Extracto
pulmón expresan el bucle autocrino colinérgica, lo que facilita la progresión del cáncer Células. Los antagonistas de mAChRs se han demostrado para deprimir el crecimiento de los cánceres de pulmón de células (SCLCs). En este estudio nos propusimos investigar el efecto inhibidor del crecimiento de R2HBJJ, un nuevo antagonista muscarínico, en las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y los posibles mecanismos. El ensayo de unión competitiva reveló que R2HBJJ tenía una alta afinidad a M3 y M1 AChR. R2HBJJ presentó una fuerte actividad anticolinérgica en la contracción inducida por carbacol de la tráquea de cobaya. R2HBJJ marcadamente suprimida el crecimiento de células de NSCLC, como H1299, H460 y H157. En células H1299, tanto R2HBJJ y su compuesto líder R2-PHC muestran actividad anti-proliferativa significativa como darifenacina antagonista de los receptores M3. reponer exógena de ACh podría atenuar la inhibición del crecimiento inducida por R2HBJJ. El silenciamiento del receptor M3 o charlar por siRNAs específicos-dieron como resultado una inhibición del crecimiento de 55,5% y 37,9% en las células H1299 96 h después de la transfección, respectivamente. Estudios posteriores revelaron que el tratamiento con R2HBJJ detenido el ciclo celular en la fase G0 /G1 de baja regulación de la ciclina D1-CDK4 /6-Rb. Por lo tanto, el presente estudio revela que las células de NSCLC expresan un sistema colinérgico autocrina y paracrina que estimula el crecimiento de células de NSCLC. R2HBJJ, como un nuevo antagonista mAChRs, puede bloquear el bucle local de colinérgica antagonizando los receptores M3 predominantemente e inhibir el crecimiento de células NSCLC, lo que sugiere que el antagonista del receptor M3 podría ser un régimen quimioterapéutico potencial para el NSCLC
Visto:. Hua N , Wei X, Liu X, Ma X, Él X, Zhuo R, et al. (2012) A Novel muscarínicos Antagonista R2HBJJ Inhibe las células no pequeñas de cáncer de pulmón de crecimiento celular y detiene el ciclo celular en la fase G0 /G1. PLoS ONE 7 (12): e53170. doi: 10.1371 /journal.pone.0053170
Editor: Michihiko Kuwano, Universidad de Kyushu, Japón
Recibido: 14 Agosto, 2012; Aceptado: November 26, 2012; Publicado: December 28, 2012
Derechos de Autor © 2012 Hua et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de cáncer relacionados mortalidad en el mundo y el número de casos y muertes relacionadas con el cáncer de pulmón está aumentando en muchas partes del mundo. No pequeñas carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 80% de todos los casos de cáncer de pulmón. A pesar de los esfuerzos agresivos, los tratamientos no son satisfactorios y las tasas de supervivencia siguen siendo pésimo (& lt; 20%) [1]. Por lo tanto, se necesita una mayor comprensión de la biología de NSCLC y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento del cáncer de pulmón.
La acetilcolina (ACh) es un importante neurotransmisor en el sistema nervioso central y periférico y desempeña un papel clave en el aprendizaje, la memoria, el control autónomo, y la contracción muscular a través de la activación de los receptores de acetilcolina (AChR), incluyendo la muscarínico (mAChRs) y los receptores nicotínicos (nAChR). Recientemente, se ha encontrado que ACh es también ampliamente sintetiza por una variedad de tipos de células no neuronales, incluyendo las células epiteliales de las vías respiratorias [2], pleura pulmonar [3], intestino delgado y grueso, vesícula biliar, los queratinocitos [4], glia [5], el endotelio vascular [6] y las células de cáncer más comunes, tales como NSCLC, carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer de colon, glial y carcinomas de ovario [7]. La expresión generalizada de la acetilcolina no neuronal es acompañada por la presencia ubicua de la colina acetiltransferasa (ChAT), la colinesterasa y los receptores (nAChR, mAChRs). Aunque la función primaria elucidado de forma incompleta, la acetilcolina no neuronal parece estar implicada en la regulación de las funciones celulares importantes, tales como mitosis, función trófica, automaticidad, la locomoción, la actividad ciliar, el contacto célula-célula, citoesqueleto, así como de barrera y inmune funciones [7] - [9]. Por lo tanto, el sistema y la acetilcolina colinérgica, que actúa como una hormona autocrina y paracrina locales no neuronales, deben ser discriminados del sistema colinérgico neuronal y la acetilcolina neuronal.
Del mismo modo, no neuronal ACh estimula el crecimiento celular a través de ya sea muscarínico colinérgica o vías colinérgicos nicotínicos. Se ha informado de que el crecimiento de células tumorales se vio acelerado por la activación de mAChRs en el colon [10], de pulmón [11] - [12], glial [13], y de próstata [14]. En los carcinomas de ovario, la expresión de mAChR se correlaciona con un mal pronóstico [15]. Canción
et al
informó de que la interrupción de la señalización colinérgico muscarínico M3 autocrino con antagonista del receptor de yoduro de 1,1-dimetil-4-diphenylacetoxypiperidinium (4-DAMP) o darifenacina tiene potencial para inhibir el crecimiento de células SCLC tanto
en Opiniones y vitro
in vivo
[16]. Además, muchos investigadores han demostrado que la activación de nAChR por la nicotina o su derivado carcinógeno 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK) estimulado el crecimiento de células tumorales en cáncer de mama [17], pulmón [18 ], mesotelioma pleural [19], de colon [20], la vejiga [21] y el cáncer de cuello de útero [22]. Estos estudios han demostrado que el A7 es la principal subunidad de nAChR que media los efectos proliferativos de la nicotina en las células cancerosas.
clorhidrato Penehyclidine (APS) es un fármaco anticolinérgico derivado de hiosciamina y desarrollado de forma independiente por nuestro instituto. Como su potencial actividad anticolinérgica, se ha comercializado para el tratamiento de la intoxicación aguda por plaguicidas organofosforados y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [23] - [24]. APS es un compuesto racémico con dos centros quirales, que componen cuatro isómeros ópticos (Fig. 1). Nuestro trabajo anterior reveló que el isómero con R, R'-configuración (R2-APS) muestra la mayor actividad anticolinérgica. Para reducir los efectos secundarios presionando el acceso al sistema nervioso central, un nuevo agente anticolinérgico (R2HBJJ) está diseñado mediante la introducción de un grupo de sal de amonio cuaternario a una molécula R2-PHC para el tratamiento de enfermedades periféricas, tales como los cánceres de pulmón y EPOC. En el presente estudio, la selectividad de R2HBJJ por los receptores M1-M5 se evalúa en detalle y la actividad antitumoral de R2HBJJ en líneas celulares de cáncer
in vitro
y sus mecanismos potenciales se exploran. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para investigar el efecto del antagonista de M3 en las células de NSCLC.
Resultados
R2HBJJ muestra mayor afinidad selectiva de H
3 y M
1 del receptor de
Saturación de unión análisis arrojó constante de unión (K
D) los valores de afinidad [
3H] NMS en humanos M1, M2, M3, M4 y M5 de 0,29 ± 0,04, 0,81 ± 0,17, 0,53 ± 0,09, 0,19 ± 0,03 y 0,48 ± 0,13 nM, respectivamente. La selectividad relativa para los subtipos M1-M5 AChR de R2HBJJ se determinó primero a nivel de afinidad de unión al receptor en las proteínas mAChRs humanos (Fig. 2). Los valores de IC
50 y K
i de R2HBJJ inhibición de [
3H] NMS unión a los subtipos de receptores M1-M5 fueron resumidos en la Tabla 1. R2HBJJ exhibió un pariente mayor afinidad por los receptores M3 y M1 M2 de receptor. El grado de afinidad de R2HBJJ durante cinco mAChRs diferentes fue M3 & gt; M1 & gt; M4 & gt; M5 & gt;. M2
mAChRs proteínas se incubaron con [
3H] -NMS a 37 ° C durante 2 h en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de R2HBJJ. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
R2HBJJ inhibió inducida por carbacol traqueal contracción
Para determinar el efecto de bloqueo de R2HBJJ en mAChR, una se aplicó el modelo ex vivo de cobaya contracción traqueal. La contracción de la tira traqueal aislado de cobaya fue inducida por 1 M de carbacol, un agonista muscarínico no selectivo. Y luego, concentraciones crecientes de R2HBJJ (10
-10-10
-6.5 M) o la atropina como un antagonista de control, se añadieron acumulativamente al baño de órganos. Se obtuvo el respuesta de la concentración inhibidora frente a la contracción inducida por carbacol. Los resultados mostraron que R2HBJJ inhibida dependiente de la concentración de las respuestas contráctiles de tráqueas de cobayas al carbacol (Fig. 3). La concentración de inhibición del 50% (IC
50) fue 7,58 ± 1,05 nM, que fue estadística significativamente menor que la de la atropina (10,21 ± 1,04 nM,
P
& lt; 0,05). Los datos revelaron que R2HBJJ exhibió una fuerte actividad antagonista sobre mAChRs expresadas en tráquea de cobaya.
El carbacol (1 mM) se utilizó para inducir la respuesta contráctil. Después de eso, se añadieron las concentraciones indicadas de atropina R2HBJJ o acumulativamente en el baño de órganos y se obtuvieron las respuestas de concentración inhibitoria contra la contracción inducida por carbacol. Los valores se expresaron como porcentajes de la respuesta contráctil máxima en ausencia de cualquier antagonista. Cada punto representa la media ± DE de cinco experimentos independientes.
líneas celulares de cáncer expresan receptores colinérgicos y colina acetiltransferasa
Si un bucle autocrino colinérgica es funcional en el CPNM, a continuación, las células deben expresar colina acetiltransferasa (ChAT), mAChRs y /o R-nic para ACh para proporcionar estimulación colinérgica autocrino de crecimiento de las células NSCLC. Para determinar si las líneas celulares de cáncer expresan AChR y chat, los ARNm de los cinco subtipos de mAChRs (M1-M5), tres subtipos de nAChR (α7, α9 y α10) y chat fueron examinados por RT-PCR en líneas celulares de cáncer humano H1299, H157, H460, A549 y humana inmortalizada de células epiteliales BEP2D bronquios. Como se muestra en la Fig. 4, los M1, M2, M5, α7, α9 subtipos de receptores, α10 y chat se expresa en casi todas las células de NSCLC probadas. subtipo de receptor M3 se expresó en H1299, H460 H157and, y estuvo ausente en el A549. subtipo de receptor M4 se expresó en H1299 y H157, pero no en H460 y A549. En contraste, las células epiteliales bronquios inmortalizada humana BEP2D expresó ARNm de los diferentes subtipos de los CAIS en los niveles más bajos, a excepción de α10 subtipo y chat. Los resultados implican un bucle autocrino de acetilcolina existentes en las células de NSCLC.
RT-PCR se realizó en ARN total preparado a partir de las líneas celulares indicadas. Los cebadores se describen en la Tabla 3. GAPDH se utilizó como control de carga.
R2HBJJ inhibe la proliferación de células NSCLC in vitro
Para evaluar el efecto de R2HBJJ sobre el crecimiento celular de NSCLC, las células se trataron con concentraciones crecientes de R2HBJJ (1,6 a 100 mM) durante 72 h y la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de sulforrodamina B (SRB). Los resultados mostraron que el tratamiento con R2HBJJ marcadamente suprimió el crecimiento celular de una manera dependiente de la concentración en H1299, H460 y H157 células, con una concentración inhibidora del crecimiento del 50% (GI
50) de 8,5, 8,8 y 28,5 mM, respectivamente. En comparación, A549 y células BEP2D eran resistentes a R2HBJJ, con un GI
50 de más de 100 mu M, la concentración más alta probada (Fig. 5A). Los datos sugirieron que el efecto anti-proliferativo de R2HBJJ era dependiente de las características de las líneas celulares y no la citotoxicidad no selectivo.
Efectos de R2HBJJ en las líneas celulares de NSCLC humanos y células epiteliales de bronquios inmortalizada humana BEP2D (A ) y los efectos de los antagonistas de mAChR y de nAChR en las líneas celulares H1299 (B y C, respectivamente). Las células se trataron con las concentraciones indicadas de R2HBJJ o antagonistas de los receptores colinérgicos para 72 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de SRB. Las células tratadas con disolvente (DMSO) se utilizaron como control, con el conjunto de la viabilidad al 100%. Cada punto de datos representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
Por otra parte, los efectos de otros mAChRs (Fig. 5B) y nAChR (Fig. 5C) se observaron antagonistas sobre H1299. Como se muestra en la Fig. 5B y 5C, los antagonistas selectivos conocidos M3 mAChR darifenacina proliferación de las células H1299, inhibió de una manera dependiente de la concentración, mientras que el no selectivo mAChR antagonista de atropina, no selectivo nAChR mecamilamina antagonista, selectiva M1 mAChR pirenzepina antagonista, α4β2 selectiva /antagonista α4β4 DhβE y antagonistas selectivos α7 α-BGT no tuvieron efectos obvios sobre la proliferación celular. El M2 /M4 antagonista selectivo AF-DX116 también tenía inhibición sobre la proliferación celular en la concentración más alta probada. En comparación, R2HBJJ y su compuesto parental R2-PHC inhibieron significativamente la proliferación celular H1299 de una manera dependiente de la concentración, lo que potencia inhibidora era aproximadamente 3,7 veces mayor que la de darifenacina, el mejor entre los antagonistas probados anteriormente. Debido a que no se aplicó ningún agonista de AChR exógeno, los datos revelaron que endógeno ACh funcionó como un factor de crecimiento autocrino de señalización en las células de NSCLC humanos, en parte a través de la activación del receptor M3.
inhibición del crecimiento inducida por R2HBJJ exógena AChR agonista atenuada
Para determinar la correlación entre la señal de las vías colinérgicas y la inhibición del crecimiento inducida por R2HBJJ, se utilizó exógeno agonista de AChR ACh. Se observaron los efectos de ACh en el crecimiento de H1299 y en la inhibición del crecimiento inducida por R2HBJJ. Se encontró que ACh exógeno solo en 1, 10, y 100 mM durante 72 h no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento celular H1299 (Tabla 2). R2HBJJ solo en 10 mM y 20 mM disminuyó la viabilidad celular de 100 ± 1,61% a 54,13 ± 3,89% y 23,23 ± 2,14% (n = 3), respectivamente. Cuando ACh se administró antes del tratamiento R2HBJJ, la inhibición del crecimiento inducida por R2HBJJ (ambos 10 y 20 mM) se atttenuated en presencia de ACh exógena de una manera dependiente de la concentración. Dos del análisis de la varianza (ANOVA) mostró un efecto del tratamiento siginificant R2HBJJ, el tratamiento de ACh, y el tratamiento R2HBJJ × interacción del tratamiento ACh (
P Hotel & lt; 0,0001, respectivamente). pruebas post-hoc confirmaron que las siguientes concentraciones de pretratamiento de ACh, 10 mM y 100 mM, atenúan significativamente la inhibición del crecimiento inducida por 10 mM o 20 mM de R2HBJJ. Cuando se compara con el tratamiento R2HBJJ solo en el nivel de 10 mM, 10 mM y 100 mM de ACh pretratamiento aumentó la viabilidad de las células a partir de 54,13 ± 3,89% a 82,29 ± 5,82% (
P
& lt; 0,01) y 91,1 ± 3,65% (
P Hotel & lt; 0,01), respectivamente. Cuando se compara con el tratamiento R2HBJJ solo en el nivel de 20 mM, 10 mM y 100 mM de ACh pretratamiento aumentó la viabilidad de las células a partir de 23,23 ± 2,14% a 35,57 ± 4,48% (
P
& lt; 0,05) y 58,55 ± 2,83% (
P Hotel & lt; 0,01)., respectivamente (Tabla 2) guía empresas
M3- y chat siRNAs específicos disminuyeron proliferación de células cancerosas
Para demostrar además que ACh endógena y la señal del receptor M3 estaban involucrados en la proliferación celular de células de NSCLC humanos, las células fueron transfectadas con H1299 o M3-chat-siRNAs específicos y se observó su proliferación en el tiempo. En primer lugar, se utilizó el análisis de transferencia Western para identificar los niveles de estos genes. Como se muestra en la Fig. 6A y 6B, M3 y chat niveles de proteína se redujeron fuertemente las 72 h después de la transfección con la orientación siRNAs en comparación con el control negativo siRNA. Mediante el uso de un ensayo con SRB en placas de 96 pocillos, la potencia de inhibición del crecimiento causada por el silenciamiento M3 o Chat fue probado en 48, 72 y 96 h después de la transfección. El resultado reveló que hubo una reducción dependiente del tiempo de la viabilidad celular mediante el crecimiento M3-o chat-siRNA en células H1299 en comparación con el control negativo siRNA (Fig. 6C). El efecto antiproliferativo de silenciar M3 se visualizó evidentemente temprano a las 48 h después de la transfección (
P Hotel & lt; 0,01) y se logró la inhibición del 55,5% en un plazo de 96 h (
P
& lt; 0,001). Para la charla-siRNA, su efecto antiproliferativo se presentó a las 72 h después de la transfección (
P Hotel & lt; 0,001), lo que fue más lento que siRNA M3; y la inhibición del 37,9% se logró 96 h después de la transfección en comparación con el control negativo siRNA (Fig. 6C,
P Hotel & lt; 0,001).
El descenso de regulación de M3 y chat proteína era detectado por Western blot 72 h después de la transfección de 200 siRNAs nm (a y B). Las células se incubaron en presencia de 200 nM de ARNsi durante 48, 72 y 96 h, después de eso, se determinó la viabilidad de crecimiento celular usando el ensayo de SRB y se comparó con el control simulado.
**
P Hotel & lt; 0,01,
***
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células transfectadas siRNA control negativo en el mismo punto de tiempo (C). Después de M3 o transfección siRNA negativo, las células fueron tratadas con o sin R2HBJJ (8 mM y 16 mM) durante 72 h y el efecto de combinación de M3 siRNA desmontables y tratamiento R2HBJJ sobre el crecimiento celular se investigó utilizando el ensayo SRB.
#
P Hotel & lt; 0,05,
##
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con las células transfectadas con siRNA negativos tratados con disolvente. (RE). Cada punto de datos representa la media ± SD de tres experimentos independientes.
A fin de evaluar si el efecto antiproliferativo de R2HBJJ era receptor M3 específica, las células fueron tratadas con H1299 R2HBJJ después de siRNA transfección M3. El resultado mostró que en las células negativas tratada siRNA, R2HBJJ exhibió la inhibición del crecimiento celular significativa, la viabilidad celular se 83.5% (
P
& lt; 0,05) y 57,4% (
P
& lt; 0,01) después de R2HBJJ 8 M y 16 M de tratamiento. Sin embargo, después de que las células se trataron con M3 siRNA, la viabilidad celular se inhibió a 54,4%; R2HBJJ (8 M y 16 M) no influyó aún más el crecimiento de las células, lo que sugiere que el silenciamiento del receptor M3 privado de la sensibilidad celular a R2HBJJ y acentúa el papel de M3 en el efecto de R2HBJJ (Fig. 6D).
R2HBJJ detenido el ciclo celular en la fase G0 /G1
de fase
Para explorar los mecanismos potenciales de inducir-R2HBJJ la muerte celular en células de NSCLC, se observaron los efectos de R2HBJJ sobre la progresión del ciclo celular mediante el análisis de citometría de flujo. Los resultados de las células H1299 mostraron que el porcentaje de la fase G0 /G1 aumentó de 40,35% a 76,60%, y el de la fase S se redujo de 46,14% a 15,93%, después del tratamiento con 20 mM R2HBJJ durante 72 h (Fig. 7A). Además, las células H1299 tratadas con una gama de R2HBJJ (2,5 a 20 mM) durante 48 h también mostraron detención significativa en la fase G0 /G1, con un porcentaje de aumento de 39,60% a 70,01% (Fig. 7B). Además, resultado similar se obtuvo en la línea celular H157, con un porcentaje de aumento en la fase G0 /G1 de 55,04% a 65,46% en la concentración (Fig. 7C). Los resultados indicaron que R2HBJJ marcadamente suprimida la progresión mitótica celular de maneras dependiente del tiempo y dependiente de la concentración a través de la detención de las células en la fase G0 /G1 y la disminución de la síntesis de ADN.
Las células se sincronizan con 1% de FBS durante 24 h . Después de eso, las células se liberan en medio completo (10% FBS) que contiene 20 mM R2HBJJ para 24, 48, 72 h (A, células H1299) o varias concentraciones de R2HBJJ (2,5 a 20 mM) durante 48 h (B, H1299 células; C, las células H157). Las células tratadas con disolvente (DMSO) se utilizaron como control. la distribución del ciclo celular se determinó mediante el uso de ensayo de citometría de flujo. Los histogramas que se muestran aquí son representativos de tres experimentos.
R2HBJJ baja regulado los niveles de las proteínas reguladoras del ciclo celular y la fosforilación de Rb
transición del ciclo celular de G1 a S se activa principalmente por dos diferentes compuestos de la quinasa: ciclina D1 /CDK4, 6, y ciclina e, A /CDK2. Rb es el sustrato primario de la ciclina quinasa D-dependiente y juega un papel clave en la red de regulación del ciclo celular. Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de detención G0 /G1 inducida por R2HBJJ, se evaluaron los cambios dependientes del tiempo de varias moléculas reguladoras del ciclo celular relacionada después del tratamiento con 20 mM R2HBJJ en células H1299 mediante el uso de análisis de Western blot. Como se muestra en la Fig. 8A, el tratamiento con R2HBJJ inducida dramática baja regulación de la ciclina D1 proteínas, CDK4 y CDK6 forma dependiente del tiempo, mientras que los niveles de ciclina E y CDK2 se mantuvo prácticamente sin cambios durante el mismo período. Por otra parte, la fosforilación de Rb (sobre todo en la Ser
807/811) se redujo en función del tiempo. La disminución de Rb fosforilada en la posición de la Ser
807/811 ocurrido ya en 3 h después del tratamiento y antes de aparente cambio de la viabilidad celular. En contraste, la expresión de Rb basal mostró un aumento persistente significativa y luego disminuyó rápidamente a un nivel indetectable a las 48 h después del tratamiento cuando se ha inducido la supresión del crecimiento celular (datos no presentados), lo que puede sugerir un potencial de adaptación celular a la disminución de Rb fosforilada después del tratamiento R2HBJJ. Además se evaluó la respuesta de la concentración de la fosforilación de Rb reducido después del tratamiento con R2HBJJ durante 48 h (Fig. 8B). El resultado mostró que la disminución de Rb fosforilada en Ser
807/811 por R2HBJJ era dependiente de la concentración y se produjo a la concentración más baja ensayada (1,25 M). Consistentemente, se observó la baja regulación de la ciclina D1, CDK4 y CDK6 proteínas en las células tratadas con concentraciones crecientes de R2HBJJ. Del mismo modo, la expresión de Rb basal mostró un aumento significativo en la concentración al principio y luego disminuyó rápidamente a nivel basal. En conjunto, estos resultados sugieren que la proteína Rb y el compuesto quinasa de la ciclina D1 /CDK4, 6 eran en su mayoría involucrados en la detención G0 celular /G1 inducida por R2HBJJ.
H1299 células fueron tratadas con 20 mM R2HBJJ para la indicada veces (3-60 h, A) o con diversas concentraciones de R2HBJJ (1,25 a 20 mM) durante 48 h (B). Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga.
Discusión
Muchos estudios han demostrado que la ACh y otros componentes de la señalización colinérgico, incluyendo ChAT, colinesterasa, M y N receptores colinérgicos, están presentes en una variedad de tejidos no neuronales, incluyendo las células de cáncer más comunes, tales como NSCLC, SCLC, colon, glial, de mama y carcinomas de ovario. En el medio ambiente local de los tumores, las concentraciones de ACh en los receptores de superficie pueden ser incluso mayor debido a altas densidades de células en masas sólidas, aumento de la secreción de ACh proximidad a la ubicación del receptor y la disminución de los niveles de la colinesterasa en el CPNM [26], lo que implica que la señalización de colinérgica puede aumentar aún más. El sistema colinérgico no neuronal y ACh, como la señalización de crecimiento celular local, juega un papel en el desarrollo y progresión del cáncer y representa una potencial nueva vía para dirigir el crecimiento del tumor. Por lo tanto, los antagonistas colinérgicos interrumpen la señalización autocrina en marcha regulada puede proporcionar un enfoque ascendente dirigido a bloquear la vía proliferativa.
R2HBJJ, como un derivado del agente anticolinérgico R2 en la APS, se sintetizó mediante nuestro instituto. En el presente estudio, se evaluó la selectividad de R2HBJJ por los receptores muscarínicos M1-M5 y su actividad anticolinérgica. También hemos determinado si la interrupción del colinérgico endógeno de señalización con R2HBJJ tiene potencial para inhibir el crecimiento de NSCLC
in vitro
.
Nuestros resultados demostraron que R2HBJJ tuvo significativamente mayor afinidad por M3 y M1 subtipos de receptores que subtipo M2 , lo que sugiere un menor número de efectos secundarios cardiovasculares asociadas al receptor M2. El grado de afinidad de R2HBJJ durante cinco mAChRs diferentes M3 era & gt; & gt M1; M4 & gt; & gt M5; M2. El resultado es consistente con la obtenida en su PHC compuesto parental antes [27]. En el estudio funcional, R2HBJJ inhibe las respuestas contráctiles de tráqueas de cobayas al carbacol de una manera dependiente de la concentración. La actividad inhibitoria fue más fuerte que el de antagonista mAChR, atropina
.
Canción
et al informaron de que
SCLC sintetizar y secretar acetilcolina, que actúa como un factor de crecimiento autocrino a través de ambos mecanismos colinérgicos nicotínicos y muscarínicos [dieciséis]. Nuestro estudio dilucidado líneas celulares de cáncer humano, al igual que el CPCP, expresa tanto M y N AChR, así como el chat, lo que implica que una base funcional de bucle autocrino colinérgica está presente en el CPNM. Por lo tanto, la actividad inhibidora del crecimiento de R2HBJJ en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo H1299, H460 y H157 células, puede ser mediada por tanto M y N mecanismos colinérgicos. Pero cuando las células H1299 fueron tratados con antagonistas selectivos o no selectivos conocidos sobre los receptores M y N-
in vitro
, se observa que sólo M3 antagonista del receptor de darifenacina presentó una inhibición significativa en el crecimiento celular. Mientras tanto, nuestros compuestos R2HBJJ y R2-PHC también inhibió notablemente la viabilidad celular de las células H1299, con un efecto preferible que la darifenacina. En el estudio de la canción
et al
, el tratamiento de células de SCLC con antagonistas de los receptores M3 de 4-DAMP o darifenacina inhibe el crecimiento celular tanto
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados sugieren que los antagonistas del receptor M3 tienen actividad inhibidora sobre la NSCLC también. El efecto anti-proliferativo de R2HBJJ en NSCLC puede estar relacionada con su actividad antagonista del receptor M3 selectiva. Russo P
et al
informó de que la inhibición de la α7-nAChR con un potente antagonista de alta afinidad α-CbT indujo actividad antitumoral en NSCLC y mesotelioma pleural mediante la activación de la apoptosis [18] - [19]. Sin embargo, en nuestra investigación, se utilizó otro antagonista α7-nAChR α-BGT para el tratamiento de células H1299 y no se observó el efecto sobre la viabilidad celular, lo que sugiere que la señalización de α7-nAChR puede no ser el principal mediador en el crecimiento celular H1299.
en el presente estudio, se pudo observar el efecto proliferativo de ACh exógeno en células H1299, que puede implicar que la ACh endógena ha proporcionado suficiente efecto estimulante sobre la proliferación celular. Sin embargo, es necesario reponer exógena de ACh para antagonizar competitivamente la inhibición de R2HBJJ en células H1299. El resultado hincapié en que el efecto de R2HBJJ sobre el crecimiento celular H1299 se logró a través de un impacto sobre la señalización ACh endógena. En el presente estudio, chatear siRNA se ha demostrado para inhibir el crecimiento celular, que apoya esta hipótesis. Por otra parte, es de destacar que el tratamiento con receptor M3 siRNA resultó en una inhibición significativa del crecimiento en células H1299 en comparación con las células tratadas de control negativo siRNA. La potencia de inhibición alcanza el 50% o más dentro de un plazo de 96 h. Cuando receptor M3 fue eliminado de manera efectiva en las células H1299, las células lossed su sensibilidad a R2HBJJ. Los resultados acentúan aún más el papel de M3 en el efecto antiproliferativo de R2HBJJ. Arresto
ciclo celular es un mecanismo importante que impide el crecimiento del tumor. Nuestros resultados de análisis de citometría de flujo mostraron que R2HBJJ marcadamente suprimida la progresión mitótica celular a través de la detención de las células en la fase G0 /G1. transición del ciclo celular de G1 a S controla la síntesis de ADN y requiere la hiperfosforilación de un supresor de tumor, Rb [28]. En el proceso del ciclo, la actividad catalítica de la ciclina D1 asociarse con CDK4 /6 se manifiesta primero a mediados de G1, aumenta hasta un máximo en la transición G1 /S y contribuye a la salida de G1. Considerando E ciclina y ciclina A asociar con CDK2 se activa en la transición G1 /S o en la fase S temprana, respectivamente. La fosforilación de Rb se activa inicialmente por activos ciclina D1-cdk4 /6 complejos y más tarde se aceleró por la ciclina E-CDK2. Esta fosforilación permite la disociación de los factores de transcripción, tales como E2 unión promotor-factor de (E2F) y el proto-oncogén c-Abl sobreexpresa o mutado en una serie de tumores malignos, que puede transactivar genes en fase S que codifica para las proteínas que amplifican la se requiere interruptor y fase G1-a S para la replicación del ADN [29]. De las proteínas del ciclo celular examinados en el presente estudio, la expresión de ciclina D1, CDK4 y CDK6 proteínas se redujeron regulado en función del tiempo, mientras que los niveles de ciclina E y CDK2 no se vieron afectados significativamente. Por otra parte, la fosforilación de Rb en la posición de Ser
807/811 fue inhibida por R2HBJJ forma dependiente del tiempo, lo que podría abolir la interacción entre c-Abl y Rb y retardar la activación de c-Abl y la progresión del ciclo celular [ ,,,0],30]. En conjunto, nuestros datos sugieren que la proteína Rb y el compuesto quinasa de la ciclina D1 /CDK4, 6 eran en su mayoría involucrados en la detención G0 /G1 celular inducida por R2HBJJ. Los resultados también sugirieron que R2HBJJ ejerció su efecto de retardo en la primera fase de G0 /G1.
De hecho, las moléculas reguladoras que regulan la progresión del ciclo celular temprana como la ciclina D1-CDK4 /6-Rb son los blancos frecuentes de alteraciones genéticas en un excepcionalmente alto porcentaje de los cánceres de pulmón [31]. Muchos estudios han demostrado que las estrategias para dirigir proteínas asociados con la progresión temprana del ciclo celular y el punto de restricción de G1 pueden ser útiles en la terapia contra el cáncer [32] - [33]. Ciclina D1 también se ha demostrado ser una diana aguas abajo de varias vías de transducción de señales mediadas por oncogenes tales como Neu, Ras, y β-catenina. Un estudio reciente apoya la promesa de enfoque de co-orientación ciclina D1 como predictivo y la personalización para la prevención y la terapia [34] el cáncer de pulmón. Además, actuando a través de ACh mAChR se ha demostrado que conducen a la proliferación celular mediante la activación de MAPK, ERK1 /2 y la regulación de la progresión del ciclo celular [11], [16]. Nuestros datos no publicados también mostraron que la apoptosis temprana estuvo implicado en el efecto antiproliferativo de R2HBJJ, pero los mecanismos subyacentes que queda por estudiar más a fondo.
En conclusión, el presente estudio revela que las células NSCLC expresan un autocrina y paracrina sistema colinérgico que estimula el crecimiento de células de NSCLC. R2HBJJ, un nuevo antagonista muscarínico, puede bloquear el bucle local de colinérgica antagonizando los receptores M3 predominantemente e inhibir el crecimiento de células de NSCLC. El mecanismo de detención G0 inducida por R2HBJJ ciclo celular /G1 implica la baja regulación de la ciclina D1-CDK4 /6-Rb. Los resultados sugieren que los antagonistas de los receptores M3, posiblemente, se convierten en un nuevo régimen de quimioterapia potente para el NSCLC.
Materiales y Métodos
Materiales
compuesto
radiomarcados [
3 H] N-metilescopolamina ([
3H] NMS), proteínas de receptor muscarínico humano (M1, M2, M3, M4 y M5) y BetaPlate Scint de la membrana se obtuvieron de Perkin Elmer Life y Analytical Sciences. R2-APS y R2HBJJ (estructuras químicas mostradas en la Fig. 1) fueron sintetizados por nuestro instituto. Las estructuras químicas se confirmaron por análisis de espectro de resonancia magnética nuclear. La atropina, pirenzepina, mecamilamina, α-bungarotoxina (α-BGT), carbacol, y ACh se adquirieron de Sigma. bromhidrato dihidro-β-eritroidina (DhβE) y AF-DX116 se adquirieron de Tocris. La darifenacina se adquirió de Beijing Huafeng United Technology. Los anticuerpos utilizados para el Western Blot fueron adquiridos de Señalización Celular para la proteína supresora de tumores retinoblastoma (Rb), fosfo-Rb (Ser
780 y Ser
807/811), ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6. M3-AChR se obtuvo de Santa Cruz. Chat, β-actina, de cabra anti-conejo y de cabra anti-inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante se adquirieron de Beijing Zhongshan Jinqiao Biotecnología.
radioligando Ensayo de unión
Saturación de unión se realizó usando una gama de concentración de [
3H] NMS (0,3 a 19,5 nM; 82 Ci /mmol) en ausencia y en presencia de atropina (500 M) para determinar la unión no específica.