Extracto
Antecedentes
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se sobreexpresa en el 80% de los cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y se asocia con una baja supervivencia. En los últimos años, los inhibidores de EGFR se han probado en la clínica para el CPCNP. A pesar de la aparición de nuevas terapias y su aplicación en la terapia del cáncer, la tasa de supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo del 15%. Para desarrollar terapias más eficaces para el cáncer de pulmón, hemos combinado el anticuerpo anti-EGFR (clon 225) como agente terapéutico molecular con nanopartículas híbridas plasmónicas magnéticos (NP) y contrastados en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) células.
Metodología /Principales conclusiones
La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo con azul de tripano. expresión de la proteína celular se determinó por transferencia Western. C225-PN fueron detectados por microscopía electrónica y microscopía confocal, y la expresión de EGFR mediante inmunocitoquímica. C225-NP exhibió un efecto antitumoral fuerte y selectiva sobre las células de NSCLC que expresan EGFR mediante la inhibición de EGFR mediada por la transducción de señales y la autofagia inducida y la apoptosis en células tumorales. Las imágenes ópticas mostraron especificidad de las interacciones entre las células NSCLC que expresan EGFR C225-NP y. Sin unión de NP-C225 se observó para las células de NSCLC de EGFR-nulo. C225-NP exhibió una mayor eficiencia en la inducción de la muerte celular en comparación con la misma cantidad de anticuerpo C225 libre en las células tumorales con diferentes niveles de expresión de EGFR. Además, en contraste con C225-NP, el anticuerpo C225 libre no indujo la autofagia en las células. Sin embargo, la eficacia terapéutica de C225-NP acercó gradualmente el nivel de anticuerpos libres como se disminuyó la cantidad de anticuerpo conjugado C225 por nanopartículas. Finalmente, adjuntando C225 a NP era importante para producir la muerte de las células tumorales mejorada como la adición de mezcla de C225 libre y NP no demostraron el mismo grado de actividad de la muerte celular.
Conclusiones /Importancia
Hemos demostrado por primera vez el mecanismo molecular de C225-NP indujeron efectos citotóxicos en células de cáncer de pulmón que no son característicos de la terapéutica molecular libre aumentando así la eficacia de la terapia contra el NSCLC
Visto:. Yokoyama T, Tam J, Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) Las nanopartículas magnéticas plasmónicos Híbridos EGFR inducen sinérgicamente la autofagia y apoptosis en células de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10.1371 /journal.pone.0025507
Editor: Sujit Basu, de la Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Agosto, 2011; Aceptado: 5 Septiembre 2011; Publicado: 7 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Yokoyama et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del cáncer otorga R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE en el cáncer de pulmón), CA16672, y Joans el Legado: Unidos contra el cáncer de pulmón. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se sobreexpresa en el 80% de NSCLC y se asocia con una baja supervivencia [1]. En los últimos años, los inhibidores de EGFR se han probado en la clínica para el CPCNP [2] - [6]. Sin embargo, las terapias moleculares emergentes ha producido un modesto incremento en la supervivencia del paciente sobre la supervivencia de los pacientes que reciben tratamientos que no son objeto estándar. Como resultado, la tasa de supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo inferior al 16% [7]. Por lo tanto, se mantienen las de estímulo para desarrollar y probar nuevas terapias. Nuestro enfoque para superar la limitación de las terapias actuales ha sido la combinación de terapias moleculares con el emergente campo de la nanotecnología y la prueba contra el cáncer de pulmón.
Se ha demostrado de manera convincente que la nanotecnología puede aportar soluciones únicas para revolucionar el diagnóstico y el tratamiento de las muchas enfermedades devastadoras como el cáncer [1], [8] - [11]. Un área específica de gran interés es el desarrollo de nanopartículas de imagen molecular específica, la terapia combinada de imagen y /terapia [12] - [13]. Multiplexación de diferentes tipos de nanopartículas (NP) y moléculas de direccionamiento proporciona una plataforma común para múltiples aplicaciones de imágenes con un alto grado de flexibilidad [14] - [15]. Aunque el tratamiento de imágenes y fototérmica con PN plasmónicas plasmónicas e híbridos han sido ampliamente estudiados, los mecanismos moleculares de las interacciones con NP células vivas no se entiende completamente. Recientemente, se demostró que NPs interactuar con las células de una manera dependiente del tamaño con 40-50 NPs nm que muestra la mayor captación celular [16]. Sin embargo, en este estudio los efectos de señalización molecular tras la absorción de los PN no se investigó
.
En el presente estudio hemos combinado el anticuerpo anti-EGFR (clon 225) como agente terapéutico molecular con NP magnéticas plasmónicas híbridos y estudiado los mecanismos moleculares interacciones entre NP EGFR (225-NP) en el rango de tamaño de 40-50 células no pequeñas de cáncer de pulmón de células humanas (CPNM) nm y. El 225-NP consiste en un núcleo de hierro paramagnético que está rodeado por una capa de oro y está funcionalizado con anticuerpos monoclonales anti-EGFR (clon 225). Utilizamos las células de cáncer de pulmón humano con diferentes niveles de expresión de EGFR y cambió la composición de la superficie de la PN para dilucidar los mecanismos de estas interacciones. Nuestro objetivo inicial era usar C225-NP como un agente de imagen dirigido a EGFR overexpressing células de cáncer de pulmón. Inesperadamente, encontramos que el C225-NP fue citotóxica selectiva para las células de cáncer de pulmón que sobreexpresa EGFR más allá de lo que se esperaría a partir del anticuerpo no conjugado. Nuestros resultados proporcionan una nueva dirección hacia el aumento de la potencia de la terapéutica moleculares específicos a través de su disposición tridimensional a escala nanométrica utilizando NPS como plantillas.
Resultados y Discusión
225-NP-tratamiento regula EFGR- vía de señalización y matar a las células tumorales de pulmón con más eficacia que las células normales
en primer lugar, se analizó la expresión de EGFR en varias líneas celulares de NSCLC humanos que son de tipo salvaje (H1229) (fosforilada y total), mutado y se sobreexpresa (HCC827, H1975 , H3255), amplificado (H1819) o nula (H520) para EGFR y en comparación con la expresión de EGFR en fibroblastos normales de pulmón (MRC-9 y WI38) y células normales humanas bronquiales epiteliales (NHBE) por transferencia Western. Tanto EGFR total y fosforilada (pEGFR) se detectó expresión en todas las líneas celulares ensayadas excepto por H520 células que son nulos para EGFR. Sin embargo, los niveles de expresión pEGFR variaron entre las líneas de células con alta expresión detectado en HCC827, H1819 y H3255 células (Figura 1A). H1299 células tenían un nivel de expresión intermedio de pEGFR. En contraste, las células las células normales (NHBE, MRC-9, y WI38) y H1975 expresa bajos niveles de pEGFR. El tratamiento con C225-NP significativamente (P = & lt; 0,05) disminuyó la viabilidad de las células de cáncer de HCC827 EGFR positivo, H1299, H1819 y comparación con el tratamiento con el control de IgG-NP (Fig 1b.). Los efectos inhibitorios mediados por C225-NP sin embargo variaron entre las líneas celulares de cáncer de prueba y fue independiente del estado mutacional del EGFR. No se observaron efectos inhibidores en células H520 tratadas con C225-NP en comparación con las células tratadas-NP IgG. Entre las células normales, MRC-9, pero no NHBE células mostraron algunos efectos inhibidores cuando se tratan con C225-NP y comparación con el tratamiento IgG-NP (Figura 1b). Sin embargo, los efectos inhibidores observados en tratado con C225-NP MRC-9 (9%) las células fueron menos de los efectos inhibitorios observados en las células tumorales tratadas-C225-NP (14-18%).
(una ) La expresión de EGFR fosforilado y total en las células normales y NSCLC. (B) la muerte celular en respuesta a EGFR C225-NP en NSCLC y las células normales. Los resultados mostrados son las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. * P-valor. & Lt; 0,05 frente a IgG-NP en H1299, HCC827 y H1819 células
A continuación, se evaluó la expresión de la proteína del EGFR fosforilado y EGFR asociadas a moléculas en el tumor y las células normales después de señalización el tratamiento con IgG o C225-NP. Se observó reducción de expresión de fosforilados-EGFR, -AKT, -p38MAPK, y p44 /42MAPK después del tratamiento C225-NP en HCC827 y H1299 células en comparación con las células tratadas con el control de IgG-NP (Figura 2). En las células H520 la expresión de todas estas proteínas se mantuvo sin cambios cuando se trató con 225-NP y en comparación con las células tratadas con IgG-NP (Figura 2). El análisis inmunohistoquímico mostró expresión pEGFR se redujo notablemente (35%;
P Hotel & lt; 0,05) en las células HCC827 a los 30 y 60 minutos después del tratamiento con C225-NP en comparación con la expresión en las células tratadas pEGFR-IgG-NP (8 -12%; Figura S1). En las células normales (MRC-9 y NHBE), no hubo reducción marcada en pEGFR o las proteínas asociadas analizados a partir de IgG-NP y NP-C225-tratamiento (Figura 2).
efectos inhibitorios de C225- NP en EGFR fosforilado y las moléculas de señalización corriente abajo en el cáncer de pulmón humano y células normales. tratamiento C225-NP reduce la expresión de (P) formas fosforiladas de EGFR, Akt, MAPK p38 y P44 /42 MAPK en las células tumorales de EGFR-positivo, pero no en las células normales. No hubo ningún efecto sobre las células tumorales H520-EGFR nula.
225-NP-tratamiento produce una mayor actividad antitumoral que el C225 y NP tratamiento solo
A continuación, se determinó la contribución de la componentes individuales que constituyen el C225-NP en los efectos inhibidores del crecimiento observados en las células tumorales. las células tumorales tratadas con HCC827 aufe solo, y libre de C225-anticuerpo solo reducen la viabilidad celular por 12 a 14% en las células de control no tratadas, mientras que el tratamiento de combinación con conexión C225-anticuerpo más aufe reduce el número de células en un 22% (Figura 3a). Curiosamente, C225-NP reduce en gran medida el número de células (48%; P & lt; 0,05) que era notablemente mayor que el efecto inhibidor producido por los componentes individuales (225 anticuerpos, aufe) que indican la conjugación de anticuerpos C225 a NP aumenta la actividad contra el cáncer de C225- PN. A fin de validar nuestros resultados se compararon los efectos inhibidores de anticuerpo C225 con el clon 29.1 anticuerpo. Ambos anticuerpos Clone 225 y Clon 29.1 se unen a EGFR. Sin embargo, a diferencia de 29,1 Clone Clone 225 se une a un residuo de hidrato de carbono en la porción externa del EGFR y no inhibe EGF mediada por EGFR de señalización [17]. El tratamiento de HCC827 células con C225-NP produjo el mayor efecto inhibidor (~42%; P & lt; 0,05; Figura 3b) que fue significativamente mayor en comparación con el efecto inhibidor producido por el clon 29.1-NP (~ 14%) y otros tratamientos de control (~ 7% -15%). Estos resultados demuestran la conjugación del clon 225 anticuerpos a NP aufe confiere una propiedad única que potencia la actividad antitumoral contra las células cancerosas EGFR-positivos. Similar a nuestros hallazgos, la conjugación de anticuerpo anti-ErbB2 al oro esférica NP demostró una mayor destrucción de células de cáncer de mama en comparación con anticuerpo anti-ErbB2 y NP sola [18]. En este estudio se investigó la citotoxicidad como una función del tamaño de NP. Sin embargo, el estudio no abordó el mecanismo molecular para la destrucción de células tumorales mejorada. La importancia de la densidad superficial de los anticuerpos unidos a nanopartículas también no fue analizado.
(a) HCC827 células tratadas con C225-NP demostró significativo efecto matando a tumor en comparación con el tratamiento con aufe, 225 y anticuerpo aufe más C225. * El valor P es & lt; 0,05. (B) Comparación de los efectos inhibitorios producidos por 29.1-NP con C225-NP en HCC827 células. C225-NP tratamiento produjo un mayor efecto matar que hizo el tratamiento 29.1-NP en comparación con otros grupos de tratamiento. * P es el valor. & Lt; 0,05
225-NP-tratamiento induce la autofagia y apoptosis en células tumorales EGFR-positivo, pero no en las células tumorales EGFR-negativos
A continuación, para determinar la mecanismo molecular de la inhibición del crecimiento tumoral mediada por C225-NP se realizó el análisis de citometría de flujo en HCC827 tratados con NP-C225 y -H520 células. Como se muestra en la Figura 4a, la población sub-G1, que indica el porcentaje de células apoptóticas, el aumento de una manera dependiente de la dosis después del tratamiento con C225-NP (9% -20%) en HCC827 células en comparación con el control de IgG-NP células tratadas (4% -8%). tratamiento C225-NP aumentó notablemente el número de células en la población sub-G1 que hizo el tratamiento con Clone 225 anticuerpo solo a una concentración equimolar (Figura S2). Como se esperaba, no hubo un aumento en el número de células en la población sub-G1 en células H520 tratadas NP-C225 en comparación con otros tratamientos (Figura 4a). Por lo tanto, C225-NP inducido eficazmente la apoptosis en EGFR que expresan HCC827 células, pero no en las células H520 nula EGFR.
(a) Porcentaje de células de NSCLC tratados con diferentes dosis (0,6, 1,2 y 2,4 × 10
10 partículas) de IgG-NP o NP-C225 de 72 horas que estaba en el sub-G
1 fase del ciclo celular. Este porcentaje se determinó mediante análisis de ADN por citometría de flujo. Las células no tratadas y células tratadas con anticuerpo C225 solo sirvieron como control. Se observó un aumento dependiente de la dosis en el número de células en fase HCC827 subG1 en ambos tratamientos IgG-NP y C225-NP. Sin embargo, el aumento en el número de células en subG1 fue significativamente mayor en el tratamiento C225-NP que en IgG-NP (
* P & lt; 0,05). No hubo un aumento marcado en la fase subG1 en células H520 entre IgG-NP y C225-NP-tratamientos. (B) Detección de puntos GFP-LC3 indicativos de la autofagia en las células de NSCLC que no fueron tratados o tratados con anticuerpo C225, IgG-NP o C225-NP (3 × 10
9 partículas) durante 72 horas en la cámara de diapositivas.
Barra de escala = 50 micras gratis (c) La cuantificación del número de células con GFP-LC3 puntos en las células NSCLC tratados y no tratados. El número de células con puntos GFP-LC3 era mayor en las células tratadas HCC827-C225-NP en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. En H520 células no hubo un incremento en el número de puntos GFP-LC3 cuando se tratan con C225-NP y en comparación con todos los otros grupos de tratamiento. Los resultados mostrados son las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. * P-valor. & Lt; 0,05 vs control no tratado, el anticuerpo C225, y IgG-NP en células HCC827
Recientemente, se ha demostrado que los puntos cuánticos inducen la autofagia dependiente del tamaño en las células madre mesenquimatosas humanas [19]. Por lo tanto, hemos examinado si la autofagia se produjo en las células NSCLC después del tratamiento con C225-NP. La proteína fluorescente (GFP) vector de expresión-etiquetados verde de LC3 es una herramienta útil para la detección de la autofagia [20]. En microscopía de fluorescencia, las células HCC827 transfectadas con GFP-LC3 mostraron distribución difusa de GFP-LC3 para las células no tratadas, y las células tratadas con el clon 225 de anticuerpo solo y con IgG-NP, mientras que las células tratadas con C225-NP mostraron puntos puntiformes GFP-LC3 indicativo de vacuolas autofágicas (Figura 4B). El porcentaje de células con puntos puntiformes GFP-LC3 aumento después del tratamiento con C225-NP por HCC827 células (Figura 4c; P & lt; 0,05). La inducción de la autofagia determinado por GFP-LC-3 puntos también se incrementó notablemente en C225-NP tratados con células H1299 en comparación con otros grupos de tratamiento (Figura S3). Por el contrario, la cantidad de puntos puntiformes GFP-LC3 no fue diferente en C225-NP tratados H520 células y los grupos de control (Figura 4b, c).
A continuación examinó las células tratadas con C225-NP por la presencia y el momento de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión y LC3 expresión, que son marcadores moleculares indicativos de las células sometidas a apoptosis y la autofagia, respectivamente. PARP división fue evidente a las 24 horas después del tratamiento con IgG-NP y C225-NP de HCC827, pero no H520 células; sin embargo, la escisión de PARP fue mayor con C225-NP que con el control-NP en HCC827 células (Figura 5a). Existe la proteína LC3 en dos formas celulares, LC3-I y LC3-II. LC3-I se convierte a LC3-II por la conjugación de fosfatidiletanolamina, y la cantidad de LC3-II está estrechamente relacionada con el número de autofagosomas [21]. En HCC827 células, el tratamiento con C225-NP aumentó en gran medida la cantidad de LC3-II de una manera dependiente del tiempo (Figura 5a). Además, la evidencia reciente sugiere que la acumulación de LC3-II se representa con mayor precisión en el flujo autophagic en presencia de inhibidores lisosomales [22]. En presencia de los inhibidores de proteasa E-64-d y pepstatina A, endógeno LC3-II aumentó después del tratamiento con IgG-NP y C225-NP en HCC827 células (Figura 5b). Sin embargo, el aumento de LC3-II fue mayor en las células tratadas con C225-NP de IgG-NP. Aumento de LC3-II en presencia de inhibidores de la proteasa también se observó en las células H1299 tratadas con C225-NP (datos no mostrados). En contraste, la cantidad de LC3-II no fue mayor en células H520 durante el tratamiento de 72 horas con C225-NP en comparación con el tratamiento con IgG-NP (Figura 5a). Estos resultados indicaron que C225-NP causado tanto la apoptosis y la autofagia al mismo tiempo en células de NSCLC de EGFR-expresado. Sorprendentemente, la autofagia también se observó en las células tratadas-NP IgG aunque menos que la observada en las células tratadas-NP C225 y tenían menos efecto en la destrucción de células tumorales. Se postula que el umbral de la autofagia en las células tratadas con C225-NP es más fuerte debido a la presencia de anticuerpos anti-EGFR y actúa como un activador de la muerte conduce a la activación de la cascada de caspasas y la muerte celular apoptótica. En contraste, la autofagia en las células tratadas-NP IgG probablemente sirve como una señal de supervivencia y protege de la muerte celular. Pueden existir diferencias adicionales y en este momento estamos investigando el mecanismo en el laboratorio
.
(a) Las proteínas celulares se lisaron en el tiempo indicado después del tratamiento con partículas de IgG-NP o NP-C225 (0,6 × 10
10 partículas) y se sometieron a transferencia de Western. En HCC827 pero no en las células H520, el aumento de escisión de PARP y LC3-II se observó a las 48 h y 72 h después del tratamiento con C225-NP y cuando se compara con el tratamiento con IgG-NP y el control sin tratar. Las intensidades de la cantidad de bandas de LC3-II fueron semi-cuantificados por el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (b) células HCC827 fueron tratados con IgG-NP o C225-NP durante 68 horas, las células fueron cultivadas con o sin inhibidores de la proteasa [10 mg /ml e-64-D y 10 mg /ml de pepstatina a (BIOMOL Internacional LP, Plymouth Meeting, PA)] durante 4 horas. Las proteínas celulares se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti-LC3. los niveles de proteína LC3-II se incrementaron en presencia de inhibidores de la proteasa en todos los grupos que indican la ocurrencia de la autofagia. Las intensidades de la cantidad de bandas de LC3-II fueron semi-cuantificados por el software ImageJ (National Institutes of Health).
Para analizar la asociación entre C225-NP y la autofagia, se determinó la localización de C225 -NP y vacuolas autofágicas, utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). HCC827 células tratadas con el clon 225 de anticuerpos IgG o NP-exhiben muy pocas características autofágicos, mientras que se observaron muchas vacuolas autofágicos después del tratamiento con C225-NP (Figura 6;
P Hotel & lt; 0,05). Curiosamente, mientras que la mayor parte del C225-PN se observaron en el interior de la autofagia y vacuolas vacías, algunas PN se observaron también en el interior de los núcleos. Similar a TEM análisis, la microscopía confocal también reveló algunas NPs dentro de los núcleos en las células tratadas-NP C225 (Figura 7). Aunque podríamos demostrar presencia de NPs en el núcleo de las células que no cuantificar el número de NPs presentes en el interior del núcleo de la célula. Esto es debido a algunas de las limitaciones que existen con TEM y técnicas de microscopía confocal. Por ejemplo, la cuantificación del porcentaje de localización nuclear requeriría análisis de múltiples células a través del volumen celular total que no es práctico el uso de la técnica de resolución tan alta como TEM. Three dimensional localización de NPs con microscopía confocal se complica por el hecho de que después de la absorción celular de los NPs se acumulan en el espacio perinuclear. Por lo tanto, la resolución óptica no es suficiente para NPs separados que están situados en la proximidad de la membrana nuclear en el citoplasma y en los lados nucleares. Además, la microscopía confocal de objetos muy brillantes como el NPS puede dar lugar a una fuerte salida de señal de enfoque que puede conducir a una interpretación errónea de la distribución tridimensional de las nanopartículas. Las limitaciones de la localización tridimensional de NPs utilizando microscopía óptica confocal se han demostrado recientemente en [23], donde la microscopía confocal sobreestimado groseramente la absorción citosólica de puntos cuánticos.
Fotomicrografías
electrónica que muestra la ultraestructura de una célula, incluyendo el núcleo (N), de HCC827 células tratadas con el anticuerpo C225 (0,065 g /ml), IgG-NP, o C225-NP (0,6 × 10
10 partículas) durante 72 hrs. (I) Las células no tratadas (ii) C225 células tratadas con anticuerpo (iii) las células tratadas con IgG-NP (iv) las células tratadas con C225-NP (v) una vista ampliada de la zona en caja en (iv). La flecha indica NP, y la punta de flecha indica autofagosomas que incluye el material residual y NP en el citoplasma (vi) C225-NP detectada en el interior del núcleo. La flecha indica NP en el núcleo.
Barra de escala = 1 m.
(Vii) autofagosomas se cuantificaron, tal como se describe en Materiales y Métodos. * P-valor. & Lt; 0,05 frente al control, el anticuerpo C225 e IgG-NP durante 48 y 72 horas
(fila superior) Confocal imágenes muestran DAPI manchadas núcleos (azul) y C225-NP (roja ). Las flechas en el "medio" punto de columna para C225-NP localizadas en un núcleo. Las flechas en las columnas identificadas como "superior" e "inferior" punto a la misma área en el plano xy del núcleo, sino en lugares por encima y debajo de la media del núcleo, respectivamente. Tanto en el "fondo" imágenes "de arriba" y, las flechas ya no están apuntando a los puntos rojos que indican que las manchas rojas en la imagen "medio" son de hecho dentro del núcleo. (Fila inferior) de la historieta que indica la posición z de cada imagen dentro del núcleo, donde la línea horizontal de color rojo representa la posición relativa profundidad dentro del núcleo que se tomaron las imágenes de sección transversal (fila superior) a.
barra de escala = 10 micras
.
En estudios futuros tenemos la intención de cuantificar el porcentaje de PN presentes en el núcleo por tridimensional de rayos X de tomografía de imágenes de células enteras con suficientes tamaño de la muestra y de la resolución [24] y determinar la contribución de los PN nucleares en los eventos de señalización celular.
C225-NP es específico para las células tumorales que expresan EGFR y pre-tratamiento con el anticuerpo C225 abroga destrucción de células tumorales mediada por C225-NP
Se utilizó la microscopía de campo oscuro de reflectancia para caracterizar la especificidad de las interacciones C225-NP y la viabilidad de la detección óptica de las células de cáncer de pulmón. reflectancia imágenes de campo oscuro mostraron una alta concentración y la internalización de C225-NP en HCC827 células después de 24 horas de tratamiento (Figura 8). En contraste, se observó poca o ninguna captación en HCC827 células tratadas con IgG-NP. En H520 células, no hay diferencia en la unión y la captación de NP fue observada entre las células tratadas con C225-NP y NP-IgG (Figura 8).
HCC827 y células H520 sembradas en portaobjetos de cámara se trataron con IgG-NP o C225- NP (0,2 × 10
10 partículas). Las células no tratadas sirvieron como control. Al se lavaron las células después de 24 horas de tratamiento, fijas y las imágenes fueron tomadas con un microscopio de campo oscuro. La barra de escala es de 50 micras. Unión selectiva y la absorción de C225-NP, pero no se observó IgG-NP en HCC827 células. En las células H520 no hubo absorción de unión y de C225-NP en comparación con IgG-NP.
Para determinar la especificidad de la unión PN-C225 y la absorción, se llevaron a cabo experimentos de bloqueo. HCC827 células fueron tratadas previamente con el exceso de anticuerpo libre Clon 225 antes del tratamiento con IgG-NP o NP-C225. imágenes de reflectancia de campo oscuro mostraron que la unión e internalización de C225-NP se bloqueó específicamente en presencia de anticuerpo Clone libre de 225 en comparación con células que no fueron tratadas previamente con el anticuerpo (Figura 9a). Nos determina además si el bloqueo del receptor de EGF afecta a la citotoxicidad inducida-C225-NP. se observó atenuación de la citotoxicidad mediada por C225-NP en presencia de anticuerpo libre Clone 225 que fue acompañado por una marcada reducción en la mediada por C225-NP apoptosis y la autofagia (Figura 9b, 9c). También se obtuvieron resultados similares cuando las células H1299 se trataron con C225-NP en presencia de Clone 225 anticuerpo (Figura S4 a-c). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la C225-NP interactúa selectivamente con células de NSCLC que expresan EGFR, y producir molecular específica mejorado efecto terapéutico en las células NSCLC que expresan EGFR.
(a) La columna derecha muestra imágenes de células HCC827 pre-tratados con anticuerpo C225 (2 mg /ml) durante 15 min antes de la incubación con IgG-NP (fila del medio) o C225-NP (fila inferior). Las células que se muestran en la columna de la izquierda no se trataron con anticuerpos C225 libres. Los portaobjetos se lavaron, se fijaron y utilizando imágenes de microscopía de campo oscuro. La unión y la captación de C225-NP fue completamente inhibida en presencia de anticuerpo C225. En las células tratadas con IgG-NP anticuerpo C225 no tuvo ningún efecto. La barra de escala es de 50 micras. (B) efectuar la inhibición de la citotoxicidad de C225-NP por pre-tratamiento con el anticuerpo C225 libre. Después del tratamiento con /sin anticuerpo C225 (0,065 g /ml) durante 6 horas, las células se trataron con NP no conjugado (oro-hierro: aufe), IgG-NP o C225-NP durante 66 horas adicionales. Se contó el número de células viables como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostrados son las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. * Valor de p & lt; 0,05 frente a aufe solo, anticuerpo C225 solo, IgG-NP o anticuerpo C225 C225 plus-NP. (C) los efectos de inhibición de la apoptosis inducida por C225-NP y la autofagia de pre-tratamiento con el anticuerpo C225. Las proteínas celulares se lisaron después del tratamiento con C225-NP (0,6 × 10
10 partículas) durante 66 horas en la presencia o ausencia de anticuerpo C225 libre (0,065 g /ml). Las proteínas se separaron por 7,5% o 15% de SDS-PAGE, y a inmunotransferencia con anticuerpos anti-PARP y anti-LC3. El anticuerpo anti-β-actina se utilizó como control para la carga de proteínas y transferencia. Las intensidades de la cantidad de bandas de LC3-II se cuantificaron por software ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud). activación de la apoptosis y la autofagia C225-NP-mediada como se indica por la escisión de capase-3, PARP y LC3-II, respectivamente, fue abrogada marcadamente en la presencia del anticuerpo C225 libre. Todas las imágenes de campo oscuro fueron adquiridos utilizando Leica, DM6000 microscopio equipado con un 20 × objetivo de campo oscuro y Xe-lámpara de iluminación de luz blanca.
Densidad de 225 anticuerpo unido a NP es importante para NP-225 de células tumorales mediada por matar
Para investigar la dependencia de la eficacia terapéutica de los NPs de la densidad de anticuerpos Clone 225 en la superficie NP que co-conjugado Clone 225 y el anticuerpo IgG no específica en relaciones de 01:00, 1:01, 1:03, 1:10, 1:40 y 0:1. La cantidad total medio de anticuerpos por NP se mantuvo la misma, por lo tanto, la densidad de anticuerpos Clone 225 disminuyó gradualmente a medida que la cantidad relativa de la IgG no específica se incrementó. Por ejemplo, la relación de 01:00 correspondió a los conjugados originales C225-NP que tenían la mayor densidad de anticuerpos Clone 225 mientras que la relación 0:1 correspondió a NPs con anticuerpos IgG no específicas solamente. La densidad relativa de anticuerpos en la superficie de NPs se confirmó usando un ensayo fluorescente (ver Materiales y Métodos).
El tratamiento con C225-NPs (relación 1:00) significativamente (
P & lt
; 0,05) disminución de la viabilidad de las células HCC827 y H1299-EGFR expresado. Sin embargo, cambiando la relación de anticuerpo C225 para controlar anticuerpo 1:00-1:40 dio lugar a la atenuación de la citotoxicidad en ambas líneas celulares (Figura 10a). Capacidad para inhibir la expresión pEGFR e inducir la autofagia también se redujo en las células HCC827 y H1299 con la disminución de la cantidad relativa de Clone 225 anticuerpos en la superficie de NP (figura 10b, c). La disminución observada en la eficacia terapéutica del complejo NP-anticuerpo con la disminución de la densidad del anticuerpo terapéutico sobre la superficie de NP se puede atribuir a los cambios en la multivalencia del complejo de anticuerpo /NP. informes de la literatura anteriores han demostrado que el aumento de la valencia de una macromolécula puede resultar en una mayor afinidad de unión a moléculas diana [25], [26]. Este efecto mejora multivalente fue explotada para aumentar la eficacia de la inhibición de la toxina a través de la síntesis de inhibidores de la polivalentes [27], [28]. También se demostró que una densidad óptima de ligandos en la superficie de los polímeros puede aumentar la internalización de los ligandos en las células [29]. células H520 mostraron poca o ninguna citotoxicidad cuando se tratan con NPs con relaciones variables de anticuerpos (datos no mostrados)
(a) la inhibición del crecimiento celular en respuesta al tratamiento con NP que había variar la relación de (01:00;. 1 :1; 1:03; 1:10; 1:40; 0:1) del C225 e IgG conjugado co-NP a la superficie. Las células (HCC827, H1299 y H520) se trataron con NP (0,6 × 10
10 partículas) durante 72 horas. Se contó el número de células viables como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostrados son las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. * Valor de p & lt; 0,05 para C225-NP (01:00) vs NP con 1:01-1:40 de 0:1 y NP en células HCC827 y H1299. células H520 no mostraron ningún efecto inhibitorio cuando se trataron con NP de de diferentes proporciones. (B) El número de puntos de GFP-LC3 inducidos por C225-NP (01:00) -tratamiento de HCC827 y las células H1299 disminuyó con los cambios en la relación de anticuerpo C225:IgG. Los resultados mostrados son las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. * Valor de p & lt; 0,05 para C225-NP (01:00) vs 1:01-uno y cuarenta y 0:1 NP en células HCC827 y H1299. (C) C225-NP (01:00) mediada por la reducción en el EGFR fosforilado y p44 /expresión 42MAPK fue abrogada en las células H1299 HCC827 y cuando son tratados con SN de 1:01 y la relación de 1:40.
Estos resultados demuestran que los NPs producen el mayor efecto terapéutico cuando se recubrieron sólo con el anticuerpo C225. Sustitución de la cantidad de anticuerpo C225 con el anticuerpo de control no específico en la superficie de NP resultó en actividad anticancerígena reducida. Además, este estudio también demuestra la especificidad de la destrucción de células tumorales mediada-225-NP.
En conclusión, hemos demostrado que EGFR C225-PN se toman selectivamente por las células de NSCLC que expresan EGFR y produjimos una mayor antitumoral actividad mediante la inducción de tanto la apoptosis y la autofagia. La actividad de destrucción de células tumorales mejorada producida por C225-NP se atribuye a las propiedades únicas conferidos por la conjugación de anticuerpo clon 225 con aufe NP. Para nuestro conocimiento hemos demostrado por primera vez que la conjugación de los nanomateriales plasmónicas con biológicos tales como Clone 225 resultados en las propiedades antitumorales sinérgicos acompañados por la inducción de la autofagia y apoptosis. Esta investigación abre un nuevo paradigma en el desarrollo de agentes terapéuticos que se dirigen hacia la capacidad de controlar la disposición a nanoescala de múltiples Abs en la superficie de las partículas para mejorar la focalización y la terapia.
Los últimos estudios preclínicos demostraron que la combinación de EGFR de tres experimentos independientes. de tres experimentos independientes.