Extracto
caja forkhead M1 (FoxM1) factor de transcripción oncogénico representa una atractiva diana terapéutica en la lucha contra el cáncer, ya que se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos. Recientemente, usando un sistema de ensayo basado en células se identificaron tiazol antibiótico siomicina A como un inhibidor de la actividad transcripcional FoxM1. En este caso, nos informan de que los antibióticos tiazol estructuralmente similares, tioestreptona también inhibe la actividad transcripcional de FoxM1. Además, hemos encontrado que estos thiopeptides no inhibieron la actividad transcripcional de otros miembros de la familia Forkhead o algunos factores de transcripción no relacionados. Otros experimentos revelaron que tiazol antibióticos también inhiben la expresión FoxM1, pero no la expresión de otros miembros de la familia caja Forkhead. Además, se encontró que los antibióticos de tiazol inhibieron eficazmente el crecimiento y se indujeron potente apoptosis en líneas celulares de cáncer humano de origen diferente. apoptosis en correlación con la supresión de la expresión FoxM1 tiopéptido inducida, mientras que la sobreexpresión de FoxM1 parcialmente protegida células cancerosas de la muerte celular mediada por antibióticos tiazol. Estos datos sugieren que siomicina A y tioestreptona pueden dirigirse específicamente a FoxM1 para inducir la apoptosis en las células cancerosas y los inhibidores de FoxM1 /antibióticos tiazol podrían desarrollarse potencialmente como nuevos medicamentos contra el cáncer contra la neoplasia humana
Visto:. Bhat UG, Halasi M, Gartel al (2009) Los antibióticos de tiazol Objetivo FoxM1 e inducir la apoptosis en células de cáncer humano. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10.1371 /journal.pone.0005592
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Marzo, 2009; Aceptado: 14 de abril de 2009; Publicado: 18-may 2009
Derechos de Autor © 2009 Bhat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH 1RO1CA1294414-01A1 y 1R21CA134615-01 y IDPH de entradas para la curación Beca de investigación a ALG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
caja forkhead M1 (FoxM1) [1], un factor de transcripción de la familia forkhead [2] es uno de los reguladores positivos clave del ciclo celular. Tanto la expresión y la actividad transcripcional de FoxM1 se asocia con el estado de proliferación de las células [1]. Se expresa en todos los tejidos embrionarios y en la proliferación de células de origen epitelial y mesenquimal [3], [4]. FoxM1 juega un papel en el desarrollo del sistema nervioso [5] y se requiere para la diferenciación hepatoblast hacia linajes de células epiteliales biliares [6] y para el desarrollo embrionario de la vasculatura pulmonar [7]. También se indujo la expresión durante FoxM1 pulmón e hígado de regeneración y reparación de tejidos. La actividad transcripcional de FoxM1 depende de las vías oncogénicas de Ras-MAPK y Sonic Hedgehog [8], [9]. FoxM1 regula al alza transcripcionalmente genes diana implicados en la progresión del ciclo celular y es fundamental para G1 /S y G2 /M transición, y también para la ejecución del programa mitótico porque-agotadas las células FoxM1 dejan de avanzar más allá de la etapa profase de la mitosis [10] .
Mientras FoxM1 es uno de los genes más sobreexpresados en tumores sólidos humanos (revisado en [11], [12]), su expresión se desactiva en las células diferenciadas terminalmente, que no se dividen [1]. FoxM1 se sobreexpresa en los carcinomas hepatocelulares [13], los carcinomas de páncreas [14], el cáncer de mama [15], [16], no pequeñas carcinomas de pulmón de células [17], astrocitomas y glioblastomas [18] anaplásicos, carcinomas de células basales [9] y colangiocarcinomas [19]. Dado que la función de FoxM1 se inhibe por varios supresores de tumores, tales como p19-ARF, pRb, p16 y p53 y activado por múltiples vías de señalización oncogénicas, FoxM1 puede ser clasificado como un proto-oncogén. La inhibición de la expresión FoxM1 por ARN de interferencia pequeños [20], [21] o por un péptido que contiene los aminoácidos 24-46 de p19
ARF [22], [23] redujo el crecimiento celular independiente de anclaje in vitro y el retraso tumor hepático crecimiento en ratones. Del mismo modo, la supresión de FoxM1 en células de cáncer pancreático por la interferencia de ARN condujo a la inhibición de su potencial metastásico [24]. Estos estudios han demostrado que FoxM1 es esencial para la viabilidad de las células cancerosas y su inhibición puede obstaculizar el desarrollo de cáncer, lo que sugiere que la orientación FoxM1 por moléculas pequeñas podría representar una nueva estrategia para el desarrollo de nuevos medicamentos contra el cáncer [25], [26], [27] , [28].
Anteriormente, utilizando un sistema de cribado basado en células desarrollado por nuestro laboratorio, hemos identificado un tiopéptido, siomicina a (NSC-285116) como un potente inhibidor de FoxM1 [25]. Además, demostramos que siomicina A y otro similares a los antibióticos tiazol, tioestreptona, que ya ha sido aprobado por la FDA para uso en animales, inhiben FoxM1 e inducir la apoptosis en células de melanoma [26], [29]. Aquí, hemos demostrado que los antibióticos de tiazol, siomicina A y tioestreptona inhiben FoxM1 actividad transcripcional y de expresión. También se encontró una correlación directa entre la supresión de la expresión FoxM1 y la inducción de apoptosis por los thiopeptides en diferentes líneas celulares de cáncer humano. Además, se demostró que FoxM1 podría proteger contra la muerte celular inducida por los antibióticos de tiazol, lo que sugiere que estos fármacos pueden ejercer parcialmente su actividad contra el cáncer a través de la supresión de FoxM1.
Resultados
Recientemente, obtuvimos evidencia de que otro antibiótico tiazol, tioestreptona, que difiere estructuralmente de a siomicina por sólo 2 residuos (Fig. 1A) posee propiedades anti-cáncer [30] y propiedades anti-FOXM1 [29] similar a siomicina A. para evaluar los efectos de tioestreptona en FoxM1 actividad transcripcional y también para estudiar cómo los antibióticos de tiazol afectan a la actividad transcripcional de otros miembros de la familia forkhead, hemos desarrollado la línea celular C3-Luc2.3-FoxO1. células C3-Luc2.3-FoxO1 son un derivado de células de osteosarcoma U2OS con una proteína inducible por doxiciclina FoxM1-GFP fusión [25], un FoxO1 constitutivamente activa tamoxifeno inducible proteína de fusión (AAA) y una -ER FoxM1 /FoxO1 dependiente la luciferasa de luciérnaga. En este sistema, hemos sido capaces de inducir selectivamente la actividad transcripcional FoxM1 por la adición de doxiciclina o la actividad transcripcional FoxO1 por la adición de tamoxifeno. En primer lugar, para probar cómo tioestreptona afecta a la actividad transcripcional FoxM1 comparación con siomicina A, las células fueron tratadas con una combinación de doxiciclina y los antibióticos de tiazol y 16 horas más tarde se midió la actividad de luciferasa. Se encontró que la represión de la actividad transcripcional FoxM1 por tioestreptona es comparable a la de siomicina A (Fig. 1B), lo que indica que ambos antibióticos de tiazol inhiben la actividad transcripcional FoxM1. A continuación, para determinar si los antibióticos de tiazol inhiben la actividad transcripcional de otros miembros de la familia forkhead como FoxO1 [31], se trató la línea celular C3-Luc2.3-FoxO1 con una combinación de tamoxifeno y los thiopeptides. Hemos encontrado que la adición de tamoxifeno dio lugar a la inducción de la actividad luciferasa FoxO1-dependiente, pero el tratamiento con los antibióticos de tiazol no redujo este valor (Fig. 1B). Dado que todos los miembros de la familia comparten forkhead a /alas de hélice de dominio de unión a ADN forkhead conservada que es responsable de la unión a los sitios de consenso, nuestros datos sugieren que los thiopeptides no se dirigen a este dominio y que pueden regular negativamente la única FoxM1, pero no otra miembros de la familia forkhead
(A) la estructura química del antibiótico tiazol, tioestreptona que difiere de siomicina A por sólo dos residuos (thiostrepton-R1-R2:. isoleucina-alanina; Siomycin- R1-R2: valine- deshidroalanina). (B) Los ensayos de luciferasa después del tratamiento de la línea celular C3-Luc2.3-FoxO1 con la combinación de cualquiera de 1 mg /ml de doxiciclina (Doxy) o 300 nM tamoxifeno (Tam) y 3 M de siomicina A (SIO) o (tioestreptona Tio), respectivamente reveló que tioestreptona también es un regulador negativo de la actividad transcripcional FoxM1 y antibióticos de tiazol inhiben la actividad transcripcional FoxM1 entre los miembros de la familia Forkhead. antibióticos (C) tiazol downregulated niveles de proteína FOXM1, pero no los niveles FoxA1, FoxO1 y FOXO3A como se detectó por inmunotransferencia. (D) La línea celular HCT116-p53RE-Luc, que expresan de forma estable la luciferasa de luciérnaga bajo el control de múltiples elementos de respuesta a p53 tratadas con la concentración indicada de siomicina A o tioestreptona. Después del tratamiento durante la noche se midió la actividad de luciferasa. línea celular de cáncer (E) de colon SW480 se transfectadas transitoriamente con el TOPflash Tcf /LEF-dependiente y el control FOPFLASH construye. Veinticuatro horas de transfección siguientes se trataron las células con 3 M de siomicina A o tioestreptona. Al día siguiente, se midió la actividad luciferasa. (F) células de cáncer de pulmón A549 se transfectaron transitoriamente con el GLI-dependiente GLIBS-Luc, el control miniTK construcciones de reportero y el plásmido de expresión GLI. Las células fueron tratadas con la concentración indicada de los thiopeptides 24 horas después de la transfección y la actividad de la luciferasa se midió al día siguiente. Bares en B, D-F son valores medios representativos de tres experimentos +/- SD.
En nuestros informes anteriores hemos encontrado inesperadamente que siomicina A no sólo regulado por disminución de la actividad transcripcional FoxM1, pero también redujeron el ARNm y los niveles de proteína de FoxM1 [25], [29]. En este estudio, hemos demostrado que tioestreptona también regula a la baja los niveles de proteína FOXM1 en una medida similar a siomicina A (Fig. 1C). Además, se encontró que los antibióticos de tiazol no disminuyeron los niveles de proteína de otros miembros de la familia forkhead como FoxA1, FoxO1 y FoxO3a (Fig. 1C), más el apoyo a la idea de que tiazol antibiótico siomicina A y tioestreptona son inhibidores específicos de FoxM1. Para explorar adicionalmente la especificidad potencial de los antibióticos para la transcripción dependiente de FoxM1, hemos probado cómo siomicina A y tioestreptona afectan a la actividad transcripcional de otros factores de transcripción tales como p53, Tcf /Lef y GLI. Con este fin, la línea celular HCT116-p53RE-Luc (con p53 de tipo salvaje y múltiples elementos de respuesta a p53 aguas arriba del gen de la luciferasa), línea celular de cáncer de colon SW480 (transitoriamente transfectadas con el Tcf /Lef dependiente TOPflash construir [32] ; células de cáncer de una donación del Dr. Randall Luna) y de pulmón A549 (transfectadas transitoriamente con los GLIBS-Luc GLI-dependiente constructo indicador y el plásmido de expresión GLI; regalos del Dr. David Robbins) fueron tratados con siomicina a o tioestreptona y la luciferasa se midió la actividad 16 horas después del tratamiento. Se encontró que el tratamiento con los antibióticos no redujo p53, Tcf /Lef o la transcripción dependiente de GLI- (Fig. 1D-F). Sin embargo, nuestros experimentos adicionales mostraron que los antibióticos de tiazol también afectan a la actividad de NF-kB, pero no la actividad de otros factores de transcripción estudiados (datos no mostrados).
Para evaluar el potencial anticáncer de los antibióticos de tiazol analizamos su efectos sobre líneas celulares de cáncer humano de diferente origen que tenían nivel de expresión elevado de FoxM1. En primer lugar, se investigó si la vía apoptótica extrínseca o intrínseca está implicado en la apoptosis inducida por tiopéptido. Se han tratado caspasa 8 líneas celulares deficientes y reconstituidos NB7 de neuroblastoma con los antibióticos durante 24 horas (Fig. 2A). Encontramos que la caspasa-8 células NB7 deficientes que no pueden someterse a apoptosis extrínseca eran casi tan sensible a las thiopeptides como células NB7 reconstituido con caspasa-8 activa, lo que sugiere que la apoptosis inducida por tiopéptido implica principalmente la vía apoptótica intrínseca.
(A) Tratamiento de la caspasa-8 líneas celulares de neuroblastoma NB7 deficientes y reconstituidos con los antibióticos de tiazol reveló que tiopéptido apoptosis inducida se centra principalmente en la vía apoptótica intrínseca. (B) líneas celulares de cáncer de leucemia CEM [IC
50 /M: Sio-0,73 (0,08); Tio-1.47 (0.1)], HL60 [IC
50 /M: Sio-0,68 (0,06); Tio-1.78 (0.4)], y U937 [IC
50 /M: Sio-0,53 (0,1); (0,3)], y líneas celulares de cáncer de hígado tio-0,73 Hep-3B [IC
50 /M: Sio-3,6 (1,3); Tio-2.3 (0.8)], Huh7 [IC
50 /M: Sio-2,3 (0,5); Tio-1,8 (0,2)], y SK-Hep [IC
50 /M: Sio-3,7 (0,4); Thio-6,0 (1,4)], mostró una sensibilidad en el intervalo bajo micromolar a los antibióticos de tiazol como se determina por ensayos de inhibición de crecimiento. (C-D) siomicina A y tioestreptona inhiben la expresión FoxM1 e inducen potente apoptosis en células de leucemia y cáncer de hígado.
Para evaluar cuantitativamente el grado de sensibilidad de las distintas líneas celulares de cáncer humano a los antibióticos de tiazol siomicina a y tioestreptona hemos realizado ensayos de inhibición del crecimiento en varios leucemia (CEM, HL60, U937) y el hígado las células cancerosas (Hep-3B, Huh7, SK-HEP). Estas líneas celulares de cáncer se trataron con diferentes concentraciones de los antibióticos durante 48 horas y el grado de inhibición del crecimiento se determinó contando el número de células vivas (Fig. 2B). Todas las líneas celulares muestran IC
50 años en el rango micromolar baja, lo que sugiere que estas células cancerosas humanas son bastante sensibles a los thiopeptides. Además, se evaluó la respuesta apoptótica a siomicina A y tioestreptona en estas células de cáncer humanas por inmunotransferencia para la caspasa-3 escindido. Se encontró que tanto siomicina A y tioestreptona reprimen la expresión de proteínas FoxM1, e inducen la apoptosis en estas células de leucemia y cáncer de hígado (Fig. 2C, D). Estos datos apoyan aún más nuestra conclusión de que tiazol antibióticos no sólo antagonizar la capacidad de transactivación de FoxM1, sino que también inhiben su expresión debido a la bucle de retroalimentación positiva FoxM1 [33]. Asimismo, se observó una correlación directa entre la supresión FoxM1 y la caspasa-3 división (sello de apoptosis) después del tratamiento con estos compuestos. La estrecha relación entre FoxM1 la represión y la inducción de la apoptosis sugiere que los thiopeptides pueden ejercer su actividad proapoptótico al menos parcialmente a través de la inhibición de la FoxM1 en células cancerosas humanas.
Para investigar el papel potencial de FoxM1 en el tiopéptido mediada apoptosis, se trataron células de osteosarcoma U2OS con 10 M de siomicina a y recogieron las células a diferentes puntos de tiempo (Fig. 3A). Encontramos considerable disminución de la expresión de la proteína FoxM1 tan pronto como 18 horas, que se correlaciona con la aparición de sólidos de la caspasa-3 bandas escindidas. También se observó correlación entre la regulación a la baja más fuerte de FoxM1 y más intenso apoptosis después del tratamiento 24 hr con tioestreptona en presencia de la ciclohexamida conocido inhibidor de la traducción (Chx) en comparación con el tratamiento individual con los fármacos, indicando de nuevo que la supresión de FoxM1 puede ser necesaria para la apoptosis inducida por tiopéptido (Fig. 3B). Para explorar más a fondo el papel de la apoptosis en el FoxM1 tiopéptido mediada que utilizó la línea celular C3 [25]. expresión FoxM1 se indujo con la adición de doxiciclina y al día siguiente las células se trataron con tioestreptona y ciclohexamida durante 24 horas (Fig. 3C). Se observó que la expresión de FoxM1 endógenos disminuyó de una manera dependiente del tiempo después del tratamiento, mientras que los niveles de FoxM1 exógenos no se vieron afectados (Fig. 3C). También se encontró que la sobreexpresión de FoxM1 protegida contra la muerte celular inducida por tioestreptona como se detectó por inmunotransferencia para exfoliados caspasa-3 (Fig. 3C). Estos datos apoyan la noción de que la regulación a la baja de FoxM1 puede contribuir a la apoptosis inducida por tiopéptido. Del mismo modo, se encontró que las células que sobreexpresan C3 FoxM1 eran resistentes al tratamiento con siomicina A tal como se analizó mediante inmunotransferencia para exfoliados caspasa-3 (Fig. 3D). Experimentos adicionales revelaron que la sobreexpresión de FoxM1 también protege contra la apoptosis inducida por A siomicina en presencia de ciclohexamida (Fig. 3E). Tomados en conjunto, todos estos datos sugieren que la regulación a la baja de FoxM1 por siomicina A y tioestreptona puede ser necesaria para la apoptosis inducida por tiopéptido.
(A) El análisis por inmunotransferencia después del tratamiento con siomicina A reveló estrecha correlación entre la regulación a la baja de FoxM1 y la inducción de la apoptosis. (B) Después del tratamiento con tioestreptona, la apoptosis inducida por tiopéptido y la inhibición de la expresión de la proteína FoxM1 son más prominentes en presencia de ciclohexamida (Chx) como se representa por inmunotransferencia para FoxM1 y se escindió de la caspasa-3. (C) La expresión de FoxM1 endógenos disminuyó de una manera dependiente del tiempo en presencia de tioestreptona y Chx, mientras que los niveles de FoxM1 exógenos no se vieron afectados. La sobreexpresión de FoxM1 protegida contra la muerte celular inducida por tioestreptona como se detectó por inmunotransferencia para la caspasa-3 escindido. células que sobreexpresan (D) FoxM1 eran resistentes al tratamiento con el aumento de cantidad de siomicina A tal como se analizó mediante inmunotransferencia para la caspasa-3 escindido. (E) El análisis por inmunotransferencia reveló que la sobreexpresión de FoxM1 también protegida contra la apoptosis inducida por una siomicina en presencia de CHX.
Discusión
Anteriormente, se informó que los antibióticos de tiazol siomicina A [ ,,,0],25] y tioestreptona [29] inhibir FoxM1 e inducir la apoptosis en células de cáncer humano. En este estudio, hemos demostrado que los antibióticos inhiben tiazol FoxM1 actividad transcripcional, también regulan negativamente la expresión de FoxM1 e inducen la muerte celular en células de neuroblastoma, leucemia y cáncer de hígado. Se sabe que los antibióticos de tiazol llevar a cabo su actividad antibacteriana inhibiendo la traducción bacteriana a través de la interacción con el ARN ribosomal 23S, pero no bloquean la síntesis de proteínas eucariotas [34]. El mecanismo preciso de la inhibición de la actividad transcripcional FoxM1 queda por esclarecer, pero no está relacionado con su capacidad para inhibir la síntesis de proteínas. Curiosamente, también encontramos que tiazol antibióticos suprimen no sólo la actividad transcripcional, pero también la expresión de FoxM1 (Fig. 1, 2), lo que sugiere que FoxM1 puede regular positivamente su propia transcripción [33].
Aquí, encontramos que tiazol apoptosis inducida por antibióticos en células de cáncer de origen diferente se correlacionó con la regulación a la baja de FoxM1 (Fig. 2, 3). Los thiopeptides inhibió el crecimiento celular con similares IC
50 y la muerte celular inducida con concentraciones comparables en tales tipos de células diversos como neuroblastoma, leucemia y hepatoma (Fig. 2). Puesto que ya informó de que siomicina A y objetivo tioestreptona FoxM1, inhiben el crecimiento celular e inducir la apoptosis en células de melanoma [29], estos datos confirman además que tiazol antibióticos pueden afectar a una amplia variedad de células de cáncer humano. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de FoxM1 podría proteger a las células cancerosas de la apoptosis mediada por tiopéptido (Fig. 3C, D, E). Dado que los antibióticos de tiazol suprimir la expresión y la actividad de FoxM1 y al mismo tiempo la sobreexpresión FoxM1 protege a las células de cáncer de siomicina A y la toxicidad tioestreptona, FoxM1 puede ser una diana válida de tiazol apoptosis inducida por antibióticos. Recientemente, Kwok et. Alabama. mostró que reprime la expresión de tioestreptona FoxM1 e induce la apoptosis en células de cáncer de mama [35]. Estos datos apoyan aún más nuestros resultados actuales y los resultados de nuestras publicaciones anteriores que tiazol antibióticos, siomicina A [25], y tioestreptona [29] inducir la apoptosis y suprimir la expresión FoxM1 en células de cáncer humano. Sin embargo, este grupo no vinculó supresión de la expresión FoxM1 a la inhibición de su actividad transcripcional por tioestreptona [35]. Además, afirman que sólo constitutivamente activa, pero no de tipo salvaje FoxM1, puede inhibir la actividad antiproliferativa tioestreptona [35]. Son necesarios más estudios para resolver estas diferencias.
En resumen, hemos demostrado que los antibióticos de tiazol siomicina A y tioestreptona son potentes inhibidores de la actividad transcripcional FoxM1 y expresión. Además, inducen la muerte celular programada en células de cáncer humano de origen diverso. El grado de la apoptosis inducida por los thiopeptides se correlaciona con la supresión de FoxM1, mientras que la sobreexpresión de tipo salvaje FoxM1 parcialmente protegida de las células cancerosas tiopéptido inducida por apoptosis. Estos datos sugieren que la inhibición de FoxM1 por siomicina A y tioestreptona, en cierta medida es responsable de la muerte celular inducida por los antibióticos de tiazol. Los experimentos descritos en este soporte manuscrito nuestros informes anteriores [25], [26], [27], [29] que FoxM1 es un objetivo apropiado para medicamentos contra el cáncer y que tiazol antibióticos podría representar una alternativa prometedora a los usados actualmente los tratamientos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
líneas celulares, medios de comunicación y compuestos químicos
U2OS células de osteosarcoma; C3 células [22], una línea celular U2OS C3 clon con proteína de fusión GFP-FoxM1 inducible por doxiciclina; U2OS deriva osteosarcoma C3-Luc2.3-FoxO1, que expresan establemente la doxiciclina-inducible FoxM1-GFP [25], el FoxO1 (AAA) -ER proteína de fusión tamoxifeno inducible y luciferasa de luciérnaga bajo el control de múltiples elementos de respuesta FoxM1 /FoxO1; HCT116-p53RE-Luc colon, expresan de forma estable la luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor con múltiples elementos de respuesta a p53 (p53RE); líneas celulares de cáncer de hígado de pulmón A549 y Huh7, Hep3B y SK-Hep se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen). Colon SW480, caspasa-8 y la deficiente reconstituido neuroblastoma NB7 (donaciones generosas de Dr. Jill M. Lahti, Hospital de Investigación Infantil St. Jude, Memphis), CEM, HL60 y líneas celulares de cáncer de la leucemia U937 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) . En todos los casos los medios fueron suplementados con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals) y 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO) y las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2. Tiazol antibióticos siomicina A (NCI) y tioestreptona (Sigma) se disolvieron en DMSO (dimetilsulfóxido), tamoxifeno (Sigma) en etanol, doxiciclina (Clontech) en PBS y ciclohexamida (Sigma) en DMSO.
Constructos y transfecciones
el Super8xTOPFlash y el control de Super8xFOPFlash reportero plásmidos fueron donaciones generosas de Dr. Randall T Luna (Universidad de Washington, Seattle, WA). El plásmido de expresión SRαGLI1 y el GLI-BS-Luc, miniTK reportero construcciones fueron regalos de tipo Dr. David J. Robbins (Escuela de Medicina de Dartmouth, Hanover, NH). Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
El análisis por inmunotransferencia
Las células de cáncer de origen diferente al tratamiento indicado se cosecharon y se lisaron usando tampón IP ( HEPES 20 mM, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, Na4P2O7 10, othrovanadate de sodio 1 mM, 0,2 mM PMSF complementa con la tableta de inhibidor de proteasa (Roche Applied Sciences)) . La concentración de proteína se determinó por el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad). Las proteínas aisladas se separaron en 8% o 10% de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La inmunotransferencia se llevó a cabo como se describe en el 34, 35 con anticuerpos específicos para FoxM1 (un regalo del laboratorio del Dr. Costa), FoxA1 (un regalo del laboratorio del Dr. Costa), FoxO1 (Señalización Celular), FoxO3a (Upstate), caspasa Cleaved 3 (señalización celular) y β-actina (Sigma).
ensayos de luciferasa
células C3-Luc2.3-FoxO1 se cultivaron en placas de 6 pocillos y se trataron durante la noche con la combinación de cualquiera de 1 mg de doxiciclina /ml o 300 nM tamoxifeno y 3 M de siomicina A o tioestreptona. Además, la línea celular HCT116-p53RE-Luc se hizo crecer en placas de 6 pocillos y se trató con 3 M de siomicina A o tioestreptona durante 16 hrs. Por otra parte, la línea celular de cáncer de colon SW480 cultiva en placas de 6 pocillos se transfectaron transitoriamente con el TOPflash y la FOPFLASH construye. Veinticuatro horas de transfección siguientes se trataron las células con 3 M de siomicina A o tioestreptona. El día siguiente, la actividad de luciferasa de luciérnaga se midió usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega). La concentración de proteína se mide por el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad) se utilizó para la normalización. células de cáncer de pulmón A549 cultivadas en placas de 6 pocillos se cotransfectaron transitoriamente con ya sea el control de las construcciones de reportero miniTK GLI-dependiente GLIBS-Luc o, el plásmido de expresión GLI y PRL-null (Promega) que expresa luciferasa de Renilla. Las células fueron tratadas con 3 M de siomicina A o tioestreptona 24 horas después de la transfección y la actividad luciferasa se midió con el sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante al día siguiente.
Agradecimientos
Este manuscrito está dedicado a la memoria del Dr. Robert H. Costa. Nos gustaría agradecer al Dr. Randall Luna (Universidad de Washington, Seattle) para el TOPflash y los plásmidos FOPFLASH, el Dr. David Robbins (Escuela de Medicina de Dartmouth, Hanover) para proporcionar los efectores y reportero plásmidos GLI. También nos gustaría agradecer al Dr. Jill M. Lahti (Hospital de Investigación Infantil St. Jude, Memphis) para las líneas celulares de neuroblastoma NB7 deficientes reconstituidas y la caspasa-8. Agradecemos al Dr. Angela Tyner (Universidad de Illinois en Chicago, Chicago) y el Dr. Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) para leer el manuscrito y por sus valiosos comentarios. También agradecemos al Dr. Nissim Hay (Universidad de Illinois en Chicago, Chicago) para proporcionar los anticuerpos FoxO1 y FOXO3A, y por sus sugerencias útiles.