Extracto
El gen p53 está mutado en más de 50% de los tumores humanos. p53 mutante ejerce una función oncogénica y es a menudo altamente expresado en células cancerosas debido a la evasión de la degradación del proteasoma dependiente. Por lo tanto, la reactivación de la degradación del proteasoma dependiente de la proteína p53 mutante es una estrategia atractiva para el tratamiento del cáncer. Anteriormente, hemos encontrado que el trióxido de arsénico (ATO), un medicamento para la leucemia promielocítica aguda, degrada la proteína p53 mutante a través de una vía del proteasoma. Sin embargo, no queda claro cuál es la ligasa E3 que se dirige a p53 mutante para la degradación. En el estudio actual, hemos tratado de identificar una ligasa E3 necesaria para la degradación mediada por ATO de p53 mutante. Se encontró que ATO induce la expresión de Pirh2 E3 ligasa en el nivel transcripcional. También se encontró que inhibe la caída de Pirh2, mientras que la expresión ectópica de Pirh2 mejora, la degradación de la proteína p53 mutante ATO-inducida. Además, hemos encontrado que Pirh2 E3 ligasa interacciona físicamente con y se dirige a p53 mutante para polyubiquitination y la degradación proteasomal posteriormente. Curiosamente, se encontró que ATO coopera con HSP90 o inhibidor de HDAC para promover la degradación mutante p53 y supresión del crecimiento en células tumorales. En conjunto, estos datos sugieren que la ATO promueve la degradación de p53 mutante, en parte, a través de la inducción de la vía del proteasoma dependiente Pirh2
Visto:. Yan W, Jung YS, Zhang Y, Chen X (2014) trióxido de arsénico Reactiva Proteasome- dependiente de la degradación de la proteína p53 mutante en células de cáncer a través de la parte mayor expresión de Pirh2 E3 ligasa. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10.1371 /journal.pone.0103497
Editor: Yi Li, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de abril de 2014; Aceptado: 3 Julio 2014; Publicado: 12 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud de subvención CA 121137 y CA 076069. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y el análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
mutaciones de sentido erróneo de la p53 gen, agrupados principalmente dentro del dominio de unión a ADN de núcleo, se producen en una gran fracción de tumores humanos [1]. Estas mutaciones producen p53 proteínas con una alteración de la actividad de unión al ADN específica de secuencia, que no pueden inducir una serie de genes diana de p53 de tipo salvaje para la supresión de tumores [2]. Además, las proteínas mutantes de p53 se encuentra que tienen actividades oncogénicas, definida como ganancia de función (GOF) [3], [4].
Los efectos de p53 mutante en el desarrollo y progresión del tumor son de largo alcance. En comparación con los ratones p53 null, p53 mutante knock-in ratones muestran significativamente diferentes espectros de tumor y alta incidencia de la metástasis del tumor [5] - [7]. Lo más importante, los estudios clínicos han demostrado que un alto nivel de p53 mutante se correlaciona con tumores más agresivos y los resultados más pobres [8] - [10]. Por otra parte, p53 mutante es clínicamente significativa porque su expresión hace que las células resistentes a los fármacos quimioterapéuticos [11], [12]. Al parecer, la ganancia de la función de p53 mutante depende en parte de su actividad transcripcional [5], [13] - [18], y su actividad dominante negativa hacia la familia p53 [19] - [23].
a diferencia de p53 de tipo salvaje, se encuentra la proteína p53 mutante para evadir proteasoma dependiente de la degradación de [24] - [28], lo que lleva a su hyperstabilization en tumores [29]. Varios mecanismos pueden causar la proteína p53 mutante para evadir la degradación del proteasoma dependiente. Una posibilidad es que el estrés asociado a tumores puede provocar la interacción de p53 mutante con proteínas chaperonas, tales como HSP70 y HSP90, que inactiva E3 ligasas MDM2 y CHIP y por consiguiente estabiliza p53 mutante [24] - [27]. De hecho, la inhibición de la expresión o actividad de HSP90 libera MDM2 y CHIP para degradar p53 mutante [26], [30]. Otra posibilidad es que p53 mutante es capaz de formar agregados de amiloide en los tumores, que son resistentes a la degradación proteasomal [27], [31]. La capacidad de estabilización de p53 mutante presenta un enigma fundamental en la intervención terapéutica para pacientes con cáncer con un p53 mutante. Por lo tanto, la reactivación efectiva de la degradación de proteasoma dependiente de p53 mutante en células de cáncer tiene un significado terapéutico.
Recientemente, hemos encontrado que los objetivos de arsénico p53 mutante para la degradación, que conduce a la supresión del crecimiento en células de tumores sólidos [32] . El arsénico es un metaloide con una eficacia sustancial y efectos moderadamente adversos en pacientes con leucemia promielocítica aguda, mieloma, y los síndromes mielodisplásicos [33]. Curiosamente, encontramos que el arsénico induce la expresión de p53 de tipo salvaje, TAp73, y TAp63 en células tumorales [32], [34]. Estas actividades de arsénico proporcionan una estrategia para la disminución de la función de p53 mutante dominante negativo y otras actividades GOF. Aunque arsénico disminuye la estabilidad de la proteína p53 mutante a través de una vía del proteasoma [32], la ligasa E3 que se dirige a p53 mutante para la degradación sigue siendo desconocido. En este estudio, vamos a abordar esta cuestión para facilitar el desarrollo de trióxido de arsénico (ATO) como un medicamento contra el cáncer potencial para controlar los tumores con p53 mutante.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular
línea celular de cáncer de páncreas humano MIA Paca-2 (que contiene mutante R248W) y la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT (que contiene mutante H179Y /R282W) se cultivaron como se ha descrito previamente [35].
Los plásmidos y siRNA
humano de longitud completa Pirh2, se utilizaron Pirh2-DN (una ligasa E3 mutante defectuoso), y Pirh2-ΔRING (el dedo anular de supresión de dominio mutante) como se ha descrito anteriormente [36]. Todas las proteínas se Pirh2 marcado con FLAG en el extremo N-terminal. Se utilizó el vector de expresión de la ubiquitina marcada con FLAG en pcDNA3 como se describe anteriormente [36].
Dos pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) contra Pirh2, 5'-CAU GCC CAA CAG ACU UGÚ G dTdT-3 'y 5' -GGA AGU GCA GUG CAU AAA C dTdT-3 ', y dos revueltos siRNAs, 5'-ACG GUG UCU CCA UGE ACU Un dTdT-3' y 5'-GGC CGA UUG UCA UCA UCA T dTdT-3 ', se compraron Tecnologías de Dharmacon RNAi. Los siRNAs se transfectaron en células utilizando SilentFect (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron en los tiempos indicados después de la transfección para experimentos adicionales.
Los anticuerpos
conejo anti-p53 (FL-393) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology Inc. policlonal de conejo anti-Pirh2 se adquirió de Bethyl Laboratories Inc. ratón monoclonal anti-FLAG M2 y conejo anti-actina fueron adquiridos de Sigma.
transcripción inversa PCR ensayo
ARN total fue aislado de las células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). Se sintetizó ADNc usando un kit de síntesis de ADNc iScript ™ (Bio-Rad). Para medir Pirh2 mRNA, RT-PCR se realizó con el cebador directo 5'-3 'y CTGCGAGCACTATGACAGAG-cebador inverso 5'-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3'. Actina se amplificó con el cebador directo 5'-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 'y el cebador inverso 5'-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3'.
inhibición proteosoma ensayo
Las células fueron sembradas durante 24 h, no tratadas o tratadas previamente con inhibidor del proteasoma MG132 (4 M) durante 2 h, y después se trató con ATO por 6 h.
inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western
El experimento de inmunoprecipitación se llevó a cabo como se describe anteriormente [37]. Brevemente, HaCaT y las células MIA PaCa-2 fueron tratados con ATO 5 o 7,5 M durante 6 h. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% Nonidet P-40, y PMSF 0,4 mM), se sonicó, y se clarificaron por centrifugación . Los lisados celulares (500 mg de proteínas totales) se incubaron durante 4 horas a 4 ° C con los anticuerpos indicados acoplados a las perlas de proteína A-agarosa (Sigma) y después se lavó con tampón de lisis. complejos de proteínas inmunoprecipitadas y lisados de células enteras se sometieron a SDS-PAGE. Para cada conjunto, 5% de lisado de células enteras se usó como un control de entrada. anticuerpo IgG se utilizó como control negativo. Las inmunotransferencias se visualizaron mediante reactivos de detección de quimioluminiscencia SuperSignal West Femto (Pierce).
GST preparación de proteína de fusión
El glutatión S-transferasa (GST)-etiquetados Pirh2, Pirh2-ΔRING, o Pirh2-DN fue expresado por pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). Las proteínas marcada con GST recombinantes se purificaron como se describe anteriormente [37]. Brevemente, las fusiones de GST de Pirh2, Pirh2-ΔRING, y Pirh2-DN se expresaron en E. coli BL21 (DE3) (Novagene) tras la inducción con IPTG 0,5 mM durante 4 horas a 37 ° C. se recogieron las células bacterianas y después se resuspendieron en tampón GST de lisis (200 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 M NaCl, EDTA 100 mM, 0,1% de Triton X-100, y PMSF 0,4 mM). Posteriormente, los lisados celulares se sometieron a ultrasonidos y se clarificaron por centrifugación. proteínas de fusión GST se purificaron usando perlas de glutatión-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
ensayo
p53 ubiquitinación
35S marcado con p53 de tipo salvaje o mutantes de p53 ( proteínas R175H y R273H) se sintetizaron mediante transcripción y traducción in vitro utilizando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado TNT T7 (Promega). 5 l (~ 2 × 10
4 cpm) de p53 traducida in vitro se añadieron a GST-Pirh2 (2 g) y se mezcló en hielo durante 1 h para formar complejos de GST-Pirh2-p53. Los complejos se añaden a tampón de ubiquitinación (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, ATP 2 mM, MgCl 5, DTT 2 mM, y 1 solución de regeneración × energía
2 (ERS)), que contienen E1 (100 ng) , E2 (200 ng), y ubiquitina (2 g), y se incubaron a 30 ° C durante 2 h. Por último, las mezclas de reacción se separaron en SDS-PAGE y se analizaron por autorradiografía. E1, E2, ERS, y ubiquitina se adquirieron de Boston Biochem.
Estadísticas
dos comparaciones de grupos se analizaron por
t
de Student de dos caras.
se calcularon los valores p
, y
p
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
El trióxido de arsénico se degrada la proteína p53 mutante a través del proteasoma dependiente vía
es bien sabido que en las células tumorales, hyperstabilization de la proteína p53 mutante se atribuye a la evasión de proteasoma dependiente de la degradación de [24] - [27], [31], [38]. Por lo tanto, la reactivación de la degradación del proteasoma dependiente de p53 mutante en las células tumorales tiene un significado terapéutico. Anteriormente, hemos encontrado que ATO disminuye la estabilidad de la proteína p53 mutante a través de una vía del proteasoma [32]. Lo más importante es que demostramos que desmontables de p53 mutante endógena sensibiliza, mientras que la expresión ectópica de p53 mutante desensibiliza, las células tumorales para el tratamiento de arsénico [32]. Consistentemente, otro estudio demostró que la degradación inducida por el arsénico de p53 mutante inhibe la proliferación de las células p53R273H que expresan de una manera dependiente de la dosis [39]. Sin embargo, no queda claro lo que ligasa E3 es responsable de la degradación de p53 mutante inducida por el arsénico. Para probar esto, se confirmó que la degradación inducida por el arsénico de p53 mutante es a través de la vía de proteasoma dependiente. Para este propósito, las células HaCaT se trataron o se trataron con 4 M MG132, un inhibidor de la proteasoma 26S, en ausencia o presencia de ATO. Se encontró que la degradación de p53 mutante inducida por el arsénico se abolió por completo por MG132 (fig. 1A). Del mismo modo, se encontró que la degradación inducida por el arsénico de la proteína p53 mutante fue inhibida por MG132 en las células MIA PaCa2 (Fig. 1B). Además, se encontró que, a diferencia del efecto de la vía del proteasoma en la proteína p53 de tipo salvaje [40], la inhibición de la vía del proteasoma sola era incapaz de incrementar el nivel de proteína p53 mutante (Fig. 1A-B), en consonancia con un informe anterior [41]. En conjunto, estos resultados confirmaron que el arsénico se reactiva la degradación de proteasoma dependiente de p53 mutante en células tumorales.
transferencias de Western se prepararon con extractos de HaCaT (A) y las células MIA PaCa-2 (B), que eran sin tratar o pretratados con 4 M MG132 durante 2 h, y luego tratada o tratada con ATO durante 6 h.
El trióxido de arsénico se degrada la proteína p53 mutante a través de la inducción de la Pirh2 E3 ligasa
Anteriormente, se encontró que el arsénico induce la expresión de Pirh2 E3 ligasa para degradar la proteína oncogénica ΔNp63, un miembro de la familia p53 [34]. Pirh2 es conocido por ser una ligasa E3 focalización proteína p53 de tipo salvaje para la degradación [42], [43]. Por lo tanto, hemos explorado si ATO induce la expresión de Pirh2 en las células tumorales que portan un p53 mutante. Se encontró que el tratamiento con ATO, el nivel de transcritos de Pirh2 fue significativamente mayor en MIA PaCa-2 y células HaCaT (Fig. 2A), de forma concomitante con un aumento de la proteína Pirh2 (Fig. 2B). Estos datos sugirieron que la OAM puede inducir la expresión de transcripcionalmente Pirh2 para degradar p53 mutante en las células tumorales.
(A) El nivel de Pirh2 transcripción se incrementa en ATO. análisis de RT-PCR se realizó con ARN total aislado de las células MIA PaCa-2 y HaCaT no tratados o tratados con ATO 7,5 M durante 2-6 h. Actina mRNA fue amplificado como control de carga. (B) Las transferencias Western se prepararon con extractos de células MIA Paca-2 y HaCaT tratados o tratados como en (A), y luego probaron con anticuerpos contra Pirh2 y actina, respectivamente.
A continuación, examinó si la expresión ectópica de Pirh2 aumenta la degradación inducida por el arsénico de la proteína p53 mutante. Se encontró que la expresión ectópica de Pirh2 o ATO tratamiento solo disminuyó significativamente el nivel de p53 mutante en HaCaT y PaCa-2 células MIA (Fig. 3A-B). Lo más importante, hemos encontrado que una combinación de la expresión ectópica de tratamiento Pirh2 y ATO se redujo aún más el nivel de p53 mutante (Fig. 3A-B). Estos datos sugirieron que p53 mutante puede ser degradado por Pirh2 E3 ligasa, y la actividad de Pirh2 se puede mejorar mediante el tratamiento ATO a través de mecanismos desconocidos.
(A-B) transferencias de Western se prepararon con extractos de HaCaT (A ) y MIA PaCa-2 (B) las células, que fueron transfectadas con pcDNA3 o pcDNA3-FLAG-Pirh2 durante 24 h, y después se trató con 5 o 7,5 M ATO por 6 h. Las transferencias fueron luego probaron con anticuerpos contra la etiqueta FLAG, p53, y la actina, respectivamente. (C) Representación esquemática de la proteína Pirh2 junto con las ubicaciones de los Finger y el anillo de dominios de Zn, dos mutaciones por sustitución C145S y C148S en el dominio RING (Pirh2-DN), y la supresión del dominio RING en Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (D-E) La expresión ectópica de Pirh2-DN-Pirh2 ΔRING tiene poco o ningún efecto sobre el nivel de p53 mutante. transferencias de Western se prepararon con extractos de HaCaT (D) y las células MIA PaCa-2 (E), que fueron transfectadas con pcDNA3, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING, o pcDNA3-FLAG-Pirh2 para 24 h. Las transferencias fueron luego probaron con anticuerpos contra FLAG etiquetados Pirh2, p53, y la actina, respectivamente.
Se sabe que Pirh2 requiere su dominio RING a ubiquitinate p53 de tipo salvaje para la degradación proteasomal [44]. Para determinar si se requiere la actividad ligasa E3 de Pirh2 para la regulación de la expresión de p53 mutante, dos mutantes Pirh2 bandera de etiquetado, Pirh2-ΔRING (sin el dominio de dedo anular) y Pirh2-DN (que contiene dos mutaciones C145S de sustitución y C148S en el dominio RING), se utilizaron (Fig. 3C). Hemos demostrado que, en contraste con el tipo salvaje Pirh2, la expresión ectópica de Pirh2-ΔRING o Pirh2-DN fue incapaz de disminuir el nivel de la proteína p53 mutante en HaCaT y MIA Paca-2 células (Fig. 3D-E).
a fin de examinar si endógena Pirh2 media la degradación inducida por el arsénico de la proteína p53 mutante, las células HaCaT y MIA Paca-2 fueron transfectadas transitoriamente con un revueltos siRNA (SCR-1 y -2) o un siRNA contra Pirh2 (siPirh2-1 y -2) durante 3 días, y luego tratados mock-o tratados con ATO. Hemos demostrado que el nivel de Pirh2 se redujo significativamente por Pirh2, pero no revueltos, siRNAs (Fig. 4A-B). Es importante el descubrimiento de que Pirh2 caída fue capaz de rescatar a la degradación inducida por el arsénico de p53 mutante (Fig. 4A-B). También observamos que el tratamiento de arsénico aumenta la expresión Pirh2, de forma concomitante con una disminución en la expresión de p53 mutante (Fig. 4A-B).
Las transferencias Western fueron preparados con extractos de HaCaT (A) y MIA Paca-2 (B células), que se transfectaron con revueltos siRNA#1 (SCR-1) (carriles 1-2), Scr-2 (carriles 5-6), siRNA contra Pirh2-1 (siPirh2-1) (carriles 3-4), o siPirh2-2 (carriles 7-8), y después se trató con ATO por 6 h. Las transferencias fueron luego probaron con anticuerpos contra Pirh2, p53, y la actina, respectivamente.
Pirh2 interacciona físicamente con la proteína p53 mutante para polyubiquitination
Como E3 ligasa menudo interacciona físicamente con sus sustratos , se examinó si Pirh2 asocia físicamente con p53 mutante. Para probar esto, HaCaT y las células MIA PaCa-2 fueron tratados con ATO durante 6 h, y luego p53 mutante endógeno y Pirh2 en las células se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra p53 y Pirh2, respectivamente. Demostramos que endógena Pirh2 se detectó en inmunocomplejos p53 mutante (Fig. 5A). Además, se detectó p53 mutante en inmunocomplejos Pirh2 (Fig. 5B). IgG se utilizó como control negativo durante la inmunoprecipitación e incapaz de inmunoprecipitación de p53 mutante o Pirh2 (Fig. 5A-B).
HaCaT y MIA PaCa-2 células (A) se trataron con 5 o 7,5 M ATO para 6 h. Los extractos celulares de HaCaT (izquierda) y MIA Paca-2 (derecha), las células se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-p53 o IgG de control. Los inmunocomplejos se utilizaron luego para detectar p53 mutante y Pirh2 junto con lisados de células enteras como el control de entrada. (B) El experimento se realizó como se describe en (A), excepto que el anticuerpo anti-Pirh2 se utilizó en la inmunoprecipitación. (C-E) sintetizado in vitro
35S marcado con p53 de tipo salvaje (C), R175H (D), y R273H (E) se mezclaron con GST, GST-etiquetados Pirh2, Pirh2-DN, o Pirh2-ΔRING . Los complejos se mezclaron luego con un tampón que contiene E1, E2 (UbcH5b), y Ub y después se incubaron a 30 ° C durante 2 h. p53 ubiquitina se analizó mediante SDS-PAGE y se detecta por autorradiografía. (F) Un modelo de la degradación mediada por Pirh2 de mutantes de p53 inducida por ATO.
A continuación, se investigó si Pirh2 sirve como una ligasa E3 para la ubiquitinación de p53 mutante. Para probar esto, en el ensayo de ubiquitinación in vitro se realizó con p53R175H mutante
35S marcada con o p53R273H junto con recombinante GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN, o Pirh2-ΔRING. Demostramos que p53s mutantes se polyubiquitinated por Pirh2 pero no por Pirh2-DN y Pirh2-ΔRING (Fig. 5D-E, comparar carril 3 con los carriles 4 y 5). Desde p53 de tipo salvaje es una diana conocida de Pirh2, p53 de tipo salvaje se utilizó como control positivo. Del mismo modo, hemos demostrado que p53 de tipo salvaje fue polyubiquitinated por Pirh2 pero no por Pirh2-DN y Pirh2-ΔRING (Fig. 5C, comparar el carril 3 con las calles 4 y 5). En conjunto, estos datos demuestran que Pirh2 es capaz de polyubiquitinating p53 mutante.
El trióxido de arsénico coopera con HSP90 o inhibidor de HDAC para promover la degradación de p53 mutante y la supresión del crecimiento en las células tumorales
Estudios anteriores mostraron que en las células tumorales, la proteína chaperona HSP90 interactúa con p53 mutante para formar el complejo MDM2-p53-HSP90 y por consiguiente estabiliza p53 mutante [24], [26], [45]. Por consiguiente, los inhibidores de HSP90 geldanamicina y 17AAG interrumpen MDM2-p53-HSP90 complejo para degradar mutante p53 [26], [30], [45]. Además, SAHA, un inhibidor de HDAC, se encontró que disminuir la expresión de p53 mutante a través de la inhibición de la HDAC8 mediada por p53 mutante transcripción [46] y p53 mutante estabilidad de la proteína HDAC6 mediada [30]. Para estudiar más a fondo si los inhibidores de HSP90 y HDACs son capaces de inducir la expresión Pirh2 para degradar p53 mutante, HaCaT y las células MIA PaCa-2 fueron tratados con 17AAG o SAHA. Hemos demostrado que 17AAG o tratamiento SAHA tenían poco o ningún efecto sobre la expresión de la proteína Pirh2 en HaCaT (Fig. 6A) y las células MIA PaCa-2 (Fig. 6B). El resultado sugiere que ATO y los inhibidores de HSP90 y HDACs pueden degradar la proteína p53 mutante a través de diferentes vías. Por lo tanto, la hipótesis de que ATO podrá cooperar con HSP90 o inhibidor de HDAC para promover la degradación mutante p53 y supresión del crecimiento en células tumorales. Para probar esto, HaCaT y las células MIA PaCa-2 fueron tratados con ATO, 17AAG, o SAHA, solo o en combinación. Se encontró que la proteína p53 mutante se redujo notablemente por ATO, 17AAG, o SAHA y, además, se redujo en combinación de ATO con 17AAG o SAHA (Fig. 6C-D). Consistentemente, se encontró que la proliferación de HaCaT (Fig. 6E) y MIA PaCa-2 células (Fig. 6F) se inhibió significativamente por ATO, 17AAG, o SAHA, e inhibió adicionalmente por combinación de ATO con 17AAG o SAHA. Estos datos sugieren que la combinación de ATO con otros agentes anti-cáncer, tales como los inhibidores de HSP90 y HDACs, podría lograr terapias sinérgicas para los tumores que albergan un p53 mutante.
(A-B) transferencias de Western se prepararon con extractos de HaCaT (a) y las células MIA PaCa-2 (B), que eran sin tratar o tratados con 17AAG 1 M o 2 M SAHA para 12 h. Las transferencias fueron luego probaron con anticuerpos contra Pirh2 y actina, respectivamente. (C-D) transferencias de Western se prepararon con extractos de HaCaT (C) y las células MIA PaCa-2 (D), que eran sin tratar o tratados con 7,5 M ATO, 1 M 17AAG o 2 M SAHA, solo o en combinación para 12 marido. Las transferencias fueron luego probaron con anticuerpos contra p53 y actina, respectivamente. células (E-F) HaCaT (E) y MIA PaCa-2 (F) se trataron como en (C-D) para 24 h. Las células supervivientes de ambos grupos tratados y de control se contaron y se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *,
p
. & Lt; 0,05
Discusión
En condiciones normales, de tipo salvaje de p53 se expresa en niveles bajos debido a la degradación mediada por múltiples ligasas E3 , incluyendo MDM2, Pirh2, CP 1, ARF-BP1 y WWP1 [43]. Por el contrario, p53 mutante a menudo se acumula a niveles altos en células tumorales, aunque su expresión en tejidos normales también se mantiene en niveles bajos a través de la acción de MDM2 [28]. El hyperstabilization específico de tumor de p53 mutante es un determinante crítico de su GOF. De hecho, el silenciamiento de p53 mutante por siRNA inhibe la proliferación de células tumorales humanas [16], [47]. Por lo tanto, la orientación p53 mutante para la degradación proporciona una base para las estrategias anticáncer atractivos para atenuar la proliferación de células cancerosas. Recientemente, se sugirió que en las células tumorales proliferantes, suprimiendo macroautofagia promueve la cifra de negocios de la proteína p53 mutante a través de la autofagia mediada por chaperonas de una manera dependiente de lisosoma [29]. Desafortunadamente, el requisito de la no proliferación de las células tumorales condicional limita el potencial de la autofagia chaperona mediada para la aplicación clínica. Además, en la actualidad las quimioterapias disponibles son incapaces de ozono p53 mutante. Por ejemplo, muchos agentes contra el cáncer de primera línea aumentan tanto de tipo salvaje p53 y p53 mutante y pueden promover la formación y progresión del tumor en los tumores con p53 mutante [28], [48]. Por lo tanto, la estabilización de p53 mutante por los agentes quimioterapéuticos limita paradójicamente la eficacia de estos tratamientos.
Anteriormente, hemos encontrado que ATO, un fármaco preferido clínicamente para la leucemia promielocítica aguda, disminuye la estabilidad de la proteína p53 mutante a través de una vía del proteasoma , y el bloqueo de la vía proteasoma puede aliviar el arsénico inducida mutante degradación de p53 [32], [49]. En este estudio, se encontró que induce la expresión de ATO Pirh2 E3 ligasa. Además, se encontró que inhibe desmontables de Pirh2, mientras que la expresión ectópica de Pirh2 mejora, la degradación inducida por el arsénico de la proteína p53 mutante. Nuestro hallazgo sugiere que la expresión inducida por el arsénico de Pirh2 en las células cancerosas reactiva la degradación de p53 mutante proteasoma dependiente (Fig. 5F). Aunque p53 mutante puede ser objetivo de MDM2 en las células normales, MDM2 no puede polyubiquitinate p53 mutante en las células del cáncer [28]. Este defecto es debido probablemente a un aumento de los niveles de HSP70 y HSP90 en células de cáncer, que forman complejos con la proteína p53 mutante [24] - [26], [45]. Además, la sobre-expresado MDM2 isoforma B en las células cancerosas puede interactuar con los de larga duración MDM2 e inhibir MDM2 mediada por p53 mutante ubiquitinación [38]. Estas alteraciones dan la oportunidad de dirigirse a los tumores que albergan una p53 mutante. De hecho, encontramos que ATO coopera con 17AAG o SAHA para inhibir la expresión de p53 mutante y la proliferación de células tumorales.
Aunque la expresión ectópica de tratamiento Pirh2 o ATO solo puede disminuir significativamente el nivel de p53 mutante, la combinación de la expresión ectópica de tratamiento Pirh2 y ATO disminuye aún más el nivel de p53 mutante (Fig. 3A-B). Esto implica que la capacidad de Pirh2 E3 ligasa para degradar p53 mutante puede ser mejorada por tratamiento ATO. Una posibilidad puede ser debido a modificaciones postraduccionales inducidas por ATO de p53 mutante y Pirh2. De hecho, se informó de que tras la administración de arsénico en la leucemia promielocítica aguda (APL), la fusión PML-RAR sufre oncoproteína Sumoylation por pequeños modificadores de tipo ubiquitina (SUMO) y luego se someten a RNF4 mediada por la degradación proteasomal [50], [51 ]. La inactivación de Sumoylation bloquea completamente la degradación de la LMP [52]. Por lo tanto, otros estudios para investigar si Pirh2 y /o p53 mutante se modifican por SUMO, que puede ser mejorada mediante el tratamiento de ATO en las células tumorales.