Extracto
Las expresiones alteradas de proteínas claudin han sido reportados durante el proceso tumoral en el cáncer colorrectal. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan estos eventos en este tipo de cáncer son poco conocidos. En este caso, nos informan de que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) aumenta la expresión de claudina-3 en las células HT-29 adenocarcinoma colorrectal humano. Este aumento estaba relacionado con el aumento de la migración celular y la formación de colonias dependientes de anclaje y de anclaje independiente. Hemos demostrado, además, que las vías de ERK1 /2 y PI3K-Akt estaban involucrados en la regulación de estos efectos ya que la inhibición farmacológica específica bloqueado estos eventos. La manipulación genética de claudin-1 y claudin-3 en células HT-29 mostró que la sobreexpresión de claudin-1 resultó en una disminución migración celular; Sin embargo, la migración no se vio alterada en las células que sobreexpresan la claudina-3. Además, la sobreexpresión de claudin-3, pero no la de claudin-1, aumentó el flujo ajustado paracelular relacionados unión de macromoléculas. Además, se observó un aumento de la formación de colonias dependiente de anclaje y anclaje independiente en las células que sobreexpresan claudin-3, mientras que no se observaron tales cambios cuando se sobreexpresa claudin-1. Finalmente, claudin-3 silenciar solo a pesar de inducir aumento de la proliferación, y la formación de colonias y anchoragedependent -independiente, fue capaz de prevenir el aumento del potencial maligno inducida por EGF. En conclusión, nuestros resultados muestran un nuevo papel para la claudina-3 sobreexpresión en la promoción del potencial maligno de las células del cáncer colorrectal, que es potencialmente regulada por las vías de ERK1 /2 y PI3K-Akt-EGF activado
Cita.: de Souza WF, Fortunato Miranda-N, Robbs BK, de Araujo WM, de-Freitas-junior JC, Bastos LG, et al. (2013) Claudín-3 La sobreexpresión aumenta el potencial maligno de las células del cáncer colorrectal: Roles de ERK1 /2 y PI3K-Akt como moduladores de la señalización del EGFR. PLoS ONE 8 (9): e74994. doi: 10.1371 /journal.pone.0074994
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 3 Enero, 2013; Aceptado: 9 Agosto de 2013; Publicado: 19 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 de Souza et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue patrocinado por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior (CAPES), Ministerio de Salud - Brasil, la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo a la Pesquisa do Estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología del em cáncer (573.806 /2008-0 y 170.026 /2008). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las uniones estrechas (TJs) son componentes estructurales importantes del complejo de unión apical en el epitelio, donde regulan diversos procesos intracelulares tales como el establecimiento de la polaridad apical-basal y el flujo de sustancias a través del espacio intercelular [1 ]. Claudins son las principales proteínas que regulan las funciones de los TJs y se clasifican como una familia de proteínas integrales de membrana Tetraspan, que comprende actualmente 27 miembros [2]. Una gran variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer, se han asociado con alteraciones en la expresión, la estabilidad y la localización subcelular de miembros de la familia claudin [3], [4], [5], [6]. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que regulan la expresión y la función de estas proteínas, en particular en el cáncer colorrectal, son poco conocidos.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se dimerizados y activados por su ligando extracelular, EGF, que desencadena una cascada de señalización que conduce a la activación de las vías citoplasmáticos tales como MAPK y PI3K-Akt [7], [8]; estas vías son conocidos para modular la proliferación, la diferenciación y la resistencia a la muerte celular [9], [10]. Los estudios han demostrado que estas vías están implicadas en eventos relacionados con los procesos cancerígenos en la epidermis del ratón y células de cáncer gástrico humano [11], [12], así como en el aumento del potencial migratorio e invasivo durante la transición epitelial-mesenquimal en ovario humano las células [13]. También se conocen vías de señalización del EGF mediada por jugar un papel importante en la organización de los TJs, en el que regulan la expresión y localización de claudin proteínas. Por ejemplo, se informó de EGF para inducir la regulación al alza de claudins 1, 3 y 4, y la regulación a la baja inducida por EGF de claudin-2 aumenta la fuerza de la barrera intercelular, como se determina por un aumento de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) en MDCK- II de las células [14], [15]. Sin embargo, utilizando el mismo modelo (células MDCK), otros autores han informado de que la regulación a la baja de claudin-2 indujo mayor motilidad celular, incluso con un aumento de TER [16]. Recientemente, el EGFR /ERK /c-Fos se demostró que un máximo de regular la claudina-2, un aumento que se correlaciona con el aumento de la permeabilidad intercelular y la migración celular en células de adenocarcinoma de pulmón humano [17], [18].
Little información se conoce acerca de los mecanismos moleculares que subyacen a las alteraciones en la expresión claudin que están asociados con la tumorigénesis colorrectal. Hemos demostrado que los pacientes con cáncer colorrectal se presentó un aumento de los niveles de expresión claudins 1, 3 y 4, que alteraron la función de barrera de TJs [19]. Estudios recientes han informado de un papel controvertido de claudina-1 durante la carcinogénesis colorrectal; aumento de la expresión de claudina-1 se observó en las lesiones metastásicas hepáticas de cáncer colorrectal, pero esta expresión se redujo en las metástasis de ganglios linfáticos de carcinomas de colon [20], [21]. Además, se han notificado las ERK1 /2 y PI3K vías para mediar aumentos en claudin-2 expresión inducida por EGF en células de cáncer de colon; este evento fue acompañado por un aumento en la proliferación, el crecimiento del tumor y el crecimiento independiente de anclaje
in vivo
[22]. Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos moleculares que regulan la expresión de otros miembros de la familia claudin y las consecuencias de la sobreexpresión claudina en la progresión del cáncer colorrectal.
En el presente estudio, mostramos que el aumento de la expresión de EGF mediada de claudin-3 está relacionado con el aumento de la migración celular y la formación de colonias dependientes de anclaje y de anclaje independiente en las células HT-29 adenocarcinoma colorrectal humano. Además, nos muestran que estos eventos fueron mediadas por la PI3K-Akt ERK1 /2 y. Se demostró además que la sobreexpresión forzada de claudin-3 en células HT-29 por manipulación genética aumentó el potencial maligno, mientras que la sobreexpresión de claudin-1 disminuyó la migración celular. Lo más importante, nuestros resultados ponen de manifiesto que la claudina-3 desempeña un papel como promotor de tumores cuando su expresión está desequilibrado e implicar a las vías de señalización ERK1 /2 y PI3K-Akt como moduladores de la claudina 3 de progresión tumoral relacionada con la regulación al alza en las células del cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Materiales
anti-claudina-1 (Cat. no. 51-9000) y anti-claudina-3 (Cat. no. 34-1700) anticuerpos policlonales de conejo, así como un anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-tubulina (Cat. no. 32-2500) se obtuvieron de Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA, EE.UU.). Anti-Akt (Cat. No. 4691) y anti-p-Akt (Cat. No. 4058) anticuerpos monoclonales de conejo, así como un monoclonal de ratón anti-ERK (Cat. No. 9107) de anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling (Beverly , MA, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal anti-uvomorulin /E-cadherina rata (Cat. No. U3254) y anti-p-ERK1 /2 monoclonal de ratón (Cat. No. M8159) anticuerpos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E-cadherina (clon 36, Cat.. No 610182) fue adquirido de BD Biosciences (San Diego, CA, EE.UU.). Peroxidasa de rábano conjugada anti-conejo y anti-IgG de ratón se adquirieron de GE Healthcare (Chalfont St. Giles, Reino Unido). Alex-fluor-488 anti-conejo (Cat. No. A11008) y Alex-fluor-546 anti-rata (Cat. No. A11010) se obtuvieron de Molecular Probes (Eugene, Oregon, EE.UU.). El 2- (4-morfolinil) -8-fenil-1 (4H) benzopiran-4-ona LY294002 (inhibidor de PI3K) (Cat. No. L9908) se obtuvo de Sigma-Aldrich, el 2- (2-amino- 3-metoxifenil) 4H-1-benzopiran-4-ona PD98059 (inhibidor de MEK1) (Cat. no. 9900) se obtuvo de la señalización celular, y EGF (Cat. no. PHG0311) se adquirió de Invitrogen Inc.
Cell Cultura y
las líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2 (Cat. no. HTB-37) y HT-29 (Cat. no. HTB-38), así como la de embriones humanos
línea de riñón
de células HEK-293 (Cat. no. CRL-1573) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Caco-2 células presentes con un fenotipo diferenciado en la etapa de monocapa y poseer la mínima invasiva y potencial metastásico [23], [24], [25], mientras que las células HT-29 presentan un fenotipo indiferenciado y un alto potencial tumorigénico [ ,,,0],26]. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que fue suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina G (60 mg /L), y estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 /aire. Para fines experimentales, las células se sembraron en placas de cultivo o en cubreobjetos de vidrio.
El tratamiento con EGF y los inhibidores farmacológicos
Los cultivos celulares se trataron con 20 ng /ml de EGF, una concentración que han utilizado en un estudio anterior [27]. Los efectos del tratamiento EGF en claudin-1 y claudin-3 de expresión en células Caco-2 y células HT-29 se evaluaron en las células que crecen en medio DMEM suplementado con 10% FBS después de 6, 24 y 48 h. Para la inhibición farmacológica, las células fueron privadas de suero durante la noche y se añadieron los inhibidores selectivos para los cultivos de células 1 h antes del tratamiento EGF para inhibir la actividad quinasa intrínseca. Las células se incubaron con medio de cultivo fresco complementado con FBS 10% que contiene EGF e inhibidores selectivos, que se mantuvieron a lo largo de los experimentos. Los inhibidores se diluyeron en DMSO y se almacenaron a -20 ° C. Cada solución concentrada se diluye inmediatamente antes de cada experimento para producir concentraciones finales de 50 mM (PD98059) y 8 M (LY294002).
plásmido construcción, la producción de recombinantes Retrovirus y la infección de células HT-29
Las construcciones que contienen la claudina-1 y claudin-3 ADNc murino se han descrito anteriormente [28], [29] y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Mikio Furuse (División de Biología celular, Departamento de Fisiología y Biología celular de la Universidad de Kobe , Japón). Los ADNc contenidos en estas construcciones se subclonaron en el plásmido de estructura principal retroviral pBABE-Puro para generar el pBABE-Cld1 (BamH1-Xho1) y constructos pBABE-Cld3 (Bgl2-Xho1). Se utilizaron células HEK-293 como células de empaquetamiento retrovirales después de un transitorio de co-transfección por precipitación de fosfato de calcio durante 24 h con el vector de empaquetamiento retroviral pCL-Ampho (Cat no 10046P;.. Imgenex, CA, EE.UU.) y una de las siguientes construcciones : pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 o vectores retrovirales vacías. El sobrenadante libre de células que contenía el virus se recogió 48 h después de la transfección, se mezcla 1:01 con medio fresco, suplementado con 8 mg /ml de polibreno (Cat no 107689;.. Sigma-Aldrich), e inmediatamente utilizado para el spin infección (2 × 45 min a 400 x g a temperatura ambiente) de 5 x 10
4 HT-29 células. Las células infectadas se incubaron a 37 ° C durante un período adicional de 24 h, tripsina y se utilizan como se indica.
HT-29
Cld1 y HT-29
Cld3 construcción célula
HT -29
Cld1, HT-29
Cld3 o vacíos en vectores (HT-29
pBabe) las células fueron generados por la transducción de células de tipo salvaje HT-29 con pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 o vectores vacíos y seleccionando las células transducidas con éxito con 7,5 mg /ml de puromicina (gato sin P8833;.. Sigma-Aldrich) durante al menos 5 días. Los clones se aislaron y la sobreexpresión de claudins 1 y 3 se confirmó por inmunotransferencia.
claudin-3 Silenciamiento
HT-29 células fueron transfectadas con o bien un control no dirigido siRNA (siRNA negativo#1 de control; Cat. no 4.390.844;. Ambion, TX, EE.UU.), lucha como un control para los efectos no específicos de la secuencia, o una secuencia de siRNA claudina-3-específica (Silenciador prediseñado siRNA CLDN3, gato sin SI03101623..; Qiagen, MD, EE.UU.). Las células (10
6) se resuspendieron en 100 l de tampón de 1 MS [30], proporcionado amablemente por el Dr. Martin Bonamino (INCA, Brasil), que contenía el dúplex revueltos o CLDN3-específica. Las células se transfirieron en una cubeta de 0,2 cm (Cat no MIR 50121;.. Mirus Biotech, Madison, WI, EE.UU.) y a electroporación utilizando el programa W-17 del sistema de electroporación Lonza Nucleofector II para las células HT-29 (Lonza Group Ltd , Basilea, Suiza). Las células se resuspendieron suavemente en DMEM suplementado con 10% FBS a una concentración final de 25 siRNA o 45 nM. La atenuación de la expresión CLDN3 se verificó por inmunotransferencia de lisados de células y de sondeo con un anticuerpo contra claudin-3.
extracción de células y la inmunotransferencia
Caco-2 (3 × 10
5) y HT-29 (2 × 10
5) las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se incubaron hasta su confluencia. Los molayers celulares se rasparon y se homogeneizaron en tampón de lisis (1% Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,2% SDS, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) que contenía NaF 20 mM, 1 ortovanadato mM y un cóctel inhibidor de la proteasa (1:100 dilución) para obtener lisados de células totales. Los lisados homogeneizados se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -20 ° C para su posterior análisis. Cantidades iguales de proteína (30 mg /carril) por muestra se separaron por electroforesis SDS-PAGE en 13% de geles y transferidas a hojas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon y se incubaron con anticuerpos primarios contra claudin-1 (1:500), claudin-3 (2 mg /ml), o α-tubulina (1:1000). Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos anti-conejo o anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante. Las proteínas se visualizaron utilizando un kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido). Las bandas se cuantificaron según sus densidades ópticas usando LabWorks 4,6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
inmunofluorescencia
Caco-2 (2 × 10
5) y HT -29 (10
5) las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos y se incubaron hasta su confluencia. Las monocapas de células se lavaron posteriormente con PBS y se fijaron con metanol durante 10 min a -20 ° C. A continuación, las células se bloquearon con 0,2% de BSA en PBS durante 1 h y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. Las células se incubaron durante la noche con anti-claudin-1, anti-claudin-3 (1:40), anti-E-cadherina (1:300) anticuerpos, seguido de 1 h de incubaciones con los anticuerpos secundarios conjugados Alexa 488-apropiados ( 1:500). Después de las incubaciones, las células se montaron utilizando n-propil-galato para permitir la visualización, ya sea con un Axio Observe.Z1 microscopio que estaba equipado con un HRc AxioCam y el software de procesamiento de imagen digital AxioVision Release 4.8 (Carl Zeiss Inc., Jena, Alemania) o un microscopio láser confocal de barrido
FV10i-o
, de la que se analizaron las imágenes utilizando el software FV10-ASW (Olympus, Tokio, Japón).
Wound Healing Ensayo
HT-29 células (2 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron hasta su confluencia. Para llevar a cabo ensayos de curación de heridas, monocapas de células fueron heridos manualmente raspando con puntas de pipeta. Después de diferentes tratamientos, se permitió a las células para migrar a las áreas desnudas y se fotografiaron inmediatamente después de la herida (0 h) y a las 6 h ó 24 h después de la herida. La distancia entre los dos bordes de un área denudada se cuantificó en triplicado y se repitió tres veces de forma independiente. La migración se representa como el porcentaje de la migración celular y se representó en un gráfico.
celulares Ensayos de proliferación
Los números de células viables relativas se determinaron utilizando cristal violeta o colorantes azul de tripano. El método de cristal violeta se llevó a cabo como se describe anteriormente [31]. Brevemente, las células HT-29 (10
4) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron en medio de cultivo con o sin EGF para 24 y 48 h antes de la fijación de etanol durante 10 min. Se añadió una solución de cristal violeta (0,05% de cristal violeta y 20% de metanol) a las células durante 10 min. Las células se lavaron y se solubilizaron con metanol. Las absorbancias a 595 nm se midió con un espectrofotómetro Spectra Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Para el método de azul de tripano, transducidas células HT-29 (2 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron en medio de cultivo durante 6 h. Después de las incubaciones, las células se trataron con tripsina (0,05% de EDTA de tripsina /0,02% en solución de PBS) y se contaron en un microscopio Axio Observe.Z1 (Zeiss) con un hemacitómetro cámara de Neubauer y tripán colorante azul (0,4% de azul de tripano en solución PBS) .
dependientes de anclaje y la formación de colonias -independiente
para los ensayos de formación de colonias dependientes de anclaje, las células HT-29 se sembraron a una densidad baja (2,5 x 10
2) para 4 h en placas de 12 pocillos y se trataron con EGF durante 5 días o no se tratan. Después de 5 días, las células se fijaron con etanol durante 10 min y se tiñeron con una solución de cristal violeta (0,05% de cristal violeta y 20% de metanol). Las células se lavaron dos veces con agua y se solubilizaron con metanol. Las colonias se contaron ya sea con un microscopio Axio Observer.Z1 (Zeiss) o las absorbancias se midieron a 595 nm con un espectrofotómetro Spectra Max190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Para colonia independiente de anclaje ensayos de formación, placas de 12 pocillos se recubrieron con medio de crecimiento suplementado con 10% de FBS que contenía 0,6% de agarosa para evitar la adhesión de células al sustrato. células HT-29 (5 × 10
2) se resuspendieron en medio de cultivo que contiene 10% de FBS más 0,3% de agarosa, se sembró sobre el sustrato descrito anteriormente y sometidos a distintos tratamientos durante 11 días (como se indica). En el punto final, las colonias se contaron con un microscopio Axio Observer.Z1 (Zeiss).
Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TER)
funcionalidad TJ también se evaluó mediante la medición de la TER para evaluar el flujo paracelular a los iones, como se describe anteriormente por Contreras et al [32], con ligeras modificaciones. En pocas palabras, transducidas células HT-29 (10
4) se sembraron a confluencia en cultivo Transwell celda de membrana de poliéster inserta con un 0,4 micras de tamaño de poro y 0.33 cm
2 de superficie (Cat no CLS3470;.. Sigma-Aldrich ). Los valores TER se determinaron utilizando un sistema Millicel-ERS (Millipore Co., Billirica, MA, EE.UU.). Los valores representados en el gráfico se normalizaron para el área de la inserción y el valor en blanco (solución del baño se incubaron con inserto sin células) se restó. La TER se mide por tanto en ohmios x cm
2 (Ω · cm
2).
Macromoléculas Permeabilidad Ensayo
A fin de probar la funcionalidad TJ, se evaluó la permeabilidad macromolecular usando un ensayo de permeabilidad de anticuerpos, como se describe anteriormente [33]. Transducidas células HT-29 (10
5) se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos y se incubaron hasta su confluencia. Las monocapas de células fueron fijadas en paraformaldehído al 2% y se incubaron con anticuerpo anti-uvomorulin /E-cadherina durante 2 h bajo condiciones nonpermeabilization, seguido de 1 h de incubación con el respectivo anticuerpo secundario a 37 ° C. La tinción uvomorulin /E-cadherina se visualizó con un microscopio Axio Observer.Z1 (Zeiss).
Análisis estadístico
Un análisis estadístico se realizó con un ANOVA de una vía, seguido por el poste de Dunnett -pruebas o la prueba t usando el software GraphPad Prism 4.02 (GraphPad software, San Diego, CA, EE.UU.). Los gráficos representan las medias ± el error estándar (SEM) de tres experimentos independientes. Una diferencia de p. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
EGF aumenta los niveles de proteína de Claudín-3 en células HT-29, pero no en células Caco-2
Inicialmente, se examinaron los cambios en los niveles de expresión de claudina-1 y claudin-3 después del tratamiento EGF en dos líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal, Caco-2 y HT-29, que difieren en el estado de diferenciación y potencial metastásico. Hemos observado que la EGF-tratamiento no alteró significativamente los niveles de proteína de claudins 1 y 3 en Caco-2 y células HT-29 en un punto de tiempo temprano (6 h) (Fig. 1A). Después de los tiempos de tratamiento prolongados (EGF 24 y 48 h), los niveles de proteína de claudinas 1 y 3 no se alteraron significativamente en células Caco-2. Sin embargo, células HT-29 mostraron un aumento significativamente los niveles de claudin-3, mientras que los niveles de claudin-1 se mantuvo sin cambios en este mismo punto de tiempo del tratamiento (Fig. 1B). Además, el análisis de inmunofluorescencia indica que el tratamiento EGF durante 48 h no alteró los patrones de distribución de claudins 1 y 3 en células Caco-2 (Fig. 2A). Sin embargo, se observaron un patrón de tinción discontinua y la acumulación puntual de estas proteínas en algunas regiones de contacto célula-célula de células HT-29 (Fig. 2B). Debido a que el EGF no alteró los niveles de proteína de claudinas 1 y 3 en células Caco-2, se examinó si el EGF puede activar las vías efectoras en esta línea celular. Verificamos que el tratamiento EGF aumentó los niveles de fosforilación de ERK1 /2 (Fig. S1), un efector de señalización conocido provocada por EGF. Estos resultados indican que el tratamiento EGF regula diferencialmente claudins 1 y 3 en función del contexto celular. Basándose en estos resultados, se optó por las células HT-29 para su posterior análisis funcional debido a las alteraciones observadas en la expresión y distribución subcelular de las proteínas claudin después del tratamiento EGF.
cultivadas células Caco-2 y HT-29 eran tratados con EGF (20 ng /ml) durante 6 h (a), 24 h y 48 h (B). Después del tratamiento EGF, los lisados de células totales se recogieron y se analizaron por inmunotransferencia para la expresión de claudins 1 y 3. α-tubulina se utilizó como control de carga. Los números representan la proporción de la densidad óptica de EGF-tratados con células no tratadas normalizados por α-tubulina.
Claudín
; Calculado. α
-tubulina
; α-tina.
Las monocapas celulares se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se procesaron para el análisis de inmunofluorescencia de claudina-1 y la distribución claudina-3 después de tratamiento con EGF (48 h). Las células teñidas se vieron con confocal
FV10i-O o
microscopios Axio Observe.Z1. (A) células Caco-2
; bar: 5
micras. (B) las células HT-29; bar: 10 micras.
Puntas de flecha
; la acumulación puntual de claudinas.
Ctr
; el control.
Tratamiento EGF aumenta la formación Migración y dependientes de anclaje y anclaje independiente de la colonia de células HT-29
Hemos demostrado que el aumento de la migración de células está relacionada con los mecanismos de tumor progresión en células de cáncer [10], [31] y que el tratamiento EGF aumentó la migración de células Caco-2 [34]. Para determinar si EGF alteró la migración de las células HT-29, se realizaron ensayos de curación de heridas después de tratamiento EGF. Hemos observado que después de 24 h de tratamiento con EGF, el potencial migratorio de células se incrementó en comparación con la de las células no tratadas (Fig. 3A y 3B). Para investigar más si el cierre de la herida era de hecho debido al estado de la migración y la no proliferación de las células, se verificó el número relativo de células viables. La Figura 3C muestra que la proliferación celular no fue alterada en las células tratadas con EGF en comparación con las células no tratadas al mismo punto de tiempo que se observó en el ensayo de curación de heridas. Un aumento en la proliferación celular se observó solamente 48 h después del tratamiento EGF.
(A, B) se cultivaron células HT-29 en placas de 6 pocillos hasta confluencia. A continuación, las monocapas de células fueron heridos y tratados con EGF, y la migración de células en estas regiones se controló durante 24 h. (C) células HT-29 se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con EGF a los tiempos indicados, y la proliferación se cuantificó utilizando la técnica del cristal violeta. El gráfico de barras muestra la relación de la absorbancia de EGF-tratado con células no tratadas (control). Bar: 100 micras. Las barras de error indican las medias ± SEM (n = 3); ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, determinado por la prueba t
Se sabe que la transformación celular es un parámetro importante para evaluar el potencial maligno, que también puede ser evaluada por el. capacidad de las células para formar colonias dependientes de anclaje y de anclaje independiente de [35], [36]. En este contexto, se evaluó el potencial que transforma la célula de EGF en las células HT-29. Como se observa en la figura 4A, las células tratadas con EGF muestran un mayor número de colonias dependientes de anclaje en comparación con las células no tratadas. Además, el tratamiento EGF aumentó el número de colonias independientes de anclaje y los tamaños de colonias en comparación con las células control (Fig. 4B). En conjunto, estos datos demuestran que el EGF aumenta eventos relacionados con el potencial maligno de células de cáncer colorrectal no diferenciadas.
(A) fotografías representativas de las colonias dependientes de anclaje que se tiñeron con cristal violeta después del tratamiento EGF. Los gráficos de barras muestran la relación de veces de incremento en la formación de focos de EGF tratados con las células no tratadas (control). (B) Imágenes representativas de colonias independientes de anclaje que muestran las diferencias de tamaño entre las células tratadas con EGF y sin tratar. Los gráficos de barras muestran la relación de veces de incremento en la formación de colonias de EGF-tratados con células no tratadas (control). Bar: 10 micras. Las barras de error indican las medias ± SEM (n = 3); * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 como se determinó mediante la prueba t
ERK1 /2 y el incremento inducido por EGF-PI3K-Akt señalización mediar en la migración celular y la formación de colonias de células HT-29.
EGF es bien conocido para activar las vías de señalización, tales como ERK1 /2 y PI3K-Akt, para regular la proliferación celular, la supervivencia y la diferenciación en varios modelos de células tumorales. Por lo tanto, analizamos si estas vías también podrían modular los eventos EGF inducida subyacentes que habíamos observado aquí, incluyendo el aumento de la claudina-3 de expresión. Como se ve en la figura 5A, el tratamiento EGF aumentó los niveles de fosforilación de ERK1 /2 y Akt, lo que indica la activación de estas proteínas. A continuación, se inhibió la farmacológicamente vías PI3K-Akt con PD98059 y LY294002 MEK1 /2-ERK1 /2 y, respectivamente, para comprobar si estas vías podrían modular el aumento inducida por EGF en claudin-3 niveles de expresión en células HT-29. Hemos observado que el tratamiento con solos o en combinación estos inhibidores impidió el aumento inducida por EGF en los niveles de expresión claudin-3 (Fig. 5B). Asimismo, se observó que la inhibición de las vías de señalización ERK1 /2 y PI3K-Akt impidió el aumento inducida por EGF en la migración celular (Fig. 5C). En las figuras 5D y 5E, se verificó además que la inhibición de ambas vías impedido aumentos inducidos por EGF en el número de colonias dependientes de anclaje y de anclaje independiente. Curiosamente, el pretratamiento con el inhibidor de PI3K solo y en combinación con el inhibidor de ERK1 /2 se redujo la formación de colonias dependiente de anclaje. En conjunto, estos datos apoyan fuertemente la noción de que las vías de ERK1 /2 y PI3K-Akt también están involucrados en el aumento de claudin-3 niveles de expresión, concomitante a la mayor potencial maligno que es inducida por EGF en células HT-29.
se cultivaron y se trataron con EGF para 5, 15, 30 y 60 min, después de lo cual se recogieron los lisados de células totales y se analizaron por inmunotransferencia para p-ERK1 /2 células (a) HT-29, ERK1 /2, p- Akt y Akt. (B) Las células se cultivaron y trataron previamente durante 1 h con los inhibidores indicados antes de la incubación con EGF durante 48 h. Total de lisados de células se recogieron y se analizaron por inmunotransferencia para claudin-3. a-tubulina se utilizó como control de carga. Los números representan la proporción de la densidad óptica de tratados con células no tratadas normalizados por la proteína total o α-tubulina. Imágenes representativas de la cicatrización de heridas (C), la formación de colonias dependiente de anclaje (D) y los ensayos de formación de colonias independiente del anclaje (E). Las células se trataron previamente con los inhibidores como se indica, y se realizaron los ensayos como se describe en los Materiales y Métodos. Para el ensayo dependiente de anclaje, el gráfico de barras muestra la relación entre el aumento de veces en la formación de focos de tratados con células no tratadas (control). Para el ensayo independiente de anclaje, los gráficos de barras muestran la relación entre el aumento de veces en la formación de colonias de tratados con células no tratadas (control). Bar: 200 micras. Las barras de error indican las medias ± SEM (n = 3); ** P & lt;. 0,01 determinado mediante un ANOVA
Forzada La sobreexpresión de Claudín-1 y Claudín-3 aumenta la TER, pero Claudín-3 Sobreexpresión Facilita el flujo paracelular de macromoléculas
sobre la base de los resultados descritos anteriormente, que postula que los niveles de expresión diferencial de funciones importantes en la progresión del cáncer colorrectal claudin-1 y claudin-3 juego. A fin de probar esta hipótesis, se obligó a la expresión de claudina-1 y claudin-3 cDNA en células HT-29, y las células resultantes se denominaron HT-29
CLD-1 y HT-29
CLD-3 , respectivamente. El análisis por inmunotransferencia confirmó robusta claudina-1 (HT-29
CLD-1) y claudina-3 (HT-29
CLD-3) sobreexpresión en comparación con las células que fueron transducidas con el vector vacío (HT-29
pBABE) (Fig. 6A). Por otra parte, las células que sobreexpresan estas proteínas muestran una mayor tinción citoplasmática; sin embargo, el etiquetado se mantuvo a contactos célula-célula (Fig. 6B)
.
(A) Las células se cultivaron y los lisados totales de células se recogieron y se analizaron por inmunotransferencia para la expresión de claudin-1 y claudin- 3. Los números representan la proporción de la densidad óptica de claudin-transduce a las células transducidas por vectores vacíos normalizados por α-tubulina. (B) Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se procesan en condiciones permeabilizantes para el análisis de inmunofluorescencia de claudin-1 y la distribución claudin-3; bar: 5 micras. (C) Las células se cultivaron en insertos Transwell y la TER se midió utilizando el sistema de Millicel-ERS. Los gráficos de barras muestran los valores TER normalizados para la zona del inserto con el valor sustraída en blanco. (D) Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y se procesaron para inmunofluorescencia en condiciones no de permeabilización para evaluar la permeabilidad macromolecular utilizando el anticuerpo anti-uvomorulin /E-cadherina; bar: 10 micras. (E) Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio y se procesan en condiciones permeabilizante para el análisis de inmunofluorescencia de la distribución de E-cadherina. Las células teñidas se vieron con
FV10i-O
microscopio confocal. Las barras de error indican las medias ± SEM (n = 3); α-tubulina se utilizó como control de carga.