Extracto
El mecanismo detrás del control de la dinámica espacio-temporal de células de cáncer y su posible asociación con la proliferación celular no ha sido así establecido. Mediante la explotación de la técnica de imagen intravital, se encontró que la motilidad de las células cancerosas y las propiedades invasivas estaban íntimamente asociados con el ciclo celular.
In vivo
inoculación de células de cáncer de colon humano que llevan indicador del ciclo celular basada en la ubiquitinación de fluorescencia (Fucci) demostraron un fenómeno inesperado: S /G2 /M células eran más móviles e invasivas que las células G1. Los análisis de microarrays mostró que
Arhgap11a
, una proteína Rho GTPasa de la activación sin caracterizar (RhoGAP), se expresó de una manera ciclo celular dependiente. Expresión de ARHGAP11A en células de cáncer suprimida mecanismos RhoA-dependientes, tales como la formación de fibras de estrés y de adhesión focal, lo que hizo que las células más propenso a migrar. Se demostró además que RhoA supresión por ARHGAP11A aumento de la actividad de Rac1 relativa inducida, lo que lleva a un aumento de las propiedades invasivas. inhibición basado en RNAi de Arhgap11a redujo la invasión y
in vivo
expansión de cánceres. Además, el análisis de muestras humanas mostró la significativa sobre regulación de
Arhgap11a Hoteles en los cánceres de colon, que se correlaciona con el estado de la invasión clínica. El presente estudio sugiere que ARHGAP11A, un RhoGAP dependiente del ciclo celular, es un regulador crítico de la movilidad de las células cancerosas y es por lo tanto un objetivo terapéutico prometedor en los cánceres invasivos
Visto:. Kagawa Y, Matsumoto S, Kamioka Y, Mimori K, Naito Y, Ishii T, et al. (2013) ciclo celular dependiente de Rho GTPasa Actividad Regula dinámicamente la motilidad celular y la invasión del cáncer de
En Vivo
. PLoS ONE 8 (12): e83629. doi: 10.1371 /journal.pone.0083629
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 29 Agosto, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: December 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kagawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiada por subvenciones-en-ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (22113007), por el primer programa del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón, por las subvenciones del Programa Internacional Human Frontier Science (RGY0077 /2011) ; y por subvenciones de la Fundación Ciencia Takeda, el Cell Science Research Foundation, la Fundación Kanae para la Promoción de la Ciencia Médica, y la Fundación de Nakajima. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
expansión ilimitada debido a la progresión del ciclo celular sin control y una mayor penetración en el medio ambiente vecina normal es un aspecto formidable y que amenaza la vida de las células cancerosas. De hecho, la regulación del ciclo celular ha sido un tema importante de investigación en el campo de la biología de las células cancerosas.
Además, el cáncer tiene propiedades altamente dinámicos, incluyendo la invasión de los tejidos circundantes, la infiltración de la circulación sistémica, y pionero de un nuevo "nicho" para la colonización lejos de su origen [1], [2]. Aunque los factores que determinan la movilización de células de cáncer, tales como la familia Rho pequeñas proteínas G, se han estudiado ampliamente [3], la asociación entre la regulación del ciclo celular y la movilidad celular de las células cancerosas no está claro. Para dilucidar esta interacción dinámica sería valioso para observar las propiedades espacio-temporales de la regulación del ciclo celular y la movilidad celular simultáneamente
in vivo
.
Recientemente, se empleó la microscopía intravital multifotónica para disecar los fenómenos celulares intactas en varios sistemas biológicos, tales como la respuesta inmune [4], [5], reacciones inflamatorias [6], y la remodelación ósea [7]. Esta técnica de imagen avanzada nos ha permitido comprender los comportamientos dinámicos de las células en los tejidos y órganos vivos. Las células cancerosas son también altamente móvil y sus comportamientos migratorios han sido evaluadas utilizando esta técnica de imagen [8] -. [10], aunque su correlación con la naturaleza proliferativa de las células sigue siendo difícil de alcanzar
A continuación, tuvimos éxito en la visualización dinámica eventos durante la invasión de células del cáncer y la metástasis mediante el uso de microscopía multifotónica intravital. Por medio del indicador fluorescente del ciclo celular basada en la ubiquitinación (Fucci), una sonda de proteína fluorescente especial que se utiliza para el seguimiento del ciclo celular en células vivas, hemos identificado una estrecha relación entre el ciclo celular y las propiedades de movilización de las células cancerosas.
resultados
la visualización dinámica detecta la movilización de células de cáncer asociado ciclo-celular y la invasión
in vivo
Hemos utilizado la microscopía multifotónica intravital y la tecnología Fucci [11] para estudiar la célula ciclo y la migración en un sistema vivo. En este sistema Fucci, geminina (GMNN), una proteína nuclear enriquecido en el S /G2 /M fases, y Cdt1, enriquecido en la fase G1, fueron marcados respectivamente con las proteínas de efecto invernadero y de rojo fluorescente (Figura 1A,
superior del panel). Fucci-expresión de las células de cáncer de colon HCT116 invasivos humanos (Figura 1A,
inferior
panel) se inocularon en el ciego o tejidos subcutáneos de un ratón inmunocomprometido NOD /SCID [12] - [14]. Cuatro semanas después de la implantación, se observaron tumores intravitally. Nos preferentemente detectamos /M-fase S /G2 células Fucci-verdes a lo largo de las zonas marginales de las cabezas de la invasión del cáncer después de inoculados en la pared del ciego (Figura 1B). cambios en la distribución similares en células Fucci-verde y -red se detectaron cuando las células cancerosas se inocularon en el mesenterio o colon pared (Figura S1). La distribución preferencial de las células cancerosas en el S /G2 /M fases también se observó en las muestras de cáncer de colon humano resecado quirúrgicamente (Figura S2). Las células cancerosas en las cabezas de invasión se tiñeron con anticuerpos contra preferentemente GMNN [15], [16] en comparación con los de las regiones no tumorales o los centros tumorales
.
(A) Creación y análisis de células de cáncer de colon HCT116 de forma estable expresando Fucci. (
Alta
) El sistema Fucci permite la monitorización del ciclo celular en células vivas en tiempo real. Los núcleos de las células en el G1 /G0, temprana S, y S /G2 /M fases están etiquetados rojo, amarillo, y verde, respectivamente. (
Baja
) Instantáneas de las células HCT116 que expresan Fucci. Las barras de escala representan 20 micras. (B) de formación de imágenes multifotónica intravital de células HCT116 Fucci-positivos inoculados en ratones NOD /SCID. (
Izquierda) Una imagen representativa de las células HCT116 que expresan Fucci implantados en el ciego (verde: Fucci-verde (MAG), S /G2 /M; rojo: Fucci-roja (mKO2), G1, el azul : fibras de colágeno (la generación de segundo armónico (SHG) de imágenes)). Las barras de escala representan 75 micras. (
Derecho
) La cuantificación de las cantidades de células HCT116 Fucci-verde y -red en diferentes áreas de los tumores inoculados. zonas centrales y marginales se definieron como áreas más lejos o más cerca que 75 micras de la frontera entre los tejidos tumorales y normales, respectivamente. (C) Imagen representativa en el borde de una masa tumoral HCT116 que expresan Fucci. Toda la zona (
la izquierda) y una serie de tiempo (
derecha) de las imágenes ampliadas (uno por cada 400 s) de las células cancerosas invaden el intersticio (verde: Fucci-verde (MAG), S /G2 /M; rojo: Fucci-roja (mKO2), G1; azul:. fibras de colágeno (por imágenes SHG) (véase también la película S1) Las imágenes reales (
paneles superiores) y
trayectorias de células (
paneles inferiores
) se muestran. Las barras de escala representan 100 micras (
izquierda) y 10 m (
derecha). (D) imagen Representante de extravasating Fucci-que expresan las células HeLa. toda la zona (
izquierdo) y una serie de tiempo (
derecha) de las imágenes ampliadas de las células cancerosas extravasating de los vasos sanguíneos (uno por cada 12 min) (verde: Fucci-verde (mAG) , S /G2 /M; rojo: Fucci-roja (mKO2), G1; azul: las fibras de colágeno (por imágenes SHG) (véase también la película S2) Las imágenes reales (
Tarjetas telefónicas paneles superiores) y las trayectorias de células (
bajar
paneles) se muestran barras de escala representan 100 micras (
izquierda) y 10 m (
derecha) (e) de la motilidad celular en Fucci-verde-y. - Los glóbulos rojos-positivas se midió durante 4 h (véase también la película S3). (
Izquierda)
esferas verdes y rojas representan células Fucci-invernadero y -red-positivos, respectivamente, y las líneas amarillas muestran las trayectorias asociadas. Las barras de escala representan 100 micras. (
Derecho
) velocidades medias de seguimiento de las células Fucci-invernadero y -red-positivos. De datos (n = 379 para Fucci verde y n = 259 para Fucci rojo) se obtuvieron a partir de células individuales en tres experimentos independientes. Las velocidades de los dos grupos se compararon mediante Mann-Whitney
U
-test (p = 0,0191). Los rangos de mediana y cuartiles de cada grupo se superponen en los gráficos de puntos.
A continuación, examinamos la naturaleza dinámica de las células del cáncer de
in vivo
. Fucci-expresando células cancerosas HCT116 fueron altamente móvil tras la inoculación en los tejidos subcutáneos, y algunas células cancerosas se invade de forma activa, lo que parece 'inmersión' en el intersticio circundante durante time-cursos (Figura 1C; Película S1). En particular, la casi totalidad de las células de buceo eran verdes (Figura 1C,
puntas de flecha
), lo que sugiere que la motilidad celular y la invasión del cáncer puede ser dependiente del ciclo celular. Por otra parte, se podría detectar sus movimientos migratorios durante la extravasación de metástasis (Figura 1D; Película S2). Se encontró que algunas células para migrar fuera de los agregados celulares de cáncer pegados dentro de los vasos sanguíneos, y estos eran también todo verde. Un cierto período de observación (para un máximo de 2 h) de las regiones centrales del tumor resultó en la captura de los comportamientos lentos basales, así como el movimiento de streaming con el flujo sanguíneo, de varios tipos de células de cáncer, lo que nos permitió a la imagen un número suficiente de células para cuantificación (Figura 1D; Película S3). Los análisis estadísticos detallados de la velocidad de rastreo celular demostrado claramente que las células cancerosas verdes (en el S /G2 /M fase de la motilidad) tienen significativamente mayor que las células rojas G1 (media de seguimiento de la velocidad de 1,39 ± 0,08 m /min para vs. Fucci-verde 1,09 ± 0,06 m /min para Fucci-roja; p = 0,00191) (Figura 1E). Se confirmó que un cierto período de formación de imágenes intravital (hasta 3 h) no afectó a la movilidad de las células cancerosas (Figura S3). Mediante el seguimiento de las células individuales durante un período de tiempo, se excluyó la posibilidad de que tal cambio en la movilidad de los S /G2 /M fases refleja el movimiento en relación con la citocinesis. Estos resultados indican que ciertas moléculas expresados preferentemente en las fases S /G2 /M Fucci-verde facilitar la migración y la invasión de las células cancerosas.
Identificación de ARHGAP11A como un ciclo celular dependiente de la movilidad de control de la molécula
Para dilucidar las bases moleculares del control de la motilidad dependiente del ciclo celular, se realizó un análisis comparativo de cDNA microarrays de base entre las células Fucci-verde y -red cultivadas
in vivo gratis (Figura 2A). En el análisis de microarrays, 2.032 sondas (1.656 genes) mostraron & gt; dos veces los cambios en la expresión (Figura 2B; Tabla S1). Como se preveía, la mayoría de estos genes codifican proteínas asociadas con la división celular y la mitosis. Sobre la base de las categorías de ontología de genes, se extrajeron los genes relacionados con el movimiento celular a partir de los 1.656 candidatos y se encontró que una proteína Rho GTPasa de la activación sin caracterizar (RhoGAP),
Arhgap11a
, se expresó preferentemente en S /G2 fase verde /M las células cancerosas (Figura 2B, Tabla S1). Todas las tres sondas para
Arhgap11a
gen fueron altamente clasificado (5º, 12º, y 41º) entre los 2.023 sondas. Se ha demostrado que la familia Rho pequeñas proteínas G tales como Rho, Rac y Cdc42, y sus moléculas reguladoras, tales como RhoGAP, controlar cooperativamente la motilidad celular tanto en células normales y el cáncer [17] - [21]. La expresión preferencial de
Arhgap11a Hoteles en células Fucci-verde fue confirmada tanto en el mRNA (Figura 2C) y los niveles de proteína (Figura 2D). Además, hemos demostrado un aumento gradual dependiente del tiempo en
Arhgap11a
expresión durante la progresión a través del ciclo celular de G1 a S /G2 /M (figura 2E; Figura S4), fortaleciendo el concepto de que
Arhgap11a
expresión se controla de una manera dependiente de la progresión del ciclo celular. expresión dependiente del ciclo celular de Arhgap11a también se detectó en otras líneas celulares de cáncer de colon, además de HCT116, como DLD1, HT29 y KM125M (Figura 2F) y HeLa (Figura S5), así como en líneas celulares no cancerosas, tales como células HEK293 ( Figura S6), lo que sugiere la presencia de un mecanismo general de esta regulación de la expresión característica de los
Arhgap11a Hoteles en muchos tipos de células. Para dilucidar el mecanismo subyacente a la expresión dependiente del ciclo celular de Arhgap11a, hemos examinado aún más el control de la transcripción de este gen. factores de transcripción de la familia E2F se han documentado para funcionar de una manera dependiente del ciclo celular [1]. Hemos observado que una secuencia putativo E2F vinculante (TTTCGCGC) [23] se encuentra en -27 a -20 pares de bases desde el sitio de iniciación de la transcripción de Arhgap11a. inmunoprecipitación de la cromatina experimentos (chip) demostraron la asociación directa de E2F1 con la región (Figura 2G), que puede estar implicado en el ciclo celular dependiente de la activación transcripcional de este locus. Un ensayo de indicador de luciferasa mostró E2F1 dependiente de la activación transcripcional del promotor Arhgap11a, que fue bloqueada por asociación con la proteína Rb (Figura 2H), lo que sugiere el posible papel de E2F /Rb vías en la regulación transcripcional de Arhgap11a. Nos damos cuenta plenamente la participación de otros factores de transcripción, ya Arhgap11a se expresó sustancialmente también en fase G1 (Figura 2D), aunque podemos suponer Rb vía /E2F sería al menos responsable del aumento en la expresión Arhgap11a en la fase S.
análisis de microarrays basado en la señal (A) Fucci. Las células HCT116 Fucci-positivos fueron separados en Fucci-verde (MAG) - y Fucci-roja (mKO2) - células positivas por FACS. El ARNm se extrae de estas células y se comparó por análisis de microarrays (dos experimentos de tinte de intercambio, obteniendo cuatro microarrays de análisis independientes). (B) En total, 2.023 sondas (1.656 genes) mostró & gt; al doble cambios en la expresión (Tabla S1) (P & gt; 0,05). De ellos,
Arhgap11a
ocupaba un puesto alto, y las tres sondas para
Arhgap11a
estaban entre las sondas de alta clasificación para RhoGAPs. Las tres sondas eran específicos para las pociones indicadas de la
Arhgap11a
ARNm (
la izquierda). Los tres puntos marcados (# 1,#2,#3) en los gráficos de dispersión representan los cambios veces (
derecha). (C) la expresión dependiente del ciclo celular de
Arhgap11a
mRNA fue confirmada por qPCR. Los datos de expresión se normalizaron a
Gapdh gratis (n = 3). (D) de la célula expresión dependiente del ciclo de
Arhgap11a
proteínas. (
Derecho
) de citometría de flujo análisis de las células HCT116 que expresan Fucci. perfiles del ciclo celular fueron codificados por colores: G1, rojo; S temprana, de color amarillo; y S /G2 /M, verde (
parte superior derecha). contenido de ADN se midieron por fluorescencia de Hoechst33342 (
inferior derecha
), lo que confirma que las señales Fucci representan con precisión los niveles del ciclo celular (n = 3). (
Left
) expresión dependiente del ciclo celular de los marcadores ARHGAP11A y del ciclo celular, tal como se determina por transferencia Western (n = 3). (E) expresión dependiente del tiempo de
Arhgap11a
durante la progresión del ciclo celular de G1 a S /G2 /M. Fucci-roja (mKO2) -positivos células HCT116 se clasificaron utilizando un clasificador de células FACSAria y se cultivaron durante los períodos de tiempo indicados. Los análisis de citometría de flujo (
superior) y las relaciones de colores Fucci (
la izquierda) se muestran para cada punto de tiempo. (
Derecho
) Expresión relativa de
Arhgap11a
fue examinado por qPCR (n = 6). Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía (
p
= 0,0001) y la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (***
p Hotel & lt; 0,01). (F) dependiente del ciclo celular
Arhgap11a
expresión en varias líneas celulares de cáncer de colon humano. Fucci se introdujo en diferentes líneas celulares de cáncer de colon humano (HCT116, DLD1, HT29, y KM12SM). En todas las líneas celulares,
Arhgap11a
expresión fue significativamente mayor en S /G2 /M (
verde
) que en las células G1 (
rojo
). (G) A la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de ensayo con un anticuerpo anti-E2F1 mostró que E2F1 unido al sitio de unión a E2F-putativo en el
Arhgap11a
promotor (n = 3). ensayo de indicador (H) de la luciferasa de la
Arhgap11a
región promotora (-500 pb), incluyendo el sitio de E2F de unión (GTTTCGCGC) a -20 pb desde el punto de partida de la transcripción. La co-transfección con E2F1 mejorado la actividad transcripcional, mientras que la expresión simultánea de Rb, estuvo muy concentrado. Los valores para la actividad de luciferasa se normalizaron a través de cada experimento y, para controlar las diferencias en la eficiencia de transfección, a ß-galactosidasa.
ARHGAP11A es una proteína GTPasa de la aceleración para Rho, pero no para Rac o Cdc42, e inhibe fenómenos celulares Rho-dependientes
ARHGAP11A ya había sido clonado y que figuran en una base de datos NCBI, pero su función molecular aún no había sido caracterizada. En particular, no estaba claro si su dominio GAP putativa de hecho ejerce un efecto GTPasa de la aceleración. Para determinar su función, aislamos ARHGAP11A etiquetado-halo (o halo-Tag sólo como un control) expresados en células HEK293 (Figura 3A), y se incubaron que
in vitro
con varias proteínas de la familia Rho, como RhoA , Rac1, Cdc42 y (Figura 3B). En este ensayo, se midió la actividad GAP mediante la detección de fosfato inorgánico liberado debido a GTP hidrólisis de las proteínas Rho [24]. Este ensayo in vitro libre de células mostró que ARHGAP11A acelera en gran medida la hidrólisis de GTP de RhoA, pero no la de Rac1 o Cdc42 (Figura 3B). Las cantidades de formas activas de proteínas de la familia Rho También se evaluaron mediante el ensayo de pull-down con GST-Rhotekin (Rho) o GST-cuna (para Rac y Cdc42) en células HEK293 [25]. La transfección de ARHGAP11A reduce las cantidades de RhoA activa, RhoB y RhoC, pero no de Rac1 o Cdc42 (Figura 3C). También confirmó que esta actividad RhoGAP fue abolida en esencia cuando su dominio GAP putativo se ha eliminado (Figura 3D). Estos resultados confirman claramente que ARHGAP11A una brecha específica para Rho, pero no para Rac o Cdc42, cuyo efecto es mediado por su dominio GAP predicho.
(A) halo-Tagged ARHGAP11A y Halo-Tag proteínas expresadas y purificado a partir de células HEK293. (B) Detección de la actividad GTPasa mediante la cuantificación de fosfato inorgánico liberado por la hidrólisis de GTP mediante proteínas de la familia Rho. ARHGAP11A mejoró la actividad GTPasa de RhoA, pero no de Rac1 o Cdc42. (C) La detección de formas activas y totales de varias proteínas de la familia Rho (RhoA, RhoB, RhoC, Rac1 y Cdc42) en células HEK293 transfectadas con halo-ARHGAP11A o su control. La expresión de ARHGAP11A reduce las cantidades de las formas activas de RhoA, RhoB y RhoC. (D) Evaluación de ARHGAP11A mutante sin el dominio GAP putativa (ΔGAP).
Activo RhoA se ha demostrado que estimula la adhesión focal y la formación de fibras de estrés por la activación de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) y /o mDia (Figura 4A) [26]. Concordantemente, la expresión exógena de RhoA constitutivamente activa (RhoA-Q63L) [27] en las células HCT116 indujo aumentos aberrantes en fibras de estrés de actina F y la formación de adhesión focal, visualizadas por medio de los agregados paxillin (Figura 4B). En contraste, la supresión de la actividad de Rho por CT04 (1 mg /ml), un potente inhibidor de la Rho [28], redujo la formación de fibras de estrés y adhesiones focales (Figura 4C). En estas condiciones experimentales, la expresión adicional de ARHGAP11A inhibió significativamente la formación de ambas fibras de estrés de actina F (Figura 4D,
medio del panel, y 4E) y adhesiones focales (Figura 4D,
derecho
panel y 4F). La expresión de ARHGAP11A también redujo el nivel de la cadena ligera de la miosina fosforilada (PMLC) (Figura S7). En resumen, ARHGAP11A, como RhoGAP, suprime los fenómenos de Rho-dependientes, tales como la adhesión focal y la formación de fibras de estrés en las células cancerosas HCT116. También confirmó la función de ARHGAP11A en células HeLa (Figura 4G-I).
(A) Ilustración esquemática de las reacciones celulares mediados por RhoA. (B) Efecto de la sobreexpresión de tipo salvaje (WT) o constitutivamente activa (Q63L) RhoA en la formación de fibras de estrés de actina F (visualizados utilizando Alexa 568-faloidina) y adhesiones focales (teñidas con anti-paxillin). GFP se co-transfectadas para identificar las células transfectadas. Las barras de escala representan 15 micras. (C) Efecto de CT04, un inhibidor de RhoA potente, en la formación de fibras F-actina de estrés (visualizaron utilizando rodamina-faloidina) y adhesiones focales (teñidas con anti-paxillin). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las barras de escala representan 15 micras. (D) Efecto de la sobreexpresión de halo-Tagged ARHGAP11A o su control sobre la formación de fibras F-actina de estrés (visualizaron utilizando Alexa 568 faloidina-) y adhesiones focales (teñidas con anti-paxillin) en células HCT116. Las puntas de flecha identifican las células que expresan Tag-halo (marcadas con verde Oregón conjugado ligando de Halo-Tag). Las barras de escala representan 10 micras. (E) Cuantificación de las intensidades medias de F-actina en Halo-control (n = 80) y Halo-ARHGAP11A-expresión de las células HCT116 (n = 80). Los datos fueron compilados a partir de tres experimentos independientes. (F) La cuantificación de adhesiones focales en Halo-control (n = 80) y Halo-ARHGAP11A-expresión de las células HCT116 (n = 80). Los datos fueron compilados a partir de tres experimentos independientes. (G) Efecto de la sobreexpresión de halo-Tagged ARHGAP11A o su control sobre la formación de fibras de estrés de actina F (visualizaron utilizando Alexa 568 faloidina-) y adhesiones focales (teñidas con anti-paxillin) en células HeLa. Las puntas de flecha identifican las células que expresan Tag-halo (marcadas con verde Oregón conjugado ligando de Halo-Tag). Las barras de escala representan 10 micras. (H) La cuantificación de las intensidades medias de F-actina en Halo-control (n = 80) y Halo-ARHGAP11A-expresión de células (n = 80) HeLa. Los datos fueron compilados a partir de tres experimentos independientes. (I) La cuantificación de la cantidad de adhesiones focales en Halo-control (n = 40) y Halo-ARHGAP11A-expresión de células (n = 46) HeLa. Los datos fueron compilados a partir de tres experimentos independientes.
ARHGAP11A estimula la motilidad de las células cancerosas mediante la mejora de la actividad Rac
se conoce la motilidad celular para ser recíprocamente regulado por diversa familia Rho pequeñas proteínas G [29] . Considerando que RhoA activa (o Rho o RhoC) estabiliza citoesqueletos mediante la mejora de fibras de estrés y la formación de adhesión focal, la activación de Rac1 (o Cdc42) hace que las células flexible y móvil, lo que lleva a la formación de lamelipodios o filopodios [29]. Las actividades de las proteínas que contrarrestan RhoA y Rac1 se controlan mutuamente [30], y la inhibición de uno Resultados en el aumento relativo de la otra (figura 5A). Aquí, mediante el uso de Raichu-Rac1, un biosensor basado en FRET de la actividad Rac1 a nivel de una sola célula [31], [32], se analizó la actividad de Rac1 en células HCT116. actividad Rac1 fue significativamente mayor en las células que expresan ARHGAP11A comparación con falsamente transfectadas (transfectadas con halo-Tag solamente) o células no transfectadas (Figura 5 B y C), lo que sugiere el mecanismo por el cual la supresión de la actividad Rho conduce a contrarrestar activación de Rac1 a nivel de una sola célula. Similar activación ARHGAP11A mediada de Rac1 también se observó en células HeLa (Figura S8). Esquema
(A) que representa el equilibrio entre RhoA y Rac1 para la migración celular. (B) Los análisis de Rac1 actividad a nivel de una sola célula en las células HCT116 que expresan halo-ARHGAP11A o su control de Halo. Imágenes representativas de las células HCT116 Raichu-Rac1 que expresan bajo el control de Halo-(
la izquierda) o transfección de Halo-ARHGAP11A (
derecha)
condiciones. Rac1 actividad fue supervisada por razones de CFP /YFP FRET derivados de Raichu-Rac1. La expresión de halo-Tag se identificó con el conjugado ligando-TMR halo-Tag. La barra de escala representa 5 micras. (C) Cuantificación de las relaciones de FRET en Halo-control (n = 30) y Halo-ARHGAP11A-expresión de las células HCT116 (n = 30). (D) de cultivo tridimensional de HCT116 transfectadas con halo-control o ARHGAP11A etiquetada con Halo, complementado con Y27632 (para Halo-control sólo). La barra de escala representa 50 micras. (E) Las proporciones de tipo redondo HCT116 transfectadas en cultivo 3D con halo-halo-ARHGAP11A o control. las células de tipo redondo se contaron en tres campos visuales para cada uno de tres experimentos independientes. Las columnas representan la media ± s.e.m. (F)
in vitro
ensayo de invasión utilizando la placa 3D Matrigel. Las células migradas se visualizaron por tinción de la membrana de cultivo con Diff Quik (Dade Behring). HCT116 transfectadas con halo-halo-ARHGAP11A o de control, y de tipo salvaje HCT116 tratados con Y27632 se utilizaron en el ensayo. (G) La cuantificación de los índices de invasión de los ensayos de placa 3D Matrigel. índices de invasión se calcularon según la ecuación mostrada en la sección de métodos. Las columnas representan las medias ± s.e.m.
A continuación, se examinó el efecto de la inhibición de Rho por ARHGAP11A en el control de la morfología de las células cancerosas y la movilidad. Para analizar las propiedades morfológicas de las células cancerosas, que un sistema de cultivo utilizado en tres dimensiones (3D) Matrigel (Figura 5 D y E) [33]. En los resultados, la sobre-expresión de ARHGAP11A dado lugar a formas de huso, de células HCT116, lo que representa un fenotipo invasión propensa. cambios morfogénicas similares también pueden ser observados cuando la señalización mediada por Rho fue inhibida por Y27632, un inhibidor de ROCA potente [34]. Se midió además la
in vitro
propiedades migratorias de las células HCT116 en placas 3D Matrigel (Figura 5 F y G) [35], y concordantemente, la sobreexpresión de ARHGAP11A o Y27632 tratamiento mejorado la migración de HCT116
in vitro
. Por otra parte, una fuerte inhibición de la actividad de Rho por la alta concentración de Y72632 bloqueó la migración (datos no mostrados). Estos resultados sugieren claramente que adecuado nivel de inhibición de RhoA como logra mediante la sobreexpresión de ARHGAP11A mejorado la actividad migratoria de las células cancerosas HCT116.
impacto funcional de ARHGAP11A en la movilización de las células de cáncer de colon humano HCT116
in vivo
y posibilidad de ARHGAP11A como diana terapéutica en cáncer invasivo
Para analizar la función de ARHGAP11A, se generaron líneas celulares HCT116 en el que la expresión ARHGAP11A se redujo de forma estable por shRNA (SH). La reducción de expresión de ARHGAP11A se confirmó tanto a los niveles de proteína (Figura 6B) mRNA (Figura 6A) y. Un ensayo de proliferación de BrdU no mostró diferencias entre células control y SH, lo que sugiere que ARHGAP11A no influye en la proliferación de células intrínseca
in vitro
(Figura 6C). Por otro lado, un
vitro
ensayo de invasión de células en una placa de Matrigel mostró que la capacidad de invasión se redujo significativamente en células SH (Figura 6D). Ahora vamos a examinar el papel de ARHGAP11A en
in vivo
la motilidad de las células cancerosas inoculados. Mediante el uso de técnicas de imagen multifotónica intravital, mostramos que las células SH eran menos móviles que las células de control en tumores inoculadas subcutáneamente, lo que demuestra claramente que ARHGAP11A regula la motilidad de las células cancerosas HCT116 in vivo (Figura 6E, la película S4). También se encontró que las células SH eran menos capaces de migrar fuera de los vasos sanguíneos que eran células de control durante la extravasación de las células del cáncer de sangre residente (Figura 6F). Por último, se investigó el papel de ARHGAP11A en la expansión del tumor
in vivo gratis (Figura 6G). Las células SH ARHGAP11A-desmontables exhibieron una menor progresión a los 28 días en comparación con las células de tipo salvaje (SH#1, 6,47 ± 0,33 mm; SH#2, 6,66 ± 0,32 mm; de tipo salvaje, 9,76 ± 0,82 mm; y SH de control, 9,38 ± 0,97 mm).
(A) Establecimiento de líneas celulares HCT116 desmontables-ARHGAP11A (SH#1,#2). Disminución de la expresión ARHGAP11A mRNA fue confirmada por qPCR. expresión de la proteína (B) ARHGAP11A en el control y las células HCT116 SH-desmontables se evaluó por transferencia Western. ensayo de proliferación (C) BrdU de estas líneas celulares HCT116. Las columnas representan las medias ± s.e.m. (D)
in vitro
ensayo de invasión utilizando placas de cultivo 3D Matrigel. Las columnas representan las medias ± s.e.m. (E)
En vivo
análisis funcionales de las células HCT116 ARHGAP11A-desmontables. Imágenes representativas de Control (
verde
) y ARHGAP-desmontables (
rojo
) HCT116 células inoculadas por vía subcutánea en ratones NOD /SCID (
superior). Una prima 'fusionada imagen y las imágenes extraídas de los canales verde y rojo se muestran. motilidad celular se midió durante 7 h. círculos verdes y rojas representan las células SH#1 HCT116 control y ARHGAP11A-desmontables, respectivamente, y las líneas amarillas muestran sus trayectorias (véase también la película S4). La barra de escala representa 50 micras. (
Baja
) velocidades medias de seguimiento de control de las células y SH. De datos (n = 440 para el control y n = 215 para SH#1) se obtuvieron a partir de células individuales en dos experimentos independientes. Las velocidades de los dos grupos se compararon mediante Mann-Whitney
U
-test (p = 0,0034). Los rangos de mediana y cuartiles de cada grupo se superponen en los gráficos de puntos. (F) La extravasación de control (
verde
) y SH#1 (
rojo
) células HCT116. (
Izquierda
) células verdes se detectaron preferentemente en espacios extravasculares, lo que sugiere una alta potencia para la extravasación. (
Derecho
) número medio de células extravasación por campo visual. Los datos se obtuvieron a partir de 10 campos visuales. (G) en el crecimiento del tumor in vivo de las células HCT116. Las células de control de tipo salvaje HCT116 (
negro círculos) y las células HCT116 tratados con control mezclado shRNA (
Tarjetas telefónicas cuadrados negros), SH#1 (
rojas círculos), y SH#2 (
Tarjetas telefónicas cuadrados rojos) se muestran. Las células cancerosas (1.0 × 10
6/100 l de PBS) se inocularon principalmente en el tejido subcutáneo. tamaños de los tumores se midieron cada semana durante 4 semanas después de la inoculación. Los datos representan las medias ± s.e.m. de cinco experimentos independientes. Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (
p
= 0,0037). (H) Disminución de la expresión de ARHGAP11A en las células HCT116 tratadas con siRNAs dirigidos ARHGAP11A (evaluado por qPCR). (I)
En vivo
siRNA tratamiento de tumores HCT116. HCT116 células de control (5.0 × 10
6) se implantaron en ratones NOD /SCID, y el 1 semana más tarde fueron tratados con PBS (
negro lleno
círculos), atelocolágeno (
negro lleno
triángulos), revueltos siRNA de control, además de atelocolágeno (
negro lleno
cuadrados), o dos siRNAs (# 1 y#2) contra ARHGAP11A más atelocolágeno (
red abiertos
círculos y cuadrados, respectivamente). tamaños de los tumores se midieron semanalmente. Los datos representan las medias ± s.e.m. de cinco experimentos independientes. Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (
p
= 0,0001). (J) Las imágenes de los tumores extirpados el día 35 (
la izquierda). La barra de escala representa 10 mm. (
derecho
) A imágenes representativas de los ratones SCID con células de cáncer de colon humano HCT116, 35 días después del tratamiento con un siRNA (siRNA#1) o con un revueltos RNA duplex (control), junto con atelocolágeno. La barra de escala representa 10 mm.
A continuación, se evaluó el potencial de ARHGAP11A como una nueva diana terapéutica para la inhibición de la progresión del cáncer. El colgajo de piel se extendió y se fija en el soporte plana.