Extracto
metabotrópicos receptores de glutamato 1 (GRM1) de señalización ha sido implicado en los trastornos benignos y malignos, incluyendo el cáncer de próstata (CaP ). Para explorar más a fondo el papel de las alteraciones genéticas de los
GRM1 Hoteles en CaP, que exhibió la totalidad del ser humano
GRM1
gen que codifica incluyendo uniones secuencia, el exón-intrón, y el acompañamiento de las regiones no traducidas (UTRs) para el presencia de mutaciones y polimorfismos de nucleótido único (SNP) en varias líneas celulares y tejidos con CaP-tumorales normales de la misma a partir de los americanos caucásicos (CAS) y los afroamericanos (AA). Se utilizó la secuenciación bidireccional, PCR específica de alelo, y la bioinformática para identificar los cambios genéticos en
GRM1
y para predecir su papel funcional. Una novela mutación sin sentido identificado al C1744T (582 Pro & gt; Ser) la posición de
GRM1
gen en una línea de células AA-CaP primario (E006AA) se predijo para afectar a la estabilidad de las proteínas y sus funciones. Otra nueva mutación identificada en la unión exón-intrón del exón-8 en la línea celular C4-2B dio lugar a la alteración de la
GRM1
sitio donante de empalme. Además, encontramos SNP de sentido erróneo en T2977C (993 Ser & gt; Pro) posición y múltiples mutaciones no codificantes y SNPs en 3'-UTR de
GRM1
de genes en líneas celulares y tejidos con CaP. Estas nuevas mutaciones pueden contribuir a la enfermedad por alteraciones en
GRM1
empalme de genes, la activación del receptor, y la señalización aguas abajo posreceptor
Visto:. Ali S, M Shourideh, Koochekpour S (2014) identificación de nuevos
GRM1
mutaciones y polimorfismos de nucleótido único en el cáncer de próstata líneas celulares y tejidos. PLoS ONE 9 (7): e103204. doi: 10.1371 /journal.pone.0103204
Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2014; Aceptado: 25 Junio 2014; Publicado: 25 Julio, 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por R01MD005824, R21CA183892 y subvenciones R21CA181152 al Dr. Shahriar Koochekpour. El apoyo adicional fue proporcionado por Roswell Park Cancer Institute y el Instituto Nacional del Cáncer de subvención#P30 CA016056. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización de glutamato conduce a la activación de múltiples cascadas de señalización corriente abajo. Estas cascadas de señalización aguas abajo incluyen (i) la activación de canales iónicos activados por ligando (conocida como receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)) y afluencia de Ca
2 + y /o K
+ iones en los sistemas nerviosos central y periférico [ ,,,0],1], (ii) la activación de receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) conocidos como receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y las vías de segundos mensajeros tales como la fosfolipasa C (PLC), phosphoinositide 3 quinasa /retrovirus AK timoma /mTOR (PI3K /AKT /mTOR) [2], y (iii) la activación de vías de transducción de señales de la proteína G-independientes, mitogen activated proteína quinasa (MAPK) y la proteína quinasa C (PKC) /ERK1 /2 vías [3], [4]. Últimos dos cascadas de señalización, PI3K /Akt /mTOR y MAPK /ERK han extensivamente sido implicados en varios cánceres humanos y hacer hincapié en el papel de la señalización del glutamato en la tumorigénesis [4]
mGluRs comprenden una arquitectura característica básica:. Un gran dominio bi-lobulado extracelular amino-terminal (ATD), también conocida como "mosca del venus trampa" con una secuencia específica de 24 aminoácidos para el sitio de unión del glutamato, un dominio rico en cisteína 70 aminoácidos (CRD) requerido para la dimerización después de la activación, seguido por dominio de transmembrana de siete alfa-helicoidal clásico, y un dominio de cola citoplásmica intracelular (CTD) [5]. Varias isoformas de Grupo I mGluRs (mGluR1) se han identificado en función de la longitud del dominio C-terminal [5]. Este dominio C-terminal comprende un motivo rico en prolina Homer1 unión (isoforma a), que implica en intrincadas interacciones proteína-proteína y la formación de complejos con las moléculas de aguas abajo [6]. Truncamiento de CTD conduce a la pérdida de motivo de unión Homer1 en isoformas b-d y por lo tanto afecta a la interacción con otras moléculas de señalización corriente abajo y las vías [5]. La presencia de diferentes isoformas de longitud de
GRM1
genes con diferentes papel en la posterior activación de las vías de señalización corriente abajo, resalte la importancia de los mecanismos de corte y empalme en
GRM1
la función de genes [5].
mGluRs señalización se implicaba inicialmente en la proliferación celular de células de glioma [7] y el desarrollo del melanoma [8] ya sea en
in vitro
o
in vivo
estudios y posteriormente se demostró que este receptor juega un papel crucial en diversos tipos de cáncer [9], [10], [11], [12] función oncogénica de mGluR1 se demostró por la inducción de fenotipo transformado con sobreexpresión de
GRM1
gen en los melanocitos [13] . Del mismo modo, en nuestro estudio anterior, se determinó la expresión de mGluR1 en líneas y tejidos [10] primarios y metastásicos de células de CaP. PCa dependencia crecimiento celular en
GRM1
-signalling También se demostró por el bloqueo de glutamato o el uso de riluzol, como un antagonista de GRM1 o un inhibidor de la liberación de glutamato. El riluzol redujo la células de CaP proliferación, migración, invasión, y la apoptosis inducida como se muestra por el aumento de nivel de expresión de la caspasa-9, -7, -3 troceados, PARP, y fosfo-H2AX
Ser139 [10].
Las mutaciones somáticas se han identificado en diferentes dominios de mGluRs, incluyendo dominio de unión a ligando, un dominio transmembrana y el dominio citosólico en varios tipos de cáncer [4]. mutaciones sin sentido de mGluR identificados en diferentes dominios podrían tener relevancia biológica en los cánceres. De hecho, se ha informado de mutaciones somáticas en los mGluRs para promover el cáncer de mama, melanoma, y el crecimiento de carcinoma de células renales y la progresión
in vivo
[11], [12], [14]. Esseltine y colega [15] estudiaron las consecuencias funcionales de múltiples mutaciones de aminoácidos identificados en diferentes dominios de mGluRs en varios tipos de cáncer incluyendo el adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas, astrocitoma de alto grado, y los cánceres de mama. Estas mutaciones sin sentido en diferentes dominios de mGluRs afectan a la expresión del receptor y proporcionan una ventaja selectiva a diferentes vías de señalización corriente abajo (por ejemplo, PI3K /Akt /mTOR, ERK1 /2 activación) y cambios en la morfología celular.
Existen pocos informes de GRM1 mutaciones y polimorfismos de nucleótido único (SNP) en líneas celulares o tejidos del PCA. Estos estudios se limitan a la secuenciación del exoma y el análisis del transcriptoma. Estos ensayos de alto rendimiento son capaces de identificar uniones intrón-exón o variantes no codificantes y requieren validación experimental de las mutaciones identificadas. Además, estos estudios no incluyen African American (AA) muestras -PCa y líneas celulares para GRM1 mutación o la detección de SNP. Para superar estas limitaciones, seleccionados de longitud completa del gen GRM1 incluyendo todos los exones, uniones exón-intrón, y de acompañamiento no codificante regiones 5 'y 3' no traducidas (UTR) para identificar alteraciones genéticas en varias líneas celulares de CaP y tumoral emparejados -Normal tejidos en los AA y los americanos caucásicos (CAS). Se identificaron nuevas mutaciones y SNPs en el gen GRM1. Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se prevé utilizar herramientas bioinformáticas disponibles en línea.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
Hemos examinado el ADN genómico de diez líneas celulares PCA (PC-3 , E006AA, DU-145, MDA-PCa2b, 22Rv1, LAPC4, VCAP, CWR-R1, LNCaP, C4-2B) y normal de las células epiteliales de la próstata para la detección de mutaciones y polimorfismos en la región de codificación, que flanquean las regiones no traducidas (5'-y 3'-UTR), y las uniones exón-intrón de longitud completa
GRM1
gen.
resistente a la castración (PC-3, DU-145, MDA-PCa2b, VCap, y 22Rv1) y andrógenos estimulada (LNCaP y LAPC4) líneas de células de CaP se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) [16], [17]. Las células normales de la próstata epiteliales (NL-Pr.EC) y líneas celulares C4-2B fueron adquiridos de Clonetics (Bio Whittaker, Walkersville, MD) y UROCOR (Grupo Uroscience, Oklahoma City, OK), respectivamente. E006AA se estableció a partir de un paciente con AA confinado al órgano CaP [16]. línea celular CWR-R1 se ofrece como un regalo del Dr. Elizabeth Wilson (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) [18]. PC-3, las líneas celulares DU-145, y VCAP se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS, 10%) y antibióticos (1%). E006AA, 22Rv1, CWR-R1, C4-2B, y LNCaP líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 con FBS (10%) y antibiótico (1%). línea celular MDA-PCa2b se cultivó en medio definen como se recomienda por el fabricante (ATCC, Manassa, VA). líneas celulares LAPC4 era la cultura en IMDM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico.
Las muestras tumorales y Declaraciones éticas
Para evaluar alteraciones genéticas en
GRM1
gen, se incluyeron un total de 21 muestras de tumor de próstata normales emparejados obtenido a partir de los AA (n = 10) y del CAS (n = 11). Todos los tejidos muestras biológicas se obtuvieron a partir de muestras biológicas instalación central en el Consorcio de Investigación del Cáncer de Luisiana (LCRC), afiliado a la Facultad de Medicina de Tulane y la Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Luisiana Ciencias de la Salud (LSUHSC, Nueva Orleans, LA). formulario de consentimiento escrito previo informado se obtuvo de cada paciente durante la recogida de muestras para el uso de sus muestras en los descubrimientos científicos y el estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional (IRB) de LSUHSC. tejidos tumorales normales de la misma estaban disponibles para los ocho casos (N3-T3; N4-T4; N5-T5; N13-T13; N21-T21; N35-T35; N52-T52; N71-T71) de AC y seis casos (N2 Tu2; N6-T6; N26-T26; N27-T27; N32-T32; N38-T38) de los pacientes con AA
aislamiento de ADN genómico, reacción de polimerasa en cadena, y la secuencia de
GRM1
gene
Los ADN genómicos fueron aislados de tejidos de próstata y líneas celulares utilizando AllPrep DNA /RNA Quigen kit (Qiagen, Valencia, CA). De larga duración
fue seleccionado GRM1
gen (α isoforma) (NM_000838.3) para diseñar los cebadores que cubren todos los exones, uniones exón-intrón, y 5'-y 3'-UTR. Esta transcripción comprende total de nueve exones. Sobre la base de mutaciones y SNPs descubierto en el exón-8 y -9 en líneas celulares de CaP, se seleccionaron estas regiones para su posterior secuenciación en los tejidos de tumores normales de la misma. el diseño de cebadores se realizó utilizando la herramienta de PrimerSelect DNASTAR Lasergene 9 traje de núcleo (DNASTAR, Madison, WI). Un total de 9492 pb se amplificó en dieciséis amplicones incluyendo el 50-100 pb que flanquean la secuencia que abarca el exón-intrónica. Detalles de cebadores (secuencia, la temperatura de fusión, y el tamaño de amplificación) se proporcionan en la Tabla S1. Cada muestra de ADN genómico (en total 25 ng) se amplificó mediante 32 ciclos en 10 l de volumen total de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que contiene cebadores específicos (0,2 M), dNTPs (0,2 mM), MgCl2 (1,5 mM); GoTaq ADN polimerasa (0,75 U) en 1x tampón de PCR (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los productos de PCR se purificaron por tratamiento con 5 U de exonucleasa I (Exo-1) y 2 U de fosfatasa alcalina de camarón (SAP) a lo largo con tampón 1x a 37 oC durante 2-3 horas, seguido de la inactivación térmica de las enzimas a 85 oC durante 20 minutos. Después del tratamiento Exo-SAP, los productos PCR se diluyeron a 15 ng /l de concentración. PCR especificidad del producto, la cantidad y la calidad se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. secuenciación bidireccional de los productos de la PCR se llevó a cabo en las instalaciones del núcleo Genómica (RPCI, Buffalo) utilizando ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Los datos fueron analizados utilizando el software de análisis de secuencia y se verifican mediante un examen visual de las variantes identificadas en electroferograma.
El alelo-específica Genotipado de mutación C1744T en muestras de tumores
Hemos desarrollado un alelo-específicas basadas en la PCR método de genotipificación para evaluar la mutación no sinónima identificadas por secuenciación directa de
GRM1
gen en C1744T (582 Pro & gt; Ser) posición en la línea celular E006AA. Para la amplificación bidireccional de esta mutación específica, cuatro cebadores fueron diseñados (Tabla S1, números de cebadores 19 a 22), dos cebadores externos y los dos cebadores internos alelo-específicos (AS) con su especificidad 3 'final para cada alelo (C & gt ; T). C-alelo se amplifica en una dirección con un cebador AS interior y un par de cebadores externos (# 19 y#20; tamaño de amplificación 439 pares de bases), mientras que el mutante alelo T se amplifica en la dirección opuesta con el otro par de cebadores internos y externo (# 21 y#22; tamaño de amplificación 297 pb). Los dos cebadores externos también amplifican un fragmento constante (# 20 y#22; tamaño de amplificación 736 pares de bases), que sirven como controles positivos para PCR. Todos los cuatro cebadores fueron usados en una sola reacción y condiciones de PCR se optimizaron mediante el ajuste de la concentración de cada cebador y de recocido temperaturas (Tabla S1). En cada juego de reacción de PCR, se incluyó una positiva y una muestra de control negativo para observar la eficacia de la AS-genotipo.
Análisis bioinformático de Identifica novela
GRM1
mutaciones
Novel mutaciones identificadas en
GRM1
se probaron bioinformatically para diferentes efectos posibles sobre la estructura de la proteína, la función, y la variante de empalme sitio. El efecto de la mutación sin sentido (serina a prolina) en la posición 582 bis fue probada usando herramientas en línea; (I) PolyPhen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) [19], (ii) SIFT (http://sift.jcvi.org/) [20], y (iii) PhD- SNP (http://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP.cgi) [21].
Para predecir el potencial consecuencia estructural de la mutación identificada en el exón intrón cruces de exón-8 en
GRM1
gen, se utilizaron dos diferentes herramientas bioinformáticas en línea: (a) el buscador de empalme humano (http://www.umd.be/HSF/) [22] y ( b) ESEfinder (http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) [23]. secuencia de ADN que comprende tipo salvaje o alelo mutante se utilizó como una consulta en la herramienta humana Buscador de empalme para predecir el sitio donante de empalme o aceptor.
Resultados
Identificación de nuevos
GRM1
Las mutaciones y SNPs en líneas celulares de cáncer de próstata
La secuenciación de los exones enteros de
GRM1
gen en 10 líneas celulares de CaP mostraron 18 alteraciones genéticas como el recientemente identificado mutaciones no sinónimas, variaciones en sitios de empalme, no sinónimos, sinónimos, y no codificante polimorfismos (Figura 1 y 2, Tabla 1-2). Una nueva mutación no sinónima en C1744T (582 Pro & gt; Ser) la posición del exón-8 se detectó en E006AA, una línea de células AA-CaP primario (Figura 1). Esta mutación se presentó en el estado heterocigoto (CC & gt; CT) y situado cerca de transmembrana de dominio en el lado extracelular del receptor de GRM1 y resultó en prolina (aminoácido hidrófilo, codón-CCT) a serina (aminoácido neutro, codón-TCT) amino el cambio de ácido (Figura 2). La segunda novela se identificó la mutación en la unión exón-intrón del exón-8 en C4-2B, una línea resistente a la castración CaP celular (Figura 1, Tabla 1). Esta mutación resultó en G para la conversión de T en el inicio de intrón-8 y apareció en condición heterocigótica. Cinco mutaciones no codificantes también se encontraron en 3'-UTR región del exón-9 de
GRM1
gen en dos líneas diferentes de células (CaP LAPC4 y MDA-PCa2b) (Tabla 2). Una de estas mutaciones se encuentra en 2.149 pb aguas abajo del codón de parada en LAPC4 y reportada en la base de datos NCBI (dbSNP construir 139) como rs41285865. Mientras que otras cuatro mutaciones encuentra en 221 pb, 486 pb, 2664 pb y 2737 pb aguas abajo de codón de parada en MDA-PCa2b línea celular (Tabla 2). Estas mutaciones reportadas en la base de datos NCBI (dbSNP construir 139) como rs362827, rs6918099, rs362829 y rs79394543, respectivamente.
Además de estas mutaciones, uno missense SNP rs6923492 ( ) se identificó en la posición de aminoácido 993 en líneas celulares investigadas. Se observó homocigotos genotipo TT en líneas celulares, 22Rv1, CWR-R1 PC-3, y NL-Pr.EC. genotipo heterocigótico TC fue descubierto en líneas de células MDA-PCa2b VCAP y, y el genotipo CC homocigóticos en E006AA, DU-145, LAPC4, C4-2B, las líneas celulares LNCaP. En este locus, el cambio de T a C de nucleótidos resultó en serina (TCC) para la conversión de prolina (CCC). Este polimorfismo missense se encuentra en el dominio citoplásmico del receptor de GRM1 entre el dominio transmembrana y el motivo espiral de la bobina (Figura 2). Cuatro previamente reportados sinónimo polimorfismos también se identificaron en la secuencia del exón-9 a 931 (rs2942), 1056 (rs6923864), 1071 (rs1047006) y 1.165 amino ácido (rs9373491) posiciones (Tabla 1) de codificación. Seis SNPs no codificantes se encuentran en 3'-UTR de
GRM1
gen y estos polimorfismos se encuentran en 637 pb (rs362819) de 1277 pb (rs3804294) de 1278 pb (rs3804293), 1.369 pb (rs362820) de 2392 pb (rs362821) y 2616 pb (rs362822) aguas abajo hasta el codón de parada (Tabla 2).
identificación de
GRM1
Las mutaciones y SNPs en el cáncer de próstata Los tejidos
Secuenciación de los exones seleccionados-8 y -9 de
GRM1
gen en los tejidos tumorales de próstata mostraron múltiples alteraciones genéticas. Un estado homocigótico genotipo (genotipo CC) en comparación con el genotipo heterocigótico (genotipo CT) en el tejido normal adyacente en 637 pb aguas abajo (rs362819) para el codón de parada se encuentra en un tumor AA (muestras N38-T38, Tabla 3). Otros dos genotipos (CC y GA) fueron encontrados en la región 3'-UTR sólo en muestras de AA en la posición 221 pb (rs362827; N2-T2) y 486 pb (rs6918099; N6-T6, T32-N32 y N38-T38) aguas abajo para el codón de parada. Sin embargo, estos cambios fueron de origen de la línea germinal. Desde el genotipo heterocigótico (GA en rs6918099) a 486 pb aguas abajo de un codón de parada fue encontrado en 3 de los 11 miembros de AA, que parece ser un genotipo-étnico específico. El genotipo CC homocigóticos (rs362827) que sólo existe en un solo AA-paciente puede ser una mutación germinal esporádica o una variante poco frecuente.
Al igual que en los datos de secuenciación línea celular, hemos identificado un polimorfismo de cambio de sentido ( rs6923492) en la posición del aminoácido 993 aminoácidos serina que conduce a la prolina cambio de aminoácidos y se observó en 7 de los 10 miembros de AA (N2-T2, N26-T26, N27-T27, N32-T32, T62, T25, T11) y 5 de 11 CAs (N3-T3, N5-T5, N21-T21, T20, T34) tejidos (Tabla 3). Un SNP no codificante (rs362819) se encontró en 637 pb aguas abajo de un codón de parada. El estado de genotipo para estos SNPs en los tejidos tumorales era mismo con el tejido normal adyacente, lo que indica polimorfismos de la línea germinal (Tabla 3). Dos sinónimo polimorfismos también fueron encontrados en el exón-9 en ambas poblaciones AAs y autoridades competentes. Estos se encuentran en la posición de aminoácido 931 (rs2942) y el código de residuo de lisina, mientras que otro polimorfismo sinónimo encuentra en la posición de aminoácido 1056 (rs6923864) código de residuo de glicina.
Uso de alelo-específicas (AS) cebadores de PCR y la secuenciación directa en los tejidos de tumor normal correspondiente, genotipo de la mutación no sinónimo recientemente identificado en C1744T (582 Pro & gt; Ser) posición (en E006AA) y la mutación en la unión exón-intrón del exón-8 (en C4-2B) . Estas mutaciones no se detectaron en ninguno de los tejidos malignos de próstata (Figura 3).
Presencia de C-alelo mostró amplificación de un fragmento de 439 pb y la presencia de T-alelo mostró amplificación de un fragmento de 267 pb. Un fragmento de 706 pb no específica de se amplificó en todas las muestras.
Funciones predicho del Identificado
GRM1
mutaciones
La predicción del papel funcional de la novela no es sinónimo (582 Pro & gt; Ser) mutación identificada en
GRM1
se llevó a cabo utilizando diferentes herramientas. PolyPhen-2 predijo una probabilidad posterior de Bayes valor de puntuación deletérea 0.60 para esta mutación. Esta puntuación de predicción se basa en múltiples secuencias de alineación con la secuencia homóloga de este gen en la base de datos e indican que la mutación afecta a la estabilidad de la proteína o su función.
analizados independientemente, clasificación intolerante De Tolerante (SIFT) algoritmo también predijo una valor de la puntuación intolerancia a 0,02 para la sustitución de aminoácidos identificada en este locus. Sobre la base de proteína de conservación de la secuencia a lo largo de la evolución, SIFT predijo que 582 Pro & gt; Ser sustitución de aminoácidos también puede afectar a la función de proteínas. Además, se utilizó el método de doctorado-SNP que utiliza la base de datos y aprendizaje automático SNP técnica relacionada con la enfermedad disponible para predecir nsSNP relacionada con la enfermedad humana. Este análisis reveló relevantes de la enfermedad de la 582 Pro & gt; Ser mutación con un valor de índice de fiabilidad de 3.
Dado que las mutaciones puntuales en el exón-intrón o exón-intrón cruce pueden conducir a exón deslizamiento o splicing alternativo, estábamos interesa analizar el efecto potencial de la nueva mutación descubierta en unión exón-intrón del exón 8 en la línea celular C4-2B. Para ello, se empleó el Finder Empalme humana (HSF) y las herramientas del buscador de empalme exón Enhancer (ESE) para predecir la consecuencia en motivo del sitio de empalme con dos alelos diferentes de mutación identificada [22], [23]. Hemos encontrado que la presencia de alelo T predice fuertemente la posibilidad de adorno del donante de empalme (caaGtgagt) con un valor alto consenso de 88,26. Sin embargo, la sustitución de T a G-alelo como resultado la pérdida de este motivo donante de empalme (Figura 4A y 4B). Del mismo modo, el ESEfinder predijo una puntuación alta (9.49) motivo (potenciador exonic empalme) para la secuencia con G-alelo en el exón cruce 8-intrón del gen
GRM1
. Sin embargo, esta puntuación reduce a -7,52 para motivo de secuencia con el mutante T-alelo.
Twenty una secuencia de pares de bases que flanquean de sitio de la mutación con el tipo salvaje (A) y el alelo mutante (B) se ensayó para la predicción de empalme motivo del sitio (donante o aceptor).
Discusión
señalización GRM1 ha sido implicado en varios cánceres malignos incluyendo adenocarcinoma de colon, melanoma, carcinoma de pulmón, carcinoma de tiroides, carcinoma de mama, astrocitoma, neuroblastoma y rabdomiosarcoma [4], [5], [24]. receptor de glutamato ganó un interés particular debido a su potencial de transformación y la disponibilidad de su ligando, glutamato, en el contexto de microambiente tumoral y fácilmente accesibilidad de receptor en la superficie de las células tumorales. Expresión diferencial, el estado de activación o la reprogramación de señal de receptor de glutamato en células tumorales pueden contribuir al desarrollo y progresión del cáncer. Estas alteraciones pueden deberse a cambios específicos que incluyen somáticas y alteraciones genéticas en la línea germinal, copiar la variación del número, epigenética, y los cambios posteriores a la traducción que resulta en alteraciones en la expresión o activación y mejorando de este modo la progresión tumoral y la metástasis [25].
secuenciación profunda estudios han demostrado que la proteína G de receptores acoplados (GPCR) están mutado en aproximadamente 20% de toda la familia de receptores de glutamato cáncer y representan un segundo miembro de la familia GPCR mutado más frecuentemente [26]. Las mutaciones somáticas en
GRM1
se ha informado en la amplia variedad de tumores tales como melanoma, carcinoma de mama, carcinoma de colon, adenocarcinoma de pulmón, tumores cerebrales, heamatopoitic, y el tejido linfoide [15].
GRM1
génica comprende de diferentes dominios con funciones específicas, incluyendo la unión del ligando de dominio, dominio rico en cisteína para la dimerización, transmembrana y el dominio C-terminal para la interacción con moléculas de señalización aguas abajo. Las mutaciones en estos residuos conservados pueden desempeñar un posible papel en la unión de receptor GRM1 con el ligando, la iniciación, la transmisión de la señal, o la terminación o ganancia de función de señalización fenotipos. Estas mutaciones no sólo pueden implicar en el desarrollo y progresión del tumor sino que también afectan la metástasis incluyendo la motilidad celular y la promoción de la angiogénesis.
Estudios anteriores han demostrado que las mutaciones en diferentes G-receptor acoplado a proteína, y CCK2R GRM1 están asociados con la alteración la función del receptor, las vías de señalización corriente abajo, la morfología celular alterada, la migración, y promover la angiogénesis, lo que lleva a una mayor tumerogenesis [15], [27]. Esseltine
et al
estudió el papel funcional de
GRM1
mutaciones localizadas en el sitio de unión del glutamato-(A168V), glutamato vinculante de dominio (R375G), región rica en cisteína (G396V), G- proteína de unión a región (R696W), y Homer región de unión (P1148L) en la cola carboxi-terminal de GRM1 receptor [15]. La expresión transitoria de la mutado
GRM1
se asoció tanto con la expresión de la superficie celular reducida o basal /activación quiscualato estimulada de fosfato de inositol (IP) y /o ERK1 /2 activación [15]. La mutación en la región de unión cuadrangular de (P1148L) fue mostrado para alterar la morfología celular y podría afectar la migración celular.
A pesar de múltiples mutaciones se han reportado en
GRM1
gen en diferentes cánceres humanos [4], sólo un número limitado de estudios de alto rendimiento incluyendo el análisis de la secuenciación del exoma o transcriptoma se llevaron a cabo y se identificaron algunas
GRM1
mutaciones en muestras de CaP [28], [29]. Dos mutaciones novedosas (R868H y G144S) en
GRM1 gratis (Tabla S2) se identificaron mediante la secuenciación de los exomas de CaP 50 letal catrate resistente, muestras primarias CaP órgano-confind 11 de alto grado (tratamiento ingenuo) y 11 líneas celulares de CaP [29]. secuenciación del exoma de pares 112 /tumor de próstata normales identificó dos mutaciones sin sentido (A573E y R681H) en
GRM1
de genes [28]. Una mutación sin sentido se informó también en el exón-2 de
GRM1
gen.: Gratis (TCGA https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)
Exoma o secuencia transcriptoma el análisis tiene sus limitaciones inherentes, incluyendo la incapacidad para detectar mutaciones en el exón-intrón cruces o región no codificante y la necesidad de una mayor validación experimental de las mutaciones identificadas [28]. Además, estos estudios no incluyen las muestras de AA-tumorales o de sus líneas celulares. Debido a estas limitaciones, seleccionados, por primera vez, toda la región exonic de
GRM1
gen incluyendo flanqueantes 5 'y 3' UTRs y uniones exón-intrón en diez líneas celulares de CaP usados comúnmente incluyendo la dos líneas establecidas de células AA-PCA (E006AA y MDA-PCa2B), y 21 tejidos de tumor de próstata normales emparejados de 11 CA y 10 AA pacientes.
en este estudio, se identificaron dos nuevas mutaciones en E006AA y C4 líneas celulares 2b. Estas mutaciones no fueron identificados en estudios previos basados en su diseño del estudio o las líneas celulares incluidos para la secuenciación [29]. mutación no sinónima (C y T) en la posición del aminoácido 582 dio lugar al cambio de prolina serina. Esta mutación se encuentra cerca de dominio de transmembrana en el lado extracelular. predicción de Bioinformática del papel funcional de esta mutación, el uso de múltiples herramientas de análisis, mostró la conversión de hidrofílico (serina) a neutro (prolina) de aminoácidos es o intolerante o conduce a efectos perjudiciales para la estabilidad y función de proteínas. Una conversión de serina a ácido amino prolina también puede afectar a la fuerza de transmisión de la señal después de la unión del ligando y la activación del receptor GRM1. Otra mutación identificada en el límite exón-intrón de
GRM1
exón-8 en la línea celular C4-2B.
Bioinformática análisis utilizando dos herramientas en línea diferentes predijo que G a T conversión de nucleótido en esta posición resultó en la interrupción del sitio donante de empalme. La interrupción del motivo de empalme in situ en unión exón-intrón en el exón 8-posición puede proporcionar la base para la creación de diferentes variantes de empalme en el gen
GRM1
. Varias isoformas de
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gen con diferente longitud de proteínas están asociadas con la activación diferencial de las señales de aguas abajo o bien a través de cambios en la intensidad de la señal o la interacción con otras proteínas citosólicas [30]. Se requieren estudios adicionales para validar el papel funcional de nuevas mutaciones de
GRM1
genes identificados en este estudio y los de otros investigadores [28], [29]. Cuatro mutaciones adicionales fueron identificados en MDA-PCa2b y una mutación en la línea celular LAPC4 situado en 3'-UTR de
GRM1
genes y estas mutaciones se han reportado en la base de datos NCBI (dbSNP Build 39) en diferentes poblaciones. Estas mutaciones se produjeron como alteraciones de la línea germinal en muestras de tumores investigados y se observó que la frecuencia de estas mutaciones es alto en las muestras de tumor de AA en comparación con CAs. De alta frecuencia de estas mutaciones observadas en las muestras de AA puede asociar con diferencial
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expresión y función, que puede resultar en la progresión o más gravedad de la enfermedad. AA población ha mostrado una alta tasa de incidencia y mortalidad y presenta una enfermedad clínicamente más agresivos que las entidades emisoras. El papel funcional de estas mutaciones no ha sido reportado en la literatura [31]
Un polimorfismo missense (rs6923492 T & gt; C). Identificado en el exón-9 de
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gen en líneas celulares de CaP y tumores resultaron en cambio de serina a prolina en la posición 993 de ácido amino en el extremo citoplasmática del receptor. estudio anterior utilizando 1.000 pacientes de cáncer de mama mostró asociación de este SNP en ER + /PR + carcinoma ductal in portadora TT-genotipo con edad posterior al diagnóstico (4.9 años) en comparación con cualquiera de TC y los portadores de CC-genotipo [32]. Sin embargo, no se encontró asociación con la susceptibilidad de melanoma [33]. Se requiere un estudio más amplio muestras de tumor para confirmar la asociación de este SNP con la susceptibilidad a la carcinogénesis de próstata, la agresividad y la progresión.
Conclusiones
En este estudio, hemos identificado nuevas mutaciones en
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gen, además de mutaciones y SNPs se informó anteriormente en líneas celulares de CaP y también en un subconjunto de los tejidos malignos de próstata. Estas nuevas mutaciones se predijo para jugar un papel importante en la función de genes incluyendo la estabilidad de proteínas y empalme de las diferentes isoformas. validación funcional de estas mutaciones reforzará aún más el papel de las alteraciones genéticas de los
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gen en la carcinogénesis de próstata y la progresión.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
detalles de los cebadores utilizados para la secuenciación del gen
GRM1
. Las secuencias genómicas de los cebadores utilizados para la PCR y secuenciación de acuerdo con la asamblea del Genoma Humano (
GRM1
gen adhesión#NM_000838.3)
doi: 10.1371. /journal.pone.0103204.s001 gratis (DOC )
Tabla S2.
detalles de mutaciones somáticas en
GRM1
gen identificado en estudios de secuenciación del exoma o transcriptoma enteros de líneas celulares de cáncer de próstata y tumores
doi:. 10.1371 /journal.pone.0103204.s002 gratis ( DOC)