Extracto
El cáncer de ovario es la principal causa de muerte por todos los cánceres ginecológicos y terapias convencionales como la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia y por lo general no logran controlar las etapas avanzadas de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de opciones terapéuticas alternativas e innovadoras. Nosotros razonamos que la terapia génica del cáncer utilizando un vector capaz de entregar específicamente un gen que codifica la enzima a las células de cáncer de ovario permitirá que el cáncer de células para metabolizar un profármaco inocuo en una potente citotoxina, que dará lugar a efectos terapéuticos. En el estudio actual, se explora el uso de un pseudovirión virus del papiloma humano (VPH) para entregar un gen (HSV-tk) del herpes simple timidina quinasa del virus a las células tumorales de ovario. Se encontró que el pseudovirión HPV-16 fue capaz de infectar preferentemente a las células tumorales de ovario de murino y humanos cuando se administra por vía intraperitoneal. Además, la inyección intraperitoneal de HPV-16 pseudovirions que portan el gen HSV-tk seguido de tratamiento con ganciclovir dio lugar a efectos antitumorales terapéuticos significativos en los ratones portadores de cáncer de ovario de murino. Nuestros datos sugieren que pseudovirión HPV puede servir como un vehículo de suministro potencial para la terapia génica del cáncer de ovario
Visto:. Hung C-F, Chiang AJ, Tsai H-H, Pomper MG, Kang TH, Roden RR, et al. (2012) Ovario Cancer Gene Therapy Usando el VPH-16 pseudovirión que lleva el gen HSV-tk. PLoS ONE 7 (7): e40983. doi: 10.1371 /journal.pone.0040983
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Marzo, 2012; Aceptado: 15 de Junio de 2012; Publicado: 17 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Hung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer Programas especializados de Investigación de Excelencia (http://trp.cancer.gov/) en el cuello del útero CA098252 P50 cáncer, CA118790 (Roden), y CA122581 (Roden). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por todos los cánceres ginecológicos y el sexto cáncer más común entre las mujeres en los Estados Unidos [1], [2]. A pesar de los avances significativos se han producido en las dos técnicas quirúrgicas y quimioterapéuticos, las tasas de supervivencia global a 5 años para todas las etapas del cáncer de ovario permanecen & lt; 50% [2], [3]. Las terapias actuales (cirugía, quimioterapia y radioterapia) por lo general no pueden controlar las etapas avanzadas de la enfermedad. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos alternativos pueden servir como importantes métodos para controlar estos tumores de ovario en estadio avanzado.
Un enfoque posible es el uso de la terapia génica suicida (SGT). Con SGT, el gen para una enzima extranjera (una es decir, a partir de un virus, bacteria, o la levadura) se entrega específicamente a las células cancerosas. de suministro de genes es seguido por la administración sistémica de un profármaco no tóxico. Las células cancerosas infectadas son capaces de expresar la enzima extranjera para convertir el profármaco en una citotoxina activa, que es capaz de matar las células infectadas. Una ventaja SGT tiene más de terapias génicas convencionales es su capacidad para matar las células vecinas a través del efecto espectador. El fármaco activo puede escapar a las células transducidas y difundirse en las células vecinas no infectadas, conduciendo en última instancia a la muerte también. Las células que mueren son también capaces de inducir a las células asesinas naturales (NK) y células T para inducir un efecto espectador distante. La esperanza de este enfoque es tener una gran especificidad para las células tumorales, particularmente las células madre del cáncer. Este enfoque también debe reducir los efectos secundarios tóxicos asociados con las terapias convencionales para el cáncer debido a la mayor especificidad tanto de la entrega y la activación de la citotoxina [4].
El sistema de gen /profármaco suicidio más estudiado es la combinación de herpes simplex timidina quinasa del virus (HSV-tk) con ganciclovir (GCV) [5]. HSV-tk, que tiene alta afinidad por ganciclovir, cataliza la fosforilación de la primera GCV, que luego puede ser di- y tri-fosforilado por quinasas celulares. Trifosforilado GCV se puede incorporar en el ADN de replicación, que conduce a la inhibición de la polimerasa y, eventualmente, apoptosis [4] - [6]. Este sistema ha demostrado un cierto éxito en la clínica, pero su utilidad está limitada por su dependencia de contacto y Gap uniones de célula a célula para el efecto espectador [4].
5-8 semanas de edad C57BL /6 ratones fueron desafiados con células tumorales MOSEC (1 × 10
6 células /ratón). Una semana después, los ratones portadores de tumor se inyectaron por vía intraperitoneal con o sin el VPH-16 /pseudovirions Luc (20 g HPV-16 L1 de proteína /ratón, equivalente a 120 ng de ADN /ratón). ratones no tratados previamente infectados con o sin el VPH-16 /pseudovirions luc sirvieron como control. Los ratones fueron imágenes por no invasiva de imágenes de luminiscencia 1 día después de la infección. Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados.
En este estudio, utilizamos el virus del papiloma humano con defectos de replicación (VPH) pseudovirions para entregar el gen HSV-tk a las células tumorales de ovario. Estudios recientes muestran plásmidos de ADN pueden ser empaquetados en la L1 de papilomavirus y de las proteínas de la cápsida L2 para generar el 'pseudovirión' que pueden eficiente entregar el ADN en múltiples líneas celulares [7] - [9]. La encapsulación también protege al ADN de las nucleasas y proporciona un suministro dirigido con gran estabilidad. Muchos de los problemas de seguridad asociados con el uso de vectores virales se alivian en vivo como los pseudovirions VPH contienen un constructo de ADN diferente del genoma viral natural por VPH. También hay más de 100 tipos de virus del papiloma pseudovirions, lo que permite repetidos impulsar el uso de diferentes tipos ya que los anticuerpos neutralizantes contra un tipo por lo general no son de reacción cruzada con otros tipos.
A continuación se explora el uso de pseudovirions VPH a entregar los genes marcadores y genes suicidas para ambas células de tumor de ovario de murino y humanos. Se encontró que la inyección intraperitoneal de VPH-16 pseudovirions condujo a la infección preferencial de los cánceres de ovario y murinos ectópicos que ocurren de forma espontánea en ratones. infección preferencial también se produjo en xenoinjertos de tumor de ovario humano de ratones portadores de tumores. La inyección intraperitoneal de HPV-16 pseudovirions que portan el gen HSV-tk seguido de la administración de ganciclovir dio lugar a efectos antitumorales terapéuticos significativos en los ratones portadores de cáncer murino-ováricos. Nuestros datos muestran prueba de principio de que pseudovirions VPH pueden ser vectores útiles para la entrega de genes terapéuticos a los cánceres de ovario.
5-8 semanas se inyectaron por vía intraperitoneal ratones desnudos de edad con células de ovario de ES2 humanos tumorales (1 x 10
6 células /ratón). Una semana después, los ratones portadores de tumor se inyectaron por vía intraperitoneal con el tipo salvaje (wt) HPV-16 /Luc PSV o L2 mutante pseudovirions (MTL2) HPV-16L1mtL2-Luc (20 g HPV-16 L1 de proteína /ratón, equivalente a 120 ng de ADN /ratón). los ratones no tratados previamente infectadas con VPH-16 pseudovirions /luc wt o MT sirvieron como controles. Los ratones fueron imágenes por no invasiva de imágenes de luminiscencia 1 día después de la infección. Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación previa del Comité de Johns Hopkins Cuidado y Uso de Animales (protocolo MO08M446).
Ratones
El C57BL /6 y desnudos (BALB /c nu /nu) eran adquirida por el Instituto Nacional del cáncer.
MISIIR-TAG
ratones transgénicos [10] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Denise Connolly en el Fox Chase Cancer Center. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos, y se llevaron a cabo todos los procedimientos de acuerdo a los protocolos aprobados y de acuerdo con las recomendaciones para el buen uso y cuidado de los animales de laboratorio.
C57BL /6 ratones y
MISIIR -Tag
ratones transgénicos fueron inyectados con 20 g de VPH-16 /luc PSV por inyección intraperitoneal de 10 semanas después del nacimiento. imágenes de luminiscencia se tomaron 1 día después de la inyección VPH-16 /luv PSV.
Arriba, España imágenes de luminiscencia representativos de 6 ratones infectados con el PSV C57BL /o
MISIIR-TAG
ratones transgénicos (izquierda) y sus órganos extraídos (derecha). Nota: La flecha blanca indica sólo el cáncer de ovarios de ratones transgénicos MISRII pueden ser infectados por el VPH-16 /luc PSV.
Inferior,
gráficos de barras de imágenes representativas de la luminiscencia en ratones transgénicos MISIIR-TAG o ratones C57BL /6. datos representativos de 2 experimentos realizados.
Líneas Celulares
293TT células fueron amablemente proporcionados por J Schiller (Instituto Nacional del Cáncer (NCI), Institutos Nacionales de Salud (NIH)) [11 ]. La línea celular MOSEC (una línea celular de cáncer de ovario de ratón) fue preparado como se describe anteriormente [12]. La línea celular ES2 (una línea celular de cáncer de ovario humano) se adquirió en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Se generaron células MOSEC /luciferasa (luc) MOSEC-como se ha descrito anteriormente [13].
células MOSEC-Luc se infectaron HPV16-GFP o PSV PSV HPV16 /HSV-tk a una concentración de 1 g de proteína L1 /ml durante 48 horas. Las células infectadas se sembraron en placas de 96 pocillos y luego tratados con 0 mg /ml, 0,1 g /ml, 1 mg /ml, o 10 mg /ml de ganciclovir durante 72 horas. La expresión de luciferasa fue examinado por el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados.
Los plásmidos
Los plásmidos que codifican HPV16 L1 L2 (pShell16) fueron amablemente proporcionados por el Dr. J Schiller (NCI). El punto de mutación HPV16L1 MTL2 constructo se describe en nuestro estudio anterior [14]. La generación del plásmido de luciferasa que expresan (pcDNA3 luciferasa) y el plásmido que expresa GFP (pcDNA3-GFP) se ha descrito anteriormente [15], [16]. El plásmido pORF-HSVtk se adquirió de InvivoGen.
VPH pseudovirión Producción
HPV16-GFP, HPV16-Luc (luciferasa), HPV16-tk (timidina-Virus Herpes Simplex HSVtk quinasa) fueron pseudovirions hecho usando los métodos como se describe anteriormente [11]. Brevemente, las células se cotransfectaron 293TT con plásmidos de expresión HPV pShell16 y los plásmidos de elección (por ejemplo, GFP, luciferasa o HSVtk) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 48 h, las células se recogieron y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) (Invitrogen) suplementado con 9,5 mM MgCl
2 y la mezcla de antibiótico-antimicótico (DPBS-Mg) (Invitrogen). Las células fueron suspendidas en DPBS-Mg complementado con 0,5% Brij58, 0,2% Benzonase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EE.UU.), y el 0,2% plásmido Seguro (Epicentro biotecnologías, Madison, WI, EE.UU.) a & gt; 100 × 10
6 células /ml y se incubaron a 37ºC durante 24 h para la maduración de la cápside. Después de la maduración, el lisado celular se enfrió en hielo durante 10 min. La concentración de sal del lisado celular se ajustó a 850 mM y se incubó en hielo durante 10 min. El lisado se clarificó por centrifugación, y el sobrenadante se estratificó sobre un gradiente de Optiprep. El gradiente se centrifugó durante 4,5 horas a 16 C a 40 000 rpm en un rotor SW40 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EE.UU.). La pureza de pseudovirions HPV se evaluó mediante la ejecución de las fracciones por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio gradiente de 4-15%. El plásmido de ADN encapsulado se cuantificó mediante la extracción de ADN encapsidado de las facciones OptiPrep seguido de comparaciones de PCR cuantitativa en tiempo real con diluciones en serie de ADN desnudo. Las concentraciones de plásmidos (GFP, luciferasa, o HSVtk) en los pseudovirions se determinó que eran de aproximadamente 6,2 ng de ADN por 1 g de proteína L1.
In vitro
Infección de células tumorales por HPV16 pseudovirions
MOSEC o células ES2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células se infectaron con el VPH-16 /Luc PSV (1 mg de proteína L1 /ml) durante 72 horas. Se añadió luciferina (15 g /ml) y se incubó durante 10 min. Se utilizó un tiempo de integración de 10 segundos para la adquisición de imágenes de luminiscencia por el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.).
Caracterización de Infección Tumor por HPV16 pseudovirions en ratones
ratones C57BL /6 (5 por grupo) se inyectaron por vía intraperitoneal con 1 × 10
6 células MOSEC /ratón. Una semana después, los ratones portadores de tumor se inyectaron por vía intraperitoneal con el VPH-16 /Luc PSV a una dosis de 20 mg de HPV-16 L1 de proteína /ratón (equivalente a 120 ng de ADN /ratón). imágenes de luminiscencia se registraron el día después de la inyección de VPH-16 /Luc PSV. Se utilizó un tiempo de integración de 2 min para la adquisición de imágenes de luminiscencia
.
Para la caracterización de la infección de las células de cáncer de ovario humano por el VPH-16 /Luc PSV, ratones desnudos fueron desafiados con células tumorales de ovario humano ES2 en una dosis de 1 × 10
6 células /ratón. Una semana después, los ratones portadores de tumor se inyectaron por vía intraperitoneal con el tipo salvaje (wt) HPV-16 /Luc PSV o mutante (MT) HPV-16L1mtL2-Luc PSV a una dosis de 20 mg de HPV-16 L1 de proteína /ratón (equivalente a 120 ng de ADN /ratón). Naïve ratones sin tumores infectados con VPH en peso o MT-16 /Luc PSV sirvieron como controles. imágenes de luminiscencia se tomaron el día después de la inyección VPH-16 /Luc PSV. Los ratones fueron inyectados con 0,2 ml de luciferina 15 mg /ml escarabajo (sal de potasio; Promega). Después de 10 minutos, los ratones fueron imágenes utilizando el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). Se utilizó un tiempo de integración de 30 segundos para la adquisición de imágenes de luminiscencia.
HPV 16
in vitro
citotoxicidad mediada por HPV16-TK y ganciclovir pseudovirions
células MOSEC-Luc estaban infectados GFP PSV o HPV16-TK PSV (1 mg de proteína L1 /ml) durante 48 horas. Las células infectadas se sembraron en placas de 96 pocillos. Las células infectadas fueron tratadas con 0 g /ml, 0,1 mg /ml, 1 mg /ml, o 10 mg /ml de ganciclovir durante 72 horas y la expresión de luciferasa fue examinado por IVIS 200 del sistema (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU. ).
en vivo
citotoxicidad mediada por HPV16-TK y ganciclovir pseudovirions
Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 1 × 10
6 MOSEC-Luc células /ratón en día 1. la actividad de luciferasa se examinó en día 2 como una indicación del número de tumores en el ratón. Los ratones fueron inyectados con 0,2 ml de luciferina 15 mg /ml escarabajo (sal de potasio; Promega). Después de diez minutos, los ratones fueron imágenes utilizando el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). Se utilizó un tiempo de integración de 2 min para la adquisición de imágenes de luminiscencia. Los ratones fueron inyectados con HPV16-GFP PSV (20 g de proteína L1) o HPV16-TK PSV (20 g de proteína L1) en el día 3. Los ratones se trataron diariamente con ganciclovir (50 mg /kg) o PBS de día 5 al día 18. Los ratones se obtuvieron imágenes de nuevo por imágenes de luminiscencia no invasiva en el día 20.
resultados
inyección intraperitoneal de VPH-16 pseudovirions conduce a la infección preferencial de las células murinas cáncer de ovario en ratones portadores del tumor
Hemos examinado inicialmente si el pseudovirión VPH-16 que lleva el gen de la luciferasa (VPH-16 /Luc PSV) fue capaz de infectar la línea celular de cáncer de ovario murino, MOSEC,
in vitro
. Como se muestra en la Figura S1, el VPH-16 /Luc PSV fue capaz de infectar células tumorales MOSEC
in vitro
. Para demostrar si el VPH-16 /Luc PSV también puede infectar la línea celular de cáncer de ovario murino en ratones portadores de tumores, primero por vía intraperitoneal ratones inyectados con células tumorales MOSEC. Los ratones portadores de tumor se inyectaron por vía intraperitoneal con el VPH-16 /Luc PSV una semana más tarde. Como se muestra en la Figura 1, mientras que los ratones sin tumores no mostraron ninguna actividad de luciferasa, los ratones portadores de tumor intraperitoneal inyectados con VPH-16 /Luc PSV demostrado una actividad luciferasa significativa. Estos datos sugieren la pseudovirión HPV infecta preferentemente las células del tumor en ratones portadores de tumores.
inyección intraperitoneal de HPV-16 pseudovirions conduce a la infección preferencial de las células de cáncer de ovario humano en ratones desnudos portadores del tumor
además, examinó si el VPH-16 /Luc PSV fue capaz de infectar la línea celular de cáncer de ovario humano ES2. Como se muestra en la Figura S2, ES2 células infectadas con VPH-16 /Luc PSV demostró la actividad luciferasa, lo que sugiere que el VPH-16 /Luc PSV era capaz de infectar las células del cáncer de ovario humano
in vitro
. También se caracterizó el
in vivo
infectividad de HPV-16 /PSV luc en ratones desnudos portadores de tumores de ovario ES2 humanos para determinar si la infectividad de pseudovirions VPH es esencial para la administración génica eficiente a las células tumorales de ovario por pseudovirions VPH. Ahora está claro que la proteína secundaria de la cápsida de HPV L2 es esencial para la infección eficiente de las células por pseudovirions VPH [14], [17]. Por lo tanto, hemos empleado el VPH-16 /Luc PSV con una única mutación de aminoácidos en HPV L2 (HPV16L1mtL2-luc PSV) que suprime la infectividad de pseudovirions [14]. Como se muestra en la Figura 2, sólo los ratones desnudos portadores de tumores de ovario humanos demostraron luminiscencia significativa en comparación con los ratones desnudos no tumorales que portan. Además, los ratones portadores de tumores solamente infectados por el VPH-16 /luc PSV pero no mutante HPV-16 /L1mtL2- luc demostraron PSV luminiscencia significativa (Fig. 2). Por lo tanto, nuestros datos muestran que el VPH-16 pseudovirions pueden también preferentemente infectar las células tumorales de ovario humano
in vivo
. Además, nuestros datos indican que el VPH intacta L2 es esencial para la prestación eficiente de los genes encapsidated a las células tumorales de ovario por pseudovirions VPH.
VPH-16 /luc PSV infecta preferentemente de ovario Los tumores en
MISIIR-tag
ratón transgénico
además, examinó la infección preferencial de las células tumorales de ovario por pseudovirions VPH en el
MISIIR-etiqueta
ratón transgénico, un modelo murino de tumor de ovario de aparición espontánea. Este ratón transgénico, que expresa la región de transformación del SV40 bajo el control del promotor de Müller inhibidora sustancia de tipo II del gen del receptor, se ha demostrado que el desarrollo de los tumores de ovario bilaterales. Por lo tanto, el modelo de cáncer de ovario espontánea en
MISIIR-Tag
ratones transgénicos se asemeja más a cáncer de ovario humano que un modelo de trasplante como modelo de tumor MOSEC. El
MISIIR-etiqueta
ratón transgénico ha informado de desarrollar carcinoma de ovario de forma espontánea dentro de 6-13 semanas de vida [10]. En nuestro laboratorio, todos los
MISIIR-etiqueta
ratones transgénicos (de una nueva línea adquirida por el Dr. Connolly) desarrollaron tumores de ovario en los 4 meses siguientes al nacimiento. Inyectamos el VPH-16 /luc PSV 10 semanas después del nacimiento y se encontró que el VPH-16 /Luc PSV podría también infectan preferentemente el cáncer de ovario se producen de forma espontánea en el
MISIIR-etiqueta
ratones transgénicos (Fig. 3). Además, se observó que los órganos vitales, incluyendo los pulmones, el corazón, el estómago, el bazo y el riñón no estaban infectadas. Además, no se observó actividad de la luciferasa en los ovarios normales de ratones C57BL /6 inyectados con VPH-16 /luc PSV. Por lo tanto, nuestros datos indican que el VPH-16 pseudovirions pueden infectar selectivamente las células tumorales de ovario en un modelo de tumor de ovario de murino espontáneo.
La infección de HPV-16 pseudovirions que lleva el gen HSV-tk seguido de tratamiento con Ganciclovir Conduce a
in vitro
citotoxicidad de las células infectadas
la infección preferencial de VPH-16 pseudovirions en las células tumorales de ovario permite la oportunidad de realizar específicamente ADN terapéutico a las células tumorales de ovario para el control de los tumores ováricos. Debido a que la administración inicial de pseudovirions VPH puede no ser capaz de infectar a todas las células de tumor de ovario, es importante tener en cuenta una estrategia que permite a las células tumorales de ovario no directamente infectadas también se vuelven susceptibles. Por lo tanto, se optó por el sistema HSV-tk /ganciclovir, ya que es el sistema de terapia génica suicida más ampliamente estudiado y más de dos décadas de intentos de utilizar el sistema como una terapia contra el cáncer ha demostrado éxito variable. Para demostrar si PSV VPH-16 /HSV-tk puede infectar las células tumorales de ovario y hacerlos susceptibles a la destrucción por el tratamiento con ganciclovir, se infectaron células MOSEC-Luc con HPV16-GFP o PSV PSV HPV16 /HSV-tk durante 48 horas. Las células infectadas se trataron posteriormente con diferentes concentraciones de ganciclovir y la expresión de la luciferasa de las células infectadas se midió usando el sistema IVIS 200. Como se muestra en la Figura 4, las células tumorales MOSEC-Luc infectadas con pSV HPV-16 /HSV-tk seguido de tratamiento con ganciclovir condujeron a la muerte celular de las células infectadas
in vitro.
Esto no se observó en las células infectadas con el VPH-16 /GFP. También se observó que las concentraciones más altas de ganciclovir dieron lugar a más muerte celular. Se observaron efectos similares cuando se llevaron a cabo ensayos similares con la línea celular de cáncer de ovario humano ES2 (ver Figura S3).
inyección intraperitoneal de VPH-16 pseudovirions que lleva el gen HSV-tk seguido de tratamiento con ganciclovir Conduce a Significativo efectos antitumorales en murino portadores de cáncer de ovario ratones
determina además si los ratones portadores de tumores MOSEC infectadas con VPH-16 PSV /HSV-tk seguido de tratamiento con ganciclovir podrían mostrar efectos antitumorales terapéuticas. Los ratones fueron inyectados con células tumorales MOSEC-Luc y luego tratados con el VPH-16 /HSV-tk PSV o VPH-16 /GFP PSV utilizando régimen como se describe en la Figura 5. Los ratones se trataron posteriormente con el crecimiento ganciclovir y el tumor se controló usando un sistema de imágenes de luminiscencia. Como se muestra en la Figura 5, los ratones portadores de tumor tratados con pSV HPV-16 /HSV-tk seguido de tratamiento con ganciclovir exhibió significativamente los efectos antitumorales mejor terapéuticos que los ratones tratados con el VPH-16 /GFP PSV seguido por tratamiento con ganciclovir. Estos datos indican HPV-16 pseudovirión se puede utilizar para suministrar eficazmente el gen HSV-tk a las células de tumor de ovario para hacer que las células tumorales de ovario más susceptibles al tratamiento con ganciclovir.
C57BL /6 ratones (5 por grupo) se intraperitonealmente inyectados con 1 x 10
6 células MOSEC-Luc por ratón en el día 1. la actividad de luciferasa se examinó en día 2 como indicación de número de tumores en los ratones. Se inyectaron ratones HPV16-GFP PSV (proteína L1 20 g) o PSV HPV16 /HSV-tk en una dosis de la proteína L1 (20 g /ratón) en el día 3. Los ratones se trataron diariamente con ganciclovir a dosis de 50 mg /kg o PBS desde el día 5 al día 18. Los ratones fueron imágenes de luminiscencia por técnicas de imagen no invasivas en el día 20. Los datos expuestos son representativos de 2 experimentos realizados.
Discusión
El éxito el empleo del gen HSV-tk para la terapia génica del cáncer de ovario usando pseudovirions VPH sugiere que otros genes candidatos adecuados también pueden ser entregados por pseudovirión HPV para los tumores de ovario para la terapia génica del cáncer de ovario. Se han descrito varios genes candidatos para combinaciones de enzima-profármaco para terapia génica suicida incluyendo citosina desaminasa [18], [19], nitrorreductasa [20], la carboxilesterasa [21], el citocromo P450 [22] y purina nucleósido fosforilasa [23]. Al igual que el HSV-tk, las enzimas codificadas por estos genes pueden convertir los profármacos no tóxicos en fármacos capaces de bloquear la síntesis de ADN, lo que resulta en la muerte celular eventual, así como efectos espectador para matar las células tumorales vecinas adicionales.
En el futuro clínica traducción, será importante tener en cuenta las preocupaciones de seguridad tanto del sistema HSV-tk /GCV y el vehículo de entrega. Sin embargo, la terapia génica del cáncer utilizando HSV-tk se ha utilizado ampliamente. Muchos ensayos clínicos que utilizan este enfoque han llevado a cabo en pacientes con gliomas y no se informaron eventos adversos graves (para revisión ver [24], [25]). Por otro lado, la producción de la pseudovirión VPH como vehículos de administración de ADN probablemente requerirá de futuras medidas para mejorar su perfil de seguridad. La línea celular de corriente utilizada para generar los pseudovirions contiene SV40 gran antígeno T, que es una oncoproteína, y por lo tanto plantea algunas posibles problemas de seguridad. Un enfoque alternativo utilizando levadura para producir pseudovirions se ha descrito [26]. La producción en masa de pseudovirions VPH también es probable que requieren protocolos estandarizados eficientes para generar grandes títulos de pseudovirions VPH infecciosas para la traducción clínica.
En el presente estudio, hemos demostrado la infección preferencial de tumores murinos y humanos de ovario por el VPH-16 pseudovirión. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos de Roberts et al. utilizando un modelo de ratón desnudo para la difusión peritoneal de línea celular de cáncer de ovario humano, SHIN3 [27]. También encontraron que pseudovirión VPH administrado por vía intraperitoneal tejidos tumorales de ovario infectados con alta especificidad, mientras que saltarse las superficies de los tejidos peritoneales normales. Sin embargo, diferentes tipos de HPV pseudovirión pueden demostrar diferentes tropismos de tumores y /o tejidos. Por ejemplo, Cerio et al, han demostrado que un HPV-16, pero no el VPH-45, pseudovirus podría infectar las células tumorales de ovario humano SWA-G
in vitro
[28]. Sus datos sugieren que la infección por pseudovirus de tumores humanos puede ser de tipo VPH y específico de tumor. Por lo tanto, es importante identificar aún más los tipos adecuados de pseudovirión VPH para una futura terapia génica del cáncer.
Los mecanismos para la infección preferencial de las células tumorales de ovario por pseudovirions VPH siguen sin estar claros. En nuestro estudio, hemos demostrado que una L2 intacta es esencial para la capacidad de infección de VPH-16 pseudovirión en tumores de ovario (ver Figura 2). HPV entrada a las células diana se ha demostrado que ser iniciado por primera unión a factores de unión de la superficie celular de heparina proteoglicano sulfonado (HSPG). Las partículas virales de VPH a continuación, se someten a un cambio conformacional que expone el N-terminal de la proteína L2 de la cápside menor a furina división [29], [30]. La proteólisis de L2 expone una superficie previamente ocluida de L1 que se une a un no determinado receptor de la superficie celular en las células, que se cree que es responsable para la internalización de partículas (para revisión ver [31]). También se ha demostrado que la mayoría de líneas celulares de cáncer de ovario upregulate expresión de furina [32]. Por lo tanto, es concebible que la regulación al alza de la expresión de furina puede contribuir a la infección preferencial del tumor de ovario por pseudovirions VPH. También podemos excluir la posibilidad de que la infección preferencial es un artefacto de pases células del tumor
in vitro
ya que se observó la infección preferencial en el modelo de tumor de ovario de aparición espontánea (ver Figura 3). Será importante para caracterizar mejor los mecanismos de la infección preferencial de las células tumorales de ovario por pseudovirions VPH. Esta información será útil para mejorar la entrega específica de gen de interés a las células tumorales de ovario utilizando pseudovirions VPH
En resumen., Se encontró que la inyección intraperitoneal de HPV-16 pseudovirions conduce a la infección preferencial de murino y humano de ovario células de cáncer en ratones portadores de tumores. Por otra parte, la terapia génica contra el cáncer utilizando pseudovirions VPH que llevan HSV-tk era capaz de dirigirse específicamente a los tumores de ovario, dando como resultado efectos antitumorales terapéuticas potentes contra los tumores de ovario. Será importante para identificar mejor los candidatos de terapia génica más adecuadas y los regímenes terapéuticos para futuros estudios hacia la traducción clínica.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Caracterización de la infección de las células tumorales MOSEC por el VPH-16 pseudovirions
in vitro
. células MOSEC se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo la noche antes de la infección. Las células sembradas se MOSEC infectadas con VPH-16 /Luc PSV (1 mg de proteína L1 /ml) durante 72 horas y la expresión de la luciferasa fue examinado por el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). imágenes de luminiscencia de línea celular de cáncer de ovario MOSEC (arriba). gráfico de barras que representa el recuento total de fotones para cada pozo (abajo). Nota: VPH-16 pseudovirions pueden infectar eficazmente el cáncer de ovario MOSEC ratón
in vitro
. Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Caracterización de la infección de las células de cáncer de ovario humano ES2 por el VPH-16 pseudovirions
in vitro
. células tumorales de ovario humano ES2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células /pocillo la noche antes de la infección. Las células sembradas se ES2 infectadas con VPH-16 /Luc PSV (1 g L1 de proteína /ml) durante 72 horas y la expresión de luciferasa se examinó por IVIS 200 del sistema (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). imágenes de luminiscencia de línea celular de cáncer de ovario ES2 (arriba). gráfico de barras que representa el recuento total de fotones para cada pozo (abajo). Nota: VPH-16 pseudovirions pueden infectar eficazmente el cáncer de ovario humano ES2 in vitro. Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
in vitro
citotoxicidad mediada por pseudovirions HPV16-tk y ganciclovir. células ES2-Luc se infectaron HPV16-GFP o PSV PSV HPV16 /HSV-tk a una concentración de 1 mg proteína L1 /ml durante 48 horas. Las células infectadas se sembraron en placas de 96 pocillos y luego tratados con 0 mg /ml, 0,1 g /ml, 1 mg /ml, o 10 mg /ml de ganciclovir durante 72 horas. La expresión de luciferasa fue examinado por el sistema IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, EE.UU.). Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos realizados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s003 gratis (TIF)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Katherine Liu ( JHMI) para la preparación del manuscrito.