Extracto
péptido asociado a la latencia (LAP) - expresando células T reguladoras (Tregs) son importantes para la auto-inmunológica tolerancia y la homeostasis inmune. Con el fin de investigar el papel de LAP en las células CD4 humana
+ Foxp3
+ células T reguladoras, se diseñó un estudio transversal que incluyó 42 El cáncer colorrectal (CCR). Se analizaron los fenotipos, los patrones de liberación de citoquinas, y la capacidad supresora de las células T reguladoras aislado de sangre y los tejidos tumorales periféricas. Se encontró que la población de LAP-positivas CD4
+ Foxp3
+ Tregs aumentó significativamente en periféricos sangre y los tejidos de cáncer de pacientes con CCR en comparación con la de la sangre y los tejidos de sujetos sanos periférica. Tanto LAP
+ y LAP
- Tregs tenía un fenotipo efector /memoria similar. Sin embargo, LAP
+ células T reguladoras expresó más moléculas efectoras, incluyendo el factor de necrosis tumoral del receptor II, granzima B, perforina, Ki67, y CCR5, que su LAP
- contrapartes negativas. La actividad inmunosupresora in vitro de LAP
+ Tregs, ejercida a través de un mecanismo mediado por el factor de β-crecimiento transformante, era más potente que la de LAP
- Tregs. Además, el enriquecimiento de LAP
Población + Treg en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes con CRC correlaciona con metástasis de cáncer. En conclusión, hemos encontrado que LAP
+ Foxp3
+ CD4
+ células Treg representan un subgrupo activado de células T reguladoras que tienen actividad reguladora más potente en pacientes con CCR. El aumento de la frecuencia de LAP
+ células T reguladoras en PBMCs de pacientes con CRC sugiere su posible papel en el control de la respuesta inmune al cáncer y presenta LAP como marcador de células T reguladoras específicas de tumor en pacientes con CRC
Visto:. Mahalingam J , Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. Las células (2014) CD4
+ T que expresan Latencia-Péptido Asociado y Foxp3 son un subgrupo activado de células T reguladoras enriquecido en pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (9): e108554. doi: 10.1371 /journal.pone.0108554
Editor: Derya Unutmaz, Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril de 2014; Aceptado: August 24, 2014; Publicado: 30 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Mahalingam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC NSC Beca 99 a 3112-B-182-011, 97-2314-B-182A-027) y CMRPG 380362, 380743, 392087, del hospital Chang Gung Memorial. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Todos los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
inmunosupresores funciones de un subconjunto especializado de células T son de vital importancia para la regulación inmune. Las células T reguladoras (Tregs) desempeñan un papel central en el mantenimiento de la tolerancia periférica auto y la homeostasis inmune [1] - [3]. Varias líneas de evidencia sugieren que el factor de transcripción forkhead (Foxp3) que expresan CD4
+ células T reguladoras son heterogéneas en su desarrollo y funciones. De este modo, las células T reguladoras naturales se refieren a CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras de origen tímico, mientras inducidos Tregs (iTregs) son una población de células T periférico convertido de CD4
+ Foxp3
- células T [4] - [6]. Huehn et al. fueron los primeros en demostrar la existencia de distintos subconjuntos de células T reguladoras, Tregs naïve y de memoria efectora Tregs, basado en la expresión de CD103, un receptor de α
integrina E que guía las células T a los sitios de inflamación [7]. La función inmunomoduladora de activado o efector Tregs relacionada con la expresión de una variedad de moléculas tales como receptores de quimioquinas CCR6 y CCR5, los linfocitos T citotóxicos antígeno-4 (CTLA-4), y el factor de necrosis receptor tumoral (TNFR) II a continuación, se investigó en enfermedades crónicas inflamatorias, enfermedad de injerto contra huésped, y los tumores [8] - [15]. Sakaguchi et al. delineado aún más el papel de Foxp3
+ CD4
+ células T reguladoras basado en la expresión de CD45RA y Foxp3 y dividido CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras en tres fenotípicamente y funcionalmente distintos subgrupos, es decir, no supresora, en reposo y activadas las células T reguladoras; este último se cree que actuar como supresores de la respuesta inmune y mediadores de la hemostasia inmune [16]. Habíamos adoptado previamente esta clasificación y encontrado que en los pacientes de cáncer de colon, sólo el activado y no las células T reguladoras no tratados previamente acumulados en el sitio del tumor, suprimido efector proliferación de células T in vitro, y se correlacionó con la progresión del tumor [17]. Hemos sugerido que, dada la actividad reguladora diferencial de Tregs humano, es necesario separar Foxp3
+ Tregs en subgrupos funcionales y para apuntar a una subpoblación específica de Treg con el fin de garantizar la inmunoterapia exitosa.
Varios de estudios han demostrado que la transformación del factor de crecimiento (TGF) -β juega un papel crítico en la inmunosupresión ejercida por Foxp3
+ Tregs [18] - [22]. TGF-β en combinación con IL-2 induce potentemente la diferenciación de células T reguladoras ingenuas en Foxp3 funcional
+ iTregs [19]. Latencia asociada péptido (LAP) es el N-terminal pro-péptido de la TGF-β precursoras que no covalente se une a TGF-β, formando una latente TGF-β complejo y facilitar la liberación de TGF-β1 en la matriz extracelular [23]; Posteriormente, el TGF-β activado promueve la conversión de células T reguladoras ingenuo iTregs y media la inmunosupresión asociada a Treg [24]. LAP se expresa en la membrana celular de muchas células inmunes, incluyendo células T reguladoras, y participa en la regulación inmune. TGF-β dependiente de LAP-expresión de células T reguladoras han demostrado la capacidad de supresión en ratones y seres humanos. Por lo tanto, un subconjunto de Foxp3 inducible LAP-positivo
-CD4
+ células T reguladoras suprime la inflamación alérgica en ratones [25] - [27]. Gandhi et al. informó de que esta nueva población Treg, aislado a partir de sangre periférica humana, suprime la proliferación de otras células T in vitro, que fue en parte mediada por el TGF-β y IL-10 [28]. Nuestro estudio previo ha puesto de manifiesto que la población de CD4
+ LAP
+ células se incrementó en la sangre periférica de cáncer colorrectal (CCR) de los pacientes; Por otra parte, estas células demostraron un fenotipo de supresión TGF-β-dependiente [29]. Es importante destacar que se observó un modesto aumento en las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T en pacientes con CRC, mientras que estas células T reguladoras rara vez se observa en individuos sanos. Chen et al. obtenido resultados similares en un modelo experimental murino encefalitis autoinmune (EAE), donde un subconjunto único de LAP-expresan CD4
+ CD25
+ células T reguladoras exhibió capacidad supresora más potente que la LAP-negativos células T reguladoras [30]. La existencia de CD4
+ CD25
+ LAP
+ células T reguladoras con actividad supresora también se observó en el síndrome autoinmune de ratones casposa [31]. Sin embargo, en los seres humanos, el papel inmunomodulador de LAP-expresan CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras no está bien caracterizada. En este trabajo, hemos demostrado que las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ población Treg se incrementó ligeramente en la sangre periférica de pacientes con CRC y presentó un subconjunto de células T reguladoras activados que potentemente suprimen las células efectoras a través de un TGF mecanismo relacionado--β. Un mayor porcentaje de LAP
+ células T reguladoras correlaciona con la progresión tumoral, lo que sugiere que LAP
+ células T reguladoras desempeñan un papel importante en la tolerancia inmune a la CRC.
Materiales y Métodos
Los pacientes
en total, 42 pacientes con CCR y 21 donantes sanos se inscribieron en este estudio. Los 42 pacientes con CCR fueron diagnosticadas con la enfermedad y se sometió a una colectomía sin quimioterapia y /o radioterapia preoperatoria en el Hospital Memorial Chang Gung, rama Linkou, Taoyuan, Taiwán. Las muestras de sangre se recogieron de los pacientes por punción venosa antes de la cirugía. Se recuperaron los pacientes características clínicas, incluyendo la patología tumoral, el estadio CRC, y los niveles de antígeno carcinoembrionario a partir de los registros médicos.
Las muestras de sangre y tejidos
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron por Ficoll Paque Plus densidad método de centrifugación en gradiente [12]. Los linfocitos también se aislaron de las muestras resecadas de los tejidos, tanto tumorales y no tumorales. los tejidos no tumorales fueron seleccionados de la margen de resección de la muestra y se confirmó que no canceroso mediante examen patológico. Los tejidos tumorales y no tumorales se finamente en rodajas y se trituran, se incubaron con 0,1% de colagenasa D (Sigma-Aldrich, EE.UU.) en HBSS durante 30 min a 37 ° C y se filtraron a través de una malla de nylon. suspensión de células individuales se preparó con Ficoll (Pharmacia, EE.UU.), y los leucocitos se separaron de la interfase, como se describe anteriormente [29].
Ética declaración
el consentimiento firmado se obtuvo de todos los participantes antes de la inscripción. El protocolo de estudio fue diseñado de acuerdo con las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 2008 y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Memorial Chang Gung, Taiwán.
Los anticuerpos y reactivos
obtuvieron recientemente linfocitos humanos se tiñeron con los siguientes anticuerpos fluorescentes contra marcadores de superficie de leucocitos humana: CD4-peridinina clorofila-cianina 5 (PerCP-Cy5.5), CD25-ficoeritrina (PE) o -allophycocyanin (APC), isotiocianato de CD45RA-fluoresceína (FITC ), CCR7-PE, CCR5-FITC, CCR4-PE-Cy7, CD62L-PE, Ki67-PE o -APC a partir de (BD Biosciences, EE.UU.), y LAP (PE y APC) a partir de (amp I +; D Systems, EE.UU.) . tinción intracelular con anticuerpos CTLA-4-APC Foxp3-APC o FITC y se realizó después del tratamiento con la fijación y permeabilización de tampones (eBiosciences, USA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. tinción intracelular para la granzima B, perforina, y TGF-β se realizó después de la estimulación con PMA y ionomicina durante 5 h con parada de Golgi. Las células estimuladas se hicieron reaccionar primero con anticuerpos contra los marcadores de superficie CD4 y LAP, después se fijaron y se permeabilizaron con tampón de Cytofix /Cytoperm (BD Biosciences, EE.UU.), y finalmente se tiñeron con TGF-ß-PE, granzima B-FITC, o perforin- anticuerpos PE. La intensidad de fluorescencia se analizó usando BD FACSCalibur (BD Biosciences, EE.UU.) y el software FlowJo (Árbol Star, EE.UU.).
CD4
+ CD25
+ LAP
+ T células de ensayo de supresión
CD4
+ CD25
+ LAP
+, CD4
+ CD25
+ LAP
-, y CD4
> + CD25 - células T de CRC pacientes se aislaron con más de 90% de pureza por clasificación de células, usando FACS Aria (BD Biosciences, EE.UU.). CD4
+ CD25
+ LAP
+ y CD4
+ CD25
+ LAP
- células T se mezclaron con células T de respuesta (CD4
+ CD25
- ) en una proporción de 1:01 y se activa con anticuerpos anti-CD28 para 96 h anti-CD3 y. Las células se pulsaron con timidina [
3H] durante 16 h después de la estimulación.
El análisis estadístico
Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de Mann-Whitney,
t
-test, emparejado
t-test
, o ANOVA de una vía. Los valores de p de menos de 0,05 (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001) se consideraron estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, EE.UU.).
Resultados
Un grupo de CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras expresa preferentemente LAP en pacientes con CRC
en primer lugar, investigó la expresión de LAP superficie de CD4
+ Foxp3
+ Treg aisladas de pacientes de CRC. La fiabilidad de la tinción de LAP fue confirmada por control de isotipo monoclonal y los anticuerpos monoclonales LAP recombinante (RLAP). (Figura S1) La comparación entre pacientes con CRC y donantes sanos (HD) reveló que la expresión de LAP en las células CD4
+ Foxp3
+ T células aisladas de PBMC fue significativamente mayor en pacientes con cáncer (CRC: 18,8% ± 9,2% vs . HD:. 7,8% ± 3,3%; Fig 1A y B). Además, la figura 1C muestra que el porcentaje de CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T fue significativamente mayor en los tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales de pacientes con CRC (12,4% ± 8,8% frente a 5,5 % ± 3,8%, P = 0,02). Los resultados sugieren que el aumento de la población de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras en el CCR puede desempeñar un papel importante en la regulación de la respuesta inmune anti-tumoral.
(A) El porcentaje de LAP
+ en las células CD4 cerrada
+ Foxp3
+ subpoblaciones de cáncer colorrectal (CRC) de los pacientes y donantes sanos. En comparación con donantes sanos, pacientes con CCR mostraron una mayor frecuencia de LAP
células CD4 +
+ Foxp3
+ T en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos infiltrantes de tumor (TIL). (SEGUNDO). Se aislaron PBMCs de pacientes con CRC y donantes sanos, y el porcentaje de LAP
+ CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras se calculó mediante análisis FACS. La diferencia entre las muestras se analizó por de Student
t-test
(*** P & lt; 0,001). (DO). Los linfocitos se aislaron a partir de tejidos tumorales y no tumorales de pacientes con CRC, y las células el porcentaje de LAP
+ CD4
+ Foxp3
+ T se calculó por análisis de FACS. CRC-TIL, linfocitos infiltrantes de tumor; CRC-NIL, linfocitos infiltrantes de tejidos no tumorales. La diferencia en la proporción de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T entre las poblaciones CRC-NIL y CRC-TIL fue analizada por el estudiante de
t
-test (* P & lt; 0,05 , ** P & lt; 0,01 y *** P & lt;. 0.001) guía empresas
el fenotipo de las células CD4
+ Foxp3
+ células t reguladoras de pacientes con CRC se analizó basa en la expresión de la superficie marcadores de células de memoria CD45RA y CCR7 (Fig. 2A). CD45RA y patrones de expresión de CCR7 indicaron que tanto LAP
+ y LAP
- subconjuntos de Foxp3
+ CD4
+ células T en su mayoría tenían un fenotipo efector /memoria en la sangre periférica, así como en los sitios tumorales de CRC pacientes (Fig. 2B) [17]. De este modo, las células T reguladoras LAP-positivas en CRC no difieren de los de LAP-negativo en la expresión del fenotipo efector /memoria.
PBMC y TIL suspensiones se analizaron para la expresión de marcadores fenotípicos CCR7 y CD45RA para evaluar la etapa de diferenciación de las células CD4
+ Foxp3
LAP
+ células T +. (A) Dot blot representa el ingenuo (N, CD45RA
+ CCR7
+), memoria central (CM, CD45RA
-CCR7
+), la memoria efectora (EM, CD45RA
- CCR7
-), y el efector terminal (TE, CD45RA
+ CCR7
-) CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras. (B) las etapas de diferenciación de células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras en la sangre periférica, tejidos tumorales y no tumorales tejidos de pacientes con CRC se determinaron por citometría de flujo. Cada punto representa la media ± desviación estándar de una muestra individual.
La expresión elevada de marcadores relacionados con Treg activados en las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T
Se examinó la expresión de moléculas de activación /efectoras asociadas-Treg, incluidos los miembros de TNFR súper familia, granzima B, perforina, Ki67, CTLA-4, y TIM-3, en las células CD4
+ Foxp3
+ T Células. En comparación con CD4
+ Foxp3
+ LAP
- células T, CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T mostraron significativamente más alta expresión de TNFRII, granzima B, perforina, Ki67 , y Tim-3 y menor expresión de CTLA-4 (Fig. 3A). Estos datos indican que en el CCR, una mayor proporción de LAP-positivas CD4
+ Foxp3
+ Treg tiene un fenotipo proliferante activado.
(A) PBMCs de pacientes con CRC se analizaron para la expresión de marcadores Treg TNFR II, granzima B, perforina, Ki67, CTLA-4, y Tim-3 por FACS. El histograma representa la expresión de marcadores de Treg CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras y CD4
+ Foxp3
+ LAP
- células T reguladoras; la diferencia entre la expresión de poblaciones de células T se analizó mediante emparejado
t-test
(* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, y *** P & lt; 0,001). (B) histogramas típicos representan el porcentaje de CD62L-, CCR4-, y CCR5-positivas CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras y CD4
+ Foxp3
+ LAP
- células T reguladoras; los niveles de expresión de CD62L, CCR4, CCR5 y se compararon entre los dos poblaciones de células T. Los datos fueron analizados por pares de
t-test
(* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001).
Varias líneas de evidencia de ratón y los estudios en humanos sugieren que la expresión de ciertos receptores de quimioquinas, incluyendo CCR4 y CCR5, es característico de un subgrupo activado de CD4
+ Foxp3
+ Tregs. El análisis de la expresión de CCR4, CCR5, y L-selectina (CD62L) indicó que CD62L se downregulated significativamente en las células CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T en comparación con sus LAP
- contrapartes negativas ( la intensidad media de fluorescencia (MFI), 594 ± 41,9 vs 684 ± 70,9; p = 0,006); la expresión de CCR4 fue similar, mientras que la de CCR5 aumentó en las células CD4
+ Foxp3
+
células Lap + T en comparación con CD4
+ Foxp3
+ LAP
- células T ( CCR4: 40,7% ± 5,9% frente a 37,7% ± 6,2%, P = 0,2; CCR5: 13,2% ± 1,9% frente a 6,2% ± 1,7%, P = 0,001). Estos resultados indican que las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras tienen un fenotipo activado.
CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras exhiben potente TGF -β-dependiente de la capacidad de supresión de
TGF-β es una citocina inmunosupresora sabe que juega un papel crítico en la generación y la actividad funcional de células t reguladoras. Membrana TGF-β se mantiene en una forma latente mediante la unión a LAP no covalente. Para examinar la asociación del fenotipo Treg LAP-positiva con el TGF-β, se analizó la producción de TGF-β en el CCR Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras estimulada con PMA /ionomicina. Como se muestra en la Fig. 4A, los niveles de TGF-beta fueron mayores en el subconjunto Treg LAP-positiva que en el subconjunto Treg LAP-negativo (7,50% ± 1,1% frente a 2,8% ± 1,1%, P = 0,001), lo que sugiere que las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células ejercen su función reguladora a través de la vía de TGF-β.
(a) la expresión de TGF-β en las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+, CD4
+ Foxp3
+ LAP
-, y CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras se analizó mediante FACS. Las células T se estimularon in vitro como se describe en los materiales y métodos, y se comparó la expresión de TGF-β entre estos tres grupos de pares de
t-test
(** P & lt; 0,01). (B) CD4
+ CD25
+ LAP
+ células T y CD4
+ CD25
+ LAP
- células T fueron separados por clasificación de células usando FACSAria y se estimularon con anti anticuerpos CD3 y anti-CD28 para 96 h. proliferación de células T se evaluó por la timidina [
3H] incorporación y expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes; los datos se analizaron mediante emparejado
t-test
(* P & lt; 0,05). (C) El anticuerpo anti-TGF-β (10 mg /ml) se añadió a CD4
+ CD25
+ LAP
+ co-cultivadas con CD4
+ CD25
-LAP
+ células T (relación de 01:01) y activado por anti-CD3 y anti-CD28 mAb. El porcentaje de supresión en la presencia o ausencia de mAb anti-TGF-β se expresa como la media ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 por emparejado
t-test
A continuación, se evaluó la expresión de LAP entre CD4
+ CD25
-, CD4
+. CD25
lo, y CD4
+ CD25
subpoblaciones hi de CD4
+ células T reguladoras y se encontró que en el CCR pacientes, LAP-positivas CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras se observaron predominantemente dentro CD4
+ CD25
hi compartimento. Entonces, CD4
+ CD25
+, CD4
+ CD25
-, CD4
+ CD25
+ LAP
+ y CD4
+ CD25
+ LAP
- poblaciones Treg se separaron por clasificación de células, y su capacidad para inhibir la proliferación de recién aisladas CD4
+ CD25
- células T se evaluó por la [H
3] timidina incorporación de ensayo . Entre estas subpoblaciones Treg CD4
+ CD25
+ LAP
+ células muestran la capacidad supresora más potente (P & lt; 0,03; Fig. 4B), que fue inhibido in vitro por la administración de anti-TGF β anticuerpo (Fig. 4C). Enriquecimiento en la sangre periférica CD4
+ Foxp3
+ LAP células T
+ correlacionados con la progresión del CRC.
La relevancia clínica de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T en el CCR se examinó en 42 pacientes con CRC (sus características demográficas y clínicas se presentan en la Tabla 1). Sólo 9 pacientes tenían cáncer o progresión de la enfermedad recurrente. El porcentaje de CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T en el CD4
+ Foxp3
+ población de células T no se correlacionó con la de CD4
+ Foxp3
+ células T en el CD4
+ población de células T en la sangre periférica. En la población de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), el porcentaje de CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T correlacionados con la de CD4
+ Foxp3
+ células T (r
2 = 0,1, P = 0,04).
+ células T, la proporción de CD4
+ Foxp3
+ LAP inversamente correlacionada con la de CD8
+ células T en la sangre periférica (r
2 = 0,2; p = 0,01); en TIL, una tendencia hacia una correlación inversa entre CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ y CD8 se observó células
+ T; Sin embargo, no fue estadísticamente significativa (r
2 = 0,08, P = 0,18). Además, hemos encontrado ninguna correlación entre circulantes CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T y otras células inflamatorias tales como neutrófilos, linfocitos, monocitos y (Fig. 5A). El estudio incluyó a 26 pacientes con cáncer de colon y 16 pacientes con cáncer de recto; Sin embargo, el porcentaje de circulante o tumor infiltrante de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T en las células CD4
+ Foxp3
+ población de células T no fue diferente entre los dos grupos de CRC pacientes (figura 5B).
(A) Correlación entre LAP
+ Foxp3
+ CD4
+ células T y CD4
+ Foxp3
+ células T, CD8
+ células T, linfocitos totales, monocitos y neutrófilos (r
2 y los valores P) se evaluó por el método de correlación de Pearson. (B) El porcentaje de LAP
+ células T reguladoras en las poblaciones PBMC y TIL se comparó entre los pacientes con CCR con tumores de colon y recto; los datos se analizaron mediante emparejado
t-test
(* P & lt; 0,05). pacientes (C) de CRC se agruparon en base a la presencia o ausencia de ganglios linfáticos o metástasis a distancia. El porcentaje de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras en las poblaciones PBMC y TIL se comparó entre los grupos de pacientes con diferentes estadios de CRC y los donantes sanos. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía (** p & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001).
Finalmente, se investigó la asociación de CD4
+ Foxp3
+ LAP células
+ T con el estadio del tumor. Como se muestra en la Fig. 5C, el porcentaje de CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T en la sangre periférica de pacientes con metástasis fue significativamente mayor que en los pacientes de CRC sin metástasis y en donantes sanos. Además, el tamaño de CD4
+ Foxp3
+ LAP
Población + Treg se incrementó en los tejidos tumorales en comparación con tejidos no tumorales (Fig 5C). Por lo tanto, el aumento de LAP
+ Tregs en la sangre periférica de pacientes con CRC podría reflejar el aumento de LAP
+ Tregs en los tejidos tumorales y podría ser correlacionada con la etapa del cáncer, lo que sugiere que el tamaño de CUBRAN EL REGAZO sangre periférica positivas CD4
+ Foxp3
+ subpoblación de células T puede servir como un marcador sustituto para el proceso de la inmunosupresión en el CCR.
Discusión
los resultados de nuestro estudio indican que las marcas de expresión, haga clic aquí una subpoblación de células CD4
+ Foxp3
+ Treg con la capacidad supresora potente. Aunque la mayoría de las células CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras en pacientes con CRC se clasifican como activo, entre ellos, las células T reguladoras LAP-positivas tienen aún más potentes funciones supresoras. Esto se manifiesta por una mayor expresión de marcadores de células activadas, aumento de la producción de TGF-β inmunosupresor, y la capacidad de supresión más potente in vitro en células T reguladoras LAP-positivo en comparación con Tregs LAP-negativas. Nuestros hallazgos sugieren que la LAP puede ser un marcador potencial para identificar a un subgrupo de células T reguladoras que exhiben funciones supresoras relacionadas con el TGF-β. Esta subpoblación Treg se enriqueció en la sangre periférica de pacientes con CRC, que se correlacionaban con la progresión del tumor, lo que sugiere que las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ Tregs puede tener aplicación clínica como marcadores de células T reguladoras específicas de tumor en CRC pacientes.
El papel funcional de las células t reguladoras en LAP no está claro. LAP permanece asociado no covalentemente con TGF-β después de la escisión del péptido precursor y formar el complejo de TGF-β latente inactivo; por lo tanto, contribuye a la prevención de la activación incontrolada de los receptores de TGF-beta. Nakaruma et al. fueron los primeros en demostrar que tanto murinos y humanos CD4
+ CD25
+ Treg podría ejercer la supresión de TGF-β-dependiente de las células efectoras, que fue revocada por el LAP recombinante. También demostraron que LAP-positivo CD4
+ células T podrían suprimir colitis in vivo, lo que sugiere, por primera vez, que LAP podría ser considerada como un marcador de regulación [24]. Qida et al. Además, demostró que la expresión de LAP en murino CD4
+ células T fue inducida por el TGF-β independientemente de Foxp3 [25]. Shevach et al. observado la expresión de los complejos de TGF-β-LAP en la Tregs activado pero no en el Tregs descansando inducida mediante estimulación no antígeno [21], [31], [32]. LAP
+ Tregs suprime la proliferación de células T activadas, pero no de las células T vírgenes de una manera TGF-β-dependiente y la tolerancia infección mediada por la conversión de Foxp3-negativo Tregs a Tregs Foxp3-positivo funcionalmente activas [32]. Se cree que el complejo de LAP-TGF-β representa un mecanismo importante para Tregs para mantener la homeostasis inmune a través de la señalización de TGF-β.
Chen et al. han caracterizado además funcionalmente CD4
+ CD25
+ LAP
+ células T reguladoras en una murino encefalitis autoinmune (EAE) modelo [30]. CD4
+ CD25
+ LAP
+ Treg población tuvo una mayor frecuencia de expresión de Foxp3 y produce aumento de los niveles de moléculas efectoras y citoquinas que sus contrapartes LAP-negativo. Tregs LAP-expresión fueron anérgicos y de supresión in vitro; sin embargo, su actividad supresora era más potente en comparación con la de otros tipos de Treg. Estas células expresan tanto TGF-β y sus receptores; la capacidad de supresión de LAP
+ células T reguladoras se invirtió mediante la neutralización de TGF-β, lo que indica que las células CD4
+ CD25
+ LAP
+ células T reguladoras eran, al menos en parte, regulado en un TGF-β- de manera dependiente. Además, in vivo la transferencia adoptiva de células CD4
+ CD25
+ LAP
+ células T reguladoras mejorado EAE, lo que confirma la potencia inmunosupresora de esta población Treg. Basándose en estos hallazgos, LAP podría ser considerado como un marcador para la identificación de un subgrupo de CD4
+ CD25
+ Tregs con la capacidad de supresión potente [30]. En los seres humanos, Shevach et al. mostraron que la presencia de la superficie de TGF-β complejado con LAP inducida Foxp3 y resultó en la supresión de células de respuesta, lo que indica la posibilidad de que tanto Foxp3 y LAP podrían conferir actividad supresora más potente sobre la población de células Treg humana [31].
a pesar de que el papel de las células t reguladoras LAP-positivo no ha sido completamente aclarada, los datos disponibles sugieren que la LAP puede ser un biomarcador útil para identificar activado células t reguladoras en ratones y seres humanos. En ratones, LAP se puede aplicar para la selección in vitro de expandido CD4
+ Foxp3
+ Tregs supresores [33], mientras que en los seres humanos, se ha sugerido como un marcador para el seguimiento de células T reguladoras después de anti-CTLA-4 inmunoterapia [34]. Nuestro estudio refuerza aún más la idea de que LAP expresión puede distinguir activado células T reguladoras, especialmente los que circulan en la sangre periférica de pacientes con CRC. Lo más importante, la progresión del tumor correlacionado con el aumento de la proporción de LAP
+ Tregs. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que circula LAP-positivo CD4
+ Foxp3
+ Tregs, en lugar de la población general de CD4
+ Foxp3
+ células T, se pueden utilizar como una más precisa y marcador específico para el seguimiento del estado inmunológico de pacientes con cáncer.
En conclusión, CD4
+ células t reguladoras que expresan tanto Foxp3 y exhibición LAP mayor actividad inmunosupresora que otros subconjuntos de células Treg. El LAP supresor
+ CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras a regular la respuesta inmune, al menos en parte, a través de la señalización de TGF-β. El enriquecimiento de las células CD4
+ Foxp3
+ LAP
+ células T reguladoras en la sangre periférica de pacientes con CCR puede ser utilizado potencialmente para la inmunoterapia del cáncer de supervisión en el ámbito clínico.
Apoyo a la Información
figura S1.
Expresión de LAP. (UN). El anticuerpo monoclonal de control de isotipo (IC) y LAP recombinante (RLAP) se confirmó la fiabilidad de la tinción. (SEGUNDO). Identificación de CD4
+ Foxp3 + células T
. Se utilizó el anticuerpo monoclonal de control de isotipo (IC) para confirmar la LAP
+ T células tinción
doi:. 10.1371 /journal.pone.0108554.s001 gratis (TIF)