave3 MISSION shRNA (Sigma) seguido de la selección de puromicina de clones positivos como se describe anteriormente (12).
Cultivo celular
células humanas MDA-MB-231 BT549 y MCF7 BC fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% fetal de suero bovino (FBS), 100 unidades de penicilina /ml, 100 g de estreptomicina /ml. Para la estimulación con TNF, las células se sometieron primero a privación de suero durante una noche en DMEM sin suero bovino fetal, y luego tratados con 50 ng /ml TNF o el DMSO diluyente (condiciones basales) como el tratamiento de control negativo para 15 min. Para la inhibición de la síntesis de proteínas, las células se trataron con cicloheximida (CHX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 50 mg /ml y se incubó durante 24 h. Para la inhibición del proteasoma, las células fueron tratadas con MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a una concentración de 20 mM y se incubaron durante 24 h. La Akt-inhibidor de MK-2206 (Select Chemicals, Yorktown, TX) se utilizó a la concentración final de 10 mM para tratar las células durante 16 h mientras que la IKKβ-inhibidor (EMD Millipore, Billerica, MA) se utilizó a la concentración final de 10 mM para tratar las células durante 24 h.
la citometría de flujo
231-MDA-MB o BT549 células transfectadas, ya sea con el shRNA de control no la orientación o la shWAVE3, fueron tratados con TNFa para 3 h y se propagaron en medio de cultivo de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de FBS y puromicina (5 mg /ml). cultivos de células subconfluentes se separaron por tripsinización y se lavaron con solución salina equilibrada de Hank con Ca2 +, Mg2 +, y 0,1% de BSA. Las células se procesan para citometría de flujo como se describe por el fabricante (kit de detección de muerte Roche In-Situ Cell, fluoresceína). Yoduro de propidio se ha utilizado para detectar las células muertas. Todos los datos fueron adquiridos en un instrumento BD LSRII y se analizaron con el software FlowJo 7.6.3 (TreeStar). La unión no específica del anticuerpo secundario solo a las células se restó de todos los datos de citometría de flujo para obtener los valores de intensidad de fluorescencia resultantes que se muestran.
Análisis de inmunotransferencia
lisados de células completas que contienen cantidades similares de totales proteínas (~ 50 g) se resolvieron en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10%, seguido de la transferencia a nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) o Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA) membranas usando el Bio-Rad gel y aparato de transferencia. Las membranas se incubaron en la leche bovina o toda la albúmina de suero 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de incubación con el anticuerpo primario (como se especifica) la noche a 4 ° C. a continuación, las membranas se lavaron y se incubaron en el anticuerpo secundario apropiado a temperatura ambiente durante 1 hora, y los inmunocomplejos se visualizaron usando el kit de detección de quimioluminiscencia Western Lights de Perkin-Elmer (Boston, MA). Las señales se cuantificaron utilizando el software ImageJ según los parámetros descritos en la guía del usuario ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). se presentan los valores promedio a partir de 3 manchas diferentes. Se utilizó
NFKB luciferasa reportero de ensayo
Cignal NFkB reportero kit de ensayo de Qiagen Inc (Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, MDA-MB 231 o BT549 células fueron co-transfectadas con siWAVE3 o siWAVE2 con el reportero de NFkB, controles negativos y positivos, junto con un indicador de luciferasa de Renilla construir para la normalización interna. Después de 24 h, las células se trataron con 50 ng /ml de TNF humano recombinante durante 30 min a menos que se especifique lo contrario. ensayos de luciferasa dual (Promega, Madison, WI) se llevaron a cabo en una placa de 96 pocillos usando Veritas microplaca luminómetro (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), y valores de la actividad promotora se expresan en unidades arbitrarias después de la normalización de la actividad de la luciferasa del reportero de Renilla. Los experimentos se realizaron por triplicado, y las desviaciones estándar de los valores se indican.
microscopía de inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos en PBS a temperatura ambiente y se lavó con PBS. Después las células se permeabilizaron en 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 15 min, se lavaron de nuevo con PBS, y se incubaron en la solución de bloqueo que contiene 5% de albúmina de suero bovino (Sigma) en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Primario, así como anticuerpos secundarios se diluyeron a la concentración recomendada en 5% de albúmina de suero bovino en PBS. Las células se incubaron con el anticuerpo primario durante 1 h, se lavaron con PBS, y luego incubadas con el anticuerpo secundario durante 1 h. Los filamentos de actina (F-actina) se tiñeron con faloidina conjugada con rodamina (Molecular Probes, Eugene, OR) en PBS. Los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos de objetos usando Vectashield medio de montaje que contiene 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las imágenes de fluorescencia fueron capturados utilizando una microscopía de Nikon TE2000-E invertida. Las señales se cuantificaron utilizando el software ImageJ según los parámetros descritos en la guía del usuario ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Los valores promedio de 5 imágenes diferentes se representaron.
Gelatina Zymography
Gelatina zymography geles de acrilamida (10%) se prepararon de acuerdo con procedimientos estándar [8]. La gelatina se añadió a la solución de gel a una concentración de gelatina final de 1 mg /ml. El sobrenadante libre de células se mezcló con 2 x tampón de muestra, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y 25 l de la mezcla se cargaron en los geles. Después de la electroforesis, el gel se incubó en tampón de renaturalización Zimograma con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación en el tampón de desarrollo de Zimograma a 37 ° C durante al menos cuatro horas. actividad gelatinasa se visualizó por tinción de los geles con azul brillante de Coomassie G250 y se destiñó en ácido acético-metanol-dH
2O (01:03:06). Las áreas de actividad de la proteasa fueron fotografiados con una cámara SLR.
invadopodios ensayo de formación de
ensayos de degradación de gelatina con FITC se llevaron a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabricante (Invitrogen). En breve, los cubreobjetos (18 mm de diámetro) se recubrieron con 50 mg /ml de poli-L-lisina durante 20 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se fijaron con 0,5% de glutaraldehído durante 15 min y se lavó con PBS 3 veces. Después del lavado, los cubreobjetos se invirtieron sobre una gota de 0.2% FITC gelatina conjugado en PBS que contenía 2% de sacarosa, se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS 3 veces, se inactivó con borohidruro de sodio (5 mg /ml) durante 3 min y finalmente se incubaron en 2 ml de medio completo durante 2 h. Las células (2 × 10
5 cada pocillo) se sembraron en cubreobjetos recubiertos de gelatina FITC y se incuba a 37 ° C durante 12 h. Invadopodios y la degradación de ECM se documentaron mediante microscopía confocal de fluorescencia como se describe [27], [28]. Análisis de la señal y la reconstrucción de imágenes en 3D se realizaron utilizando el software ImageJ.
Estadística
analiza
Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Se probaron los resultados de significación utilizando
t
prueba de un Student para datos independientes. Un
p
valor inferior a 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
wave3 se requiere para la actividad NFkB
Para documentar la interacción entre la señalización wave3 y NFkB , se utilizó un ensayo de indicador de NFkB basado en la luciferasa para evaluar los cambios en la actividad de NFkB en presencia y ausencia de wave3. Como control positivo para la activación de NFkB, se utilizó TNFa, un estimulador conocido de la señalización de NFkB. Se encontró que el tratamiento TNFa de células MDA-MB-231 o BT549 aumento de la actividad NFkB por al menos 3 veces en ambas líneas celulares en comparación con células no estimuladas (Fig. S1 S1 en File). Sin embargo, en la wave3-desmontables células (sh-W3) (Fig. 1A recuadro), la actividad de la luciferasa, y por lo tanto la actividad de NFkB, se redujo en al menos 4 veces en comparación con MDA-MB-231 transfectadas con el control no director shRNA (Ctrl-SH) (fig. 1A). Por lo tanto, wave3 se requiere para la actividad NFkB. Esta inhibición de la actividad NFkB era específico para la pérdida de wave3 desde desmontables de expresión WAVE2, otra isoforma WAVE, no tuvo efecto sobre la actividad de NFkB (Fig. S2 en S1 File).
basa-luciferasa (A) ensayo indicador de NFkB en MDA-MB-231 células con transfección estable de un shRNA no director (Ctrl-SH) o la wave3-trageting shRNA (sh-W3). (Recuadro) análisis de transferencia de Western de lisados de proteína de las células descritas en (A) con el anticuerpo anti-wave3. ß-actina se utilizó como control de carga. (*, P & lt; 0,05). (B) Análisis de Western blot con los anticuerpos indicados de lisados de proteínas de Ctrl-sh MDA-MB-231 y dos clones derivados-shWAVE3 diferentes (sh-sh-W3-1 y W3-2), antes y después del tratamiento TNFa (50 ng /l para 15 min). Los números por debajo de la p-p65 y paneles wave3 indican las veces el cambio de p-p65 y los niveles de wave3, respectivamente, en comparación con las células Ctrl-SH no tratados. (C) Cuantificación de los niveles de p-p65 en las condiciones indicadas. (D) Análisis de transferencia Western con anticuerpo p65 de los lisados fracción nuclear de la Ctrl-sh y las células SH-W3 MDA-MB-231, con o sin tratamiento TNFa. H2b se utilizó como control de carga para la fracción nuclear. Los números de abajo del panel H2B indican los niveles de pliegue cambio p65 con respecto a las células no tratadas Ctrl-sh. (E) Inmuno-tinción para la translocación nuclear (flechas blancas) de la proteína p65 (rojo) en Ctrl-sh y las células shWAVE3 MDA-MB-231. Células núcleos son contra el teñidas con DAPI (azul). (F) La cuantificación de p65 tinción nuclear. Todos los datos son representativos de 3 experimentos independientes, o son la media ± SD (n = 3; *, p & lt; 0,05; prueba t de Student)
La fosforilación de la subunidad p65 NFkB en la serina 536 y su translocación nuclear son pasos necesarios para la activación de NFkB. Encontramos pérdida de wave3 en células MDA-MB-231 para inhibir significativamente (de 3 a 8 veces disminución) los niveles de fosforilación de p65 (Fig. 1B y 1C). Incluso después de la estimulación con TNFa, los niveles de fosforilación de p65 en las células desmontables-wave3 no podían ser restaurados a los niveles encontrados en no atacar a las células transfectadas con shRNA (fig. 1B y 1C). Se encontraron resultados similares en células BT549 (Fig. S3 en el Archivo S1). Además, la translocación nuclear de p65, que es el último paso en la cascada de activación de la señalización de NFkB, también se inhibió de manera significativa en células MDA-MB-231 desmontables-wave3, medida por los niveles de proteína p65 en el núcleo (10 veces disminución) tanto por inmunotransferencia de la fracción nuclear de lisados de células (Fig. 1D) y análisis de inmunotinción (5 veces disminución) de células enteras (Fig. 1E, 1F y Fig. S4 en S1 File). Una vez más, la estimulación de las células desmontables-wave3 con TNFa no aumentó p65 dentro de la fracción nuclear a los niveles encontrados en las células de control transfectadas con el control no la orientación shRNA (Fig. S4 en S1 File). En conjunto, estos datos apoyan aún más la participación de wave3 en la activación de la vía de señalización de NFkB.
wave3 sobreexpresión activa la actividad de señalización NFkB
Para entender mejor cómo wave3 modula la señalización de NFkB, se aplicó una combinación de medios genéticos y farmacológicos para manipular moléculas efectoras en la vía de NFkB. En primer lugar, se examinó si la sobreexpresión de wave3 exógeno puede afectar a la actividad de NFkB. Para ello, overexpressed ya sea solo o GFP proteína de fusión GFP-wave3 en las células MDA-MB-231 y se evaluó la actividad de NFkB. Usando el ensayo de reportero de NFkB basada en luciferasa descrito en la Figura 1A, se encontró sobreexpresión de wave3 (Fig. 2A) estimuló la actividad NFkB por aumento de 3 veces (Fig. 2B). En consonancia con esta observación, wave3-sobreexpresión también estimuló (& gt; aumento de 3 veces) la fosforilación de p65 sin afectar el total de los niveles de expresión p65 (Fig 2C.). Por el contrario, el tratamiento con un inhibidor específico de IKKβ (IKKβ-I), el activador corriente arriba de la señalización de NFkB, embota la estimulación TNF mediada de fosfo-p65 en los-231 MDA-MB células wave3-overexpressing (cambio 0,9 veces en el TNF y células tratadas con IKKβ I vs. cambio 3,2 veces en TNFa células sólo tratadas (Fig. 2D)). Por lo tanto, estos datos apoyan aún más el papel de wave3 en la regulación de la señalización de NFkB. A continuación, monitorizamos fosforilación de la proteína p65 y la rotación de la GFP y wave3 que sobreexpresan las células MDA-MB-231 después del tratamiento con ciclohexamida (CHX), un potente inhibidor de
novo
la síntesis de proteínas. Mientras que se aumentaron los niveles de fosforilación de p65 (~3- a aumento de 4 veces) en las células que sobreexpresan wave3-, el tratamiento con CHX no afectó a los niveles de expresión de p65 total (Fig. 2E). Del mismo modo, el tratamiento con la MG-132, un compuesto que inhibe la degradación de proteínas mediada por proteasoma, no afectó a la mediada por aumento wave3 de p65 fosforilada en el wave3 células que sobreexpresan (Fig. 2F), mientras que los niveles de p65 total se mantuvo sin cambios ( La Fig. 2F). Por lo tanto, estos datos demuestran que la modulación mediada por wave3 de la señalización de NFkB no requiere la participación de wave3 en proteínas neo-síntesis (los datos CHX, Fig. 2E) o t degradación de proteínas mediada por proteasoma (las-MG 132 de datos, Fig . 2F).
(A) análisis de transferencia Western de los niveles de proteína wave3-GFP en células GFP y GFP-W3-expresan. ensayo indicador de NFkB (B) de luciferasa basado en GFP y GFP-wave3 células (*, P & lt; 0,05) que expresa. (C & amp; D) Análisis de transferencia Western con los anticuerpos indicados de lisados de células de la GFP y las células que expresan wave3-GFP. Los números por debajo del panel de GFP indican los niveles de cambio de p-p65 veces con respecto a las células GFP. (E & amp; F) Análisis de transferencia Western con los anticuerpos indicados de lisados de células de la GFP y wave3-GFP expresando células después del tratamiento con ciclohexamida (CHX, E) y el inhibidor del proteasoma MG132 (F). Los números por debajo del panel de GFP indican los niveles de cambio de p-p65 veces con respecto a las células GFP. ß-actina se utilizó un control de carga. Todos los datos son representativos de 3 experimentos independientes, o son la media ± SD (n = 3; *, p & lt; 0,05; prueba t de Student)
mediada por la modulación de la señalización-wave3 NFkB no lo hace requerir otros miembros de la ONDA regulador complejo
wave3, al igual que los otros miembros de la familia WASP /WAVE, se conoce a funcionar como un activador del complejo Arp2 /3 para promover la polimerización de la actina y la remodelación del citoesqueleto. Para las proteínas WAVE para ejecutar esta función reorganización del citoesqueleto, que debe ser incorporado en un complejo de proteínas pentamérica, también conocido como el complejo regulador de ONDA (CMR) que, además de onda de proteínas, también contiene NAP1, Abi1 /2, CYFIP2 y HSPC300 [29]. En consecuencia, hemos abordado la cuestión de si la modulación mediada por wave3 de la señalización NFkB requiere la participación de los demás miembros de la CMR. En primer lugar, hemos demostrado que desmontables mientras mediada por siRNA de wave3 dio como resultado una inhibición significativa (& gt; disminución de 8 veces) de la expresión wave3, no afectó los niveles de expresión de los otros cuatro miembros de la CMR (figura 3A.). A la inversa, siRNAs dirigidos contra Abi1 o CYFIP2, lo que resultó en la pérdida selectiva de la expresión de sus respectivos objetivos, no afectó a los niveles de expresión de los otros miembros de la CMR (Fig. 3A). Funcionalmente, y como se esperaba, wave3-desmontables inhibido NFkB señalización (disminución de 5 veces), como se mide por la fosforilación pérdida de p65 (Fig. 3B). Sin embargo, la disminución de la expresión de cualquiera de los otros miembros de la CMR (Abi1 y CYFIP2) no afectó los niveles de fosforilación de p65 (Fig. 3B). Además, mientras que la estimulación con TNF aumento de los niveles de fosforilación de p65 tanto en el control y desmontables células, los niveles de fosforilación en las células desmontables-wave3 eran más de dos veces menor que en las células control de siRNA o células ABI o CYFIP2 siRNA (Fig. 3B). En conjunto, estos resultados sugieren claramente que la modulación mediada por wave3 de la señalización de NFkB no requiere la participación de los miembros del WRC, y por lo tanto, representa una actividad de wave3 independiente de su propiedad tradicional polimerización de la actina en el WRC.
(a) Western blot con los anticuerpos indicados de células MDA-MB-231 transfectadas transitoriamente con un no-siRNA dirigidos (Ctrl-si) o siRNA dirigidos ya sea wave3 (si-W3), Abi1 si-Abi1), o CYFIP2 (si-CYFIP2). (B) Análisis de transferencia Western con p-p65 y p65 total de anticuerpos a partir de los lisados de células descritas en (A). Los números por debajo del panel de β-actina indican los niveles de cambio de p-p65 veces con respecto a las células no tratadas Ctrl-si. En ambos (A) y (B), β-actina se utilizó como control de carga.
expresión y actividad de MMP9, un gen diana NFkB importante, son inhibidas por la pérdida de wave3
Hemos demostrado anteriormente que desmontables estable de resultados wave3 en la pérdida de la expresión y actividad de varios MMPs, incluyendo MMP1, 3 y 9 [8]. Entre estas MMP, MMP9 es un objetivo importante de la vía NFkB, aumentando la posibilidad de que wave3 podría estar implicado en la regulación mediada por NFkB de MMP9. En primer lugar, se utilizó la transferencia Western para demostrar que la expresión de MMP9 se inhibió como resultado de la caída estable de wave3; la disminución de la proteína MMP9 era ~ 5 veces en MDA-MB-231 (Fig. 4A) y ~ 4 veces en las células BT549 (Fig. S5 en S1 File). Es de destacar que los niveles de expresión de la WAVE1 y WAVE2 no se vieron afectados por la pérdida de wave3, y por lo tanto no tienen relación con los cambios en los niveles de MMP9 causadas por wave3-desmontables (Fig. 4A). A continuación, se utilizó el ensayo de zimografía de gelatinasa para mostrar la actividad MMP9 también se inhibió (disminución de 5 veces) en las células desmontables-wave3 (Fig. 4B). Además, la estimulación con TNFa, que es un activador importante de la vía de señalización de NFkB, mejorado (aumento ~3.5 veces) la actividad de MMP9 en las células de control (Ctrl-SH). Sin embargo, en desmontables células-wave3, la estimulación con TNF fue incapaz de activar MMP9 a los niveles observados en las células de control (Fig. 4C). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la regulación mediada por wave3 de MMP9 se puede ejercer a través de la modulación de la señalización de NFkB. Por lo tanto, la expresión y actividad niveles de MMP9 se pueden utilizar como lectura para la modulación mediada por wave3 de los niveles de la activación de NFkB.
(A) análisis de transferencia de Western con los anticuerpos indicados de lisados celulares de células MDA-MB-231 transfectadas con shRNA no director (Ctrl-SH), y dos clones sh-wave3 diferentes (sh-sh-W3-1 y W3-2). Los números debajo de la wave3 y paneles MMP9 indican los niveles de pliegue cambio wave3 y MMP9 con respecto a las células no tratadas Ctrl-sh. ß-actina se utilizó como control de carga. (B) zimografía de gelatina de MMP9 activa y la MMP-2 en medio acondicionado de las Ctrl-sh sh dos clones-W3. C) zimografía de gelatina de MMP9 activada antes y después del tratamiento con TNF en los medios de comunicación de los dos clones sh-sh-W3 Ctrl y acondicionada. En ambas (B) y (C), los geles teñidos-Red-Ponceau se muestran como controles de carga. Los números debajo de los paneles de zimografía indican las veces el cambio de los niveles de MMP9 con respecto a las células Ctrl-SH no tratados.
wave3 se requiere para la formación de invadopodios y la degradación de ECM a través de NFkB señalización
la importancia biológica de la pérdida de wave3 y su efecto en la señalización NFkB se investigaron mediante la capacidad de las células cancerosas para formar invadopodios y degradar el ECM, los cuales requieren la activación de MMP9 impulsada por la señalización de NFkB. MDA-MB-231 células, al igual que las líneas celulares de cáncer más altamente invasivos, forman invadopodios
in vitro
cuando sembradas en los componentes de la matriz extracelular. Para controlar la actividad de MMP9 dentro invadopodios, las células MDA-MB-231 se revistieron sobre cubreobjetos recubiertos con gelatina fluorescentes. Después de la tinción para actina F, se observaron invadopodios como agrupaciones de puntos como de F-actina en la superficie ventral de las células que está en contacto directo con el sustrato de gelatina (panel Fig. 5A a). Estas estructuras invadopodios se solapan con los sitios de degradación de la matriz de gelatina (la Fig. 5A, paneles b y c) y pueden ser visualizados en 3 dimensiones (3-D) reconstruyen imágenes como invaginaciones en el lecho de gelatina (Fig. Panel de 5A d) . Cortactin es un marcador muy conocido por invadopodios (Fig. S6 en Archivo S1). Se encontró que el tratamiento de TNFa MDA-MB-231 resultó en co-localización de wave3 con Cortactin en estructuras invadopodios (Fig. 5B), en consonancia con la participación de wave3 en la formación invadopodios.
(A) Confocal microscópica micrografías de células MDA-MB-231 cultivadas en gelatina marcado con FITC y se tiñeron para (a) filamentos F-actina (rojo). Las puntas de flechas blancas señalan las estructuras de invadopodios (manchas blancas). (B) Las zonas de la degradación de ECM (negro punta de flecha) se muestran como puntos negros. Las estructuras invadopodios coinciden con las áreas de la degradación de ECM en la imagen combinada (c). (D) En la imagen reconstruida en 3 dimensiones las flechas negras señalan invadopodios (rojo) la infiltración de la cama de gelatina (verde). (B) Micrografías confocales microscópicas de MDA-MB-231 células cultivadas en cubreobjetos recubiertos de colágeno, tratadas con TNF (50 ng /l) durante 15 min, y se tiñeron para wave3 (panel izquierdo) y Cortactin (panel medio). Las puntas de flecha apuntan a áreas con invadopodios donde tanto Cortactin y wave3 colocalize en la imagen fusionada en el panel de la derecha (manchas amarillas).
Se utilizó este ensayo invadopodios a base de gelatina para evaluar el efecto de wave3 en la formación de invadopodios y, posteriormente, la degradación de la ECM por las células MDA-MB-231. Se encontró una reducción significativa de tanto el número de invadopodios (Fig. 6A, panel de la izquierda y la Fig. 6B), así como el área total de la degradación invadopodios mediada de gelatina en las células wave3-desmontables comparación con el control shRNA no director (Ctrl-sh) MDA-MB-231 células (Figura 6A, panel central y la Fig. 6C). No hubo más de 3 veces la reducción (p & lt; 0,05) en el número de invadopodios (Fig 6B.) Y más de 10 veces la reducción (p & lt; 0,05) en el área de la degradación de ECM en las células wave3-desmontables en comparación con el las células de control (Fig. 6C). Mientras Nuestros datos muestran que la pérdida de wave3 inhibe tanto la formación invadopodios y la degradación de ECM, este fenómeno parece afectar a la mayoría de las células observadas bajo el microscopio, y un cuidadoso análisis de nuestros datos no se encontró una disminución en el número de células que forman invadopodios y degradar el ECM, más bien, la pérdida de wave3 parece tener un efecto global. El tratamiento con TNF, lo que resultó en un aumento significativo en el número de invadopodios en las células de control (p & lt; 0,01), no fue capaz de rescatar la inhibición de la invadopodios causada por la pérdida de wave3 (Fig 6D & amp;. 6E). Por el contrario, la sobreexpresión de wave3 en las células no invasivas MCF7 BC (Fig S7A en Archivo S1), que habíamos mostrado previamente para estimular su capacidad de invasión [30], se tradujo en un aumento claro tanto en la formación invadopodios y degradación de la gelatina por TNFa Las células estimuladas (Fig. S7B en archivo S1).
(a) micrografías de microscopía confocal de control de shRNA- o SH-wave3-que expresan las células MDA-MB-231 cultivadas en gelatina marcado con FITC y se tiñeron para F filamentos de actina (paneles de la izquierda). Las puntas de flechas blancas señalan las estructuras de invadopodios (manchas blancas).