Extracto
Hemos ideado una terapia basada en la desmetilación de aerosol para lograr la eficacia terapéutica en premalignas o lesiones in situ de cáncer de pulmón, sin toxicidad sistémica. regímenes óptimos de azacitidina en aerosol (Aza) fueron diseñados y utilizados en los modelos ortotópico humanos no pequeñas de pulmón de células de xenoinjertos de cáncer. La eficacia terapéutica y la toxicidad de aerosol Aza se compararon con Aza administrado por vía intravenosa. Hemos observado que el 80% de las gotitas del aerosol Aza mide ~0.1-5 micras, lo que resultó en la deposición en las vías respiratorias bronquiales inferiores. Un modelo animal que phenocopies carcinogeneisis campo en los seres humanos se desarrolló por inoculación intratraqueal de las células de cáncer de pulmón humano en ratones, lo que resulta en su distribución a lo largo de todo el espacio de las vías respiratorias. Aerosol Aza prolongó significativamente la supervivencia de ratones portadores de tumores de pulmón endo-bronquial. El tratamiento con aerosol no causó ninguna toxicidad pulmonar detectable o toxicidad sistémica. Un estudio de pre-farmacocinético en ratones demostró que la deposición pulmonar del aerosol Aza fue significativamente mayor que la vía intravenosa. Los tumores de pulmón se resecaron después se analizaron tratamiento con aerosol y los niveles de metilación de 24 promotores de genes supresores de tumor-relacionados con el cáncer de pulmón. Aerosol Aza redujo significativamente el nivel de metilación en 9 de estos promotores y vuelto a expresar varios genes probados. En conclusión, aerosol Aza a dosis no citotóxicas parece ser eficaz y los resultados en la desmetilación del ADN y el gen supresor de tumor re-expresión. El índice terapéutico de aerosol Aza es & gt; 100 veces más alta que la de Aza intravenosa. Estos resultados proporcionan un fundamento preclínico para una fase I de ensayos clínicos de aerosol Aza que debe iniciarse a nuestra Institución
Visto:. Qiu X, Y Liang, Sellers RS, Pérez-Soler R, Zou Y (2014) Aerosol Inhibe la azacitidina cánceres de pulmón ortotópico en ratones a través de su desmetilación del ADN y el gen Efectos de reactivación. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10.1371 /journal.pone.0109874
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Marzo, 2014; Aceptado: 12 de septiembre de 2014; Publicado: 27 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio con el apoyo de una beca NIH 5R01CA154755. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón reclama 1,4 millones de vidas cada año (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html~~number=plural) [1], [2]. El cáncer de pulmón se produce como resultado del daño acumulativo en el epitelio bronquial causada por agentes carcinógenos inhalados. Debido a que el daño acumulativo afecta a toda la vía aérea, el epitelio de las vías respiratorias dañadas es propenso a desarrollar tumores primarios adicionales durante la vida de un individuo [3]. Todos no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) se originan en el epitelio bronquial que cubre las vías respiratorias grandes o pequeños, dando lugar a tumores centrales o periféricos. Por ejemplo, los carcinomas de pulmón de células escamosas con frecuencia se originan en el centro de grandes bronquios, los adenocarcinomas de pulmón suelen desarrollar periféricamente en las vías respiratorias más pequeñas, grandes y carcinomas de pulmón de células pueden surgir en cualquier ubicación. Sin embargo, todos los tumores se originan a partir de células epiteliales de las vías respiratorias transformadas. Por lo tanto, la intervención terapéutica selectiva para los tumores confinados a las vías respiratorias debería inhibir o retrasar su formación sin causar toxicidad sistémica efectiva [4] - [7]. Por desgracia, no hay terapias dirigidas específicamente el epitelio bronquial están disponibles actualmente
El aumento de los conocimientos en el campo de la epigenética y la carcinogénesis ha llevado a la conclusión de que los cambios epigenéticos aberrantes juegan un papel importante en la carcinogénesis pulmonar.; Además, estos cambios se mantienen a través de todo el proceso de progresión de la enfermedad [8], [9]. Por ejemplo, el silenciamiento de genes supresores de tumores (ETG) por hipermetilación aberrante se ha encontrado a desempeñar un papel importante en la iniciación del cáncer y el desarrollo en múltiples tipos de cáncer [10] - [19]. TSG hipermetilación del promotor también se ha demostrado que se correlaciona con un mal pronóstico y la resistencia a la quimioterapia [20] - [26]. En particular, todas las lesiones genéticas en los cánceres de pulmón, incluyendo mutaciones de p53 y K-ras, podrían ser la consecuencia de los cambios epigenéticos aberrantes [10], [27], [28]. Los cambios epigenéticos son reversibles eventos cancerígenos [10], [29]. El cáncer de la especificidad de estos cambios epigenéticos los hace objetivos únicos para terapias epigenéticos específicos [30]. Por lo tanto, la hipótesis de que, al dirigirse el epitelio de las vías respiratorias con un agente de desmetilación por la administración en aerosol, podemos afectar favorablemente la historia natural del cáncer de pulmón.
Anteriormente hemos observado que la hipermetilación de la región promotora del gen RASSF1 en humanos línea celular de NSCLC H226 puede ser revertida por el agente de desmetilación azacitidina (AZA). Se demostró además, el uso de un modelo animal clínicamente relevante desarrollado por nuestro laboratorio, que la inyección intratraqueal (una forma similar de la administración local como aerosol) de Aza a dosis sub-tóxicos puede aumentar la supervivencia de los ratones de forma ortotópica implantado H358 y H460 de cáncer de pulmón [31 ], [32]. Este modelo animal clínicamente relevante fue la prueba de concepto de que las vías respiratorias terapia dirigida epigenética puede tener una ventaja en la prevención y el tratamiento de CPCNP en estadio temprano. Aquí nos informe sobre la eficacia de aerosol Aza en el tratamiento de modelos de xenoinjertos de NSCLC humanos ortotópico en ratones, así como la eficacia de la terapia en la desmetilación de promotores específicos de ETG en el tejido tumoral. Para dilucidar los mecanismos terapéuticos epigenéticos, hemos resecado tejidos del tumor en los animales xenotransplantes tratados con aerosol Aza, analizó el estado de metilación de los promotores de las ETG relacionados con el cáncer 24 de pulmón, y determinó los niveles de expresión de proteínas de los genes que mostraron significativa desmetilación del promotor después de aerosol Aza tratamiento.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer humano H226, H358, H460 y se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) y se mantiene en una incubadora a 37ºC con 5% de CO
2 y 95% de aire.
Animales
Hombre y ICR hembra y ratones desnudos atímicos, de 6-8 semanas de edad (Harlan) fueron alojados en las instalaciones de animales en el Albert Einstein College of Medicine. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El (Número de protocolo: 20130312) protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Albert Einstein College of Medicine. En el estudio de supervivencia, se observaron diariamente los animales. Se utilizaron puntos finales durante este estudio: moribundas fueron sacrificados humanitariamente. Se han utilizado dos criterios para identificar a los animales moribundos basado en el protocolo de uso de los animales: 1) ratón tiene dificultad para respirar, comer o beber; 2) un ratón pierde peso corporal ≥15% en 4 días. Los ratones fueron sacrificados por CO2 en una cámara de inhalación seguido por desangramiento. La anestesia se utiliza para minimizar las molestias durante las inyecciones intratraqueal.
inyección intratraqueal
Para la inyección intratraqueal (IT), se inyectó un bolo de células en suspensión o fármaco en la tráquea. El procedimiento utilizado para la inyección se ha descrito previamente por nosotros [33]. En pocas palabras, los ratones se anestesiaron con un vaporizador de isoflurano al 2,5% de isoflurano entregado por 2,0 PSI de oxígeno e inmovilizados mediante un dispositivo de sujeción. La boca se abre con una pinza y un pequeño dispositivo de luz tubular se inserta en la boca para localizar la tráquea, si es necesario. Una aguja de alimentación 22 G unida a una jeringa de 1 ml que contiene la suspensión de células o solución de fármaco se inserta en la tráquea. Aproximadamente a continuación, se inyecta 3 l peso de la solución /g corporal por vía intratraqueal. El ratón se libera del dispositivo de contención a la finalización del procedimiento y observó hasta la recuperación completa de la anestesia.
modelos de xenoinjertos de cáncer de pulmón endobronquial ortotópico
ratones desnudos atímicos se anestesiaron como se ha descrito anteriormente y humana células de cáncer de NSCLC en suspensión se inocularon cuidadosamente en la tráquea (aproximadamente 2-4 x 10
6 células /ratón) utilizando el método descrito anteriormente. En estos modelos, múltiples tumores crecen dentro de las vías respiratorias pulmonares. La vida útil de los animales se correlaciona con la carga tumoral, que está relacionada con el tamaño del inóculo.
Aerosol formulación
azacitidina (Sigma) se disolvió en solución salina normal estéril en 10 mg /ml justo antes de la dosificación. El tamaño aerodinámico de aerosol Aza se determinó con el método de extrusión-precipitación usando una 7-Etapa Cascade Impactor vinculado al sistema de nebulizador PARI de las instrucciones del fabricante [34]. la administración en aerosol. El aerosol se generó usando el compresor PARI personal de un nebulizador y un sistema LC Star. La tasa de generación de aerosol fue aproximadamente 0,25 ml /min. Se utilizó un sistema de exposición sólo para la nariz (CH Technologies Inc. Westwood, NJ) vinculado al sistema de aerosol del PARI en una campana química cerrado para la administración en aerosol a los ratones. El tiempo de administración en aerosol (min) (T) fue estrictamente controlada. La dosis de aerosol depositada en los pulmones (mg /m
2) (D) se calculó multiplicando el tiempo de exposición (min) por el tipo de inhalación de aerosol (ml /min) (R) y la concentración de fármaco (mg /ml) (C) como se ha descrito previamente por nosotros [34], es decir, D = TRCI /W, donde I es la superficie corporal /índice de peso (mg /m
2: mg /kg) (3 para los ratones) y W es peso corporal del animal (kg). En un estudio previo, se midió la tasa aerosol para inhalación en ratones, que se define como el volumen de líquido en aerosol depositada en los pulmones del ratón en 1 min fue de aproximadamente 10
-4 ml /min para un ratón de 25 g [34]. La dosis depositada deseado se consigue controlando el tiempo de aerosol como T = DW /RCI. Por ejemplo, el tiempo de administración en aerosol para una dosis depositada de 2,5 mg /m
2 en un ratón gm 25 usando una solución de concentración 10 mg /ml Aza es T = 2,5 × 0.025 /10
-4 × 10 × 3 = 20,83 min.
Los estudios de toxicidad
ratones ICR (6 /grupo) fueron tratados con aerosol Aza a 2,5 ó 75 mg /m
2 al día x 7 días. Un grupo de ratones se trató con IT Aza a la dosis máxima tolerada de 270 mg /m
2 como control positivo para la toxicidad pulmonar. Los pulmones fueron resecados 7 días después de la última administración en aerosol. La toxicidad pulmonar se determinó mediante la evaluación patológica (3 pulmones /grupo) utilizando un método descrito previamente [34]. Además, también se determinó la viabilidad de las células epiteliales de las vías respiratorias (3 pulmones /grupo). Brevemente el tejido pulmonar se digirió con Liberase (Roche) y se filtró para obtener una única suspensión de células, que se marcó con anti-ratón de Ep-CAM anticuerpo de cabra anti-rata anticuerpo secundario de fluorescencia de conjugado (Biolegend, San Diego, CA), y ordenados por citometría de flujo. El porcentaje de células viables se determinó mediante la exclusión de 4 ', 6-diamidino tinción-2-fenilindol. La toxicidad sistémica se determinó midiendo los recuentos de células de sangre como un indicador de la mielosupresión (la principal toxicidad de IV Aza) [35]. Las muestras de sangre fueron tomadas en el momento de la eutanasia por punción cardiaca 7 días después del último tratamiento. Se determinó el número total de glóbulos blancos (WBC) tras la eliminación de las células rojas de la sangre como se ha descrito anteriormente [32].
Estudio de pre-farmacocinético
Los ratones normales ICR fueron dadas en forma de aerosol en el 2,5 Aza mg /m
2 utilizando el método descrito anteriormente. En cada punto de tiempo diseñada (5 min, 20 min, 2 h, 6 h y 24 h), tres ratones fueron sacrificados y sus pulmones se resecaron después de la perfusión del ventrículo derecho con solución salina. Azacitidina en los pulmones y se extrajo cuantitativamente mide por un método previamente reportado usando el sistema de LC-MS [36]. La detección cuantitativa se realizó mediante Millis Scientific Inc. La sensibilidad fue 1 ng /ml de Aza muestra. La concentración Aza en el tejido frente a los datos de tiempo se analizaron y se simula con el mejor ajuste (el valor más alto de I
2) bajo el programa Microsoft Excel. La ecuación de las curvas simuladas C = f (t) se utiliza para AUC calculada a partir de 0 a 24 horas como AUC = ∫
0-24 f dt (t). Se obtuvieron tiempo en horas pico (T) y la concentración máxima de la observación directa de las curvas.
antitumoral eficacia
Diez días después de la inoculación intratraqueal de las células tumorales, los ratones desnudos fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos (6 ratones /grupo): 1) en aerosol Aza a 2,5 mg /m
2 al día durante 7 días, 2) en forma de aerosol de solución salina normal (vehículo) al día durante 7 días, 3) o IV Aza a 75 mg /m
2 al día durante 7 días. En este estudio de supervivencia se observaron los animales diariamente. Se utilizaron puntos finales de la eutanasia (descrito anteriormente) durante este estudio y los ratones moribundos fueron sacrificados humanitariamente y se les practicó la necropsia ratones. Se utilizó el aumento de la esperanza de vida (% ILS) [37] para evaluar la eficacia de cada agente a prueba.
Histología de xenoinjertos de cáncer de pulmón
ratones del estudio de eficacia antitumoral se sometieron a autopsia después de la muerte y muestras de pulmón y tumores para histología se recogieron y se colocaron en 10% formalina tamponada neural. Las muestras se transfirieron a etanol al 70% y sometidos a la Histología y Patología Comparada de recursos compartidos en Einstein para el procesamiento rutinario de parafina. Los tejidos se seccionaron a 5 micras, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E), y evaluados por una junta patólogo veterinario certificado
Análisis del estado de metilación en tumores de pulmón
Ratones teniendo pulmonar ortotópico. tumores se dividieron en 3 grupos y se trataron con aerosol Aza, vehículo de aerosol, o IV Aza. Dos semanas después del último tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se resecaron los tumores pulmonares visibles (1~3 mm), congelado en hielo seco y se descomponen en partes más pequeñas (& lt; 0,5 mm) piezas por un homogeneizador eppendorf de tubo. Cada muestra de tumor se dividió en dos alícuotas: una para el ensayo de metilación y otra para transferencia de western. El estado de metilación de las regiones promotoras de genes supresores de tumores 24 implicados en la carcinogénesis de pulmón se midió utilizando un método de metilación qPCR matriz por Qiagen (SA Bioscieces) como se describe anteriormente [38].
Análisis de la expresión de proteínas en los tumores de pulmón
la segunda parte alícuota de las muestras de tumores de pulmón se utilizó para determinar la expresión de proteínas de la ETG. Se seleccionaron las ETG que muestran significativa desmetilación del promotor de aerosol después del tratamiento Aza analizado por la metilación matriz qPCR para su evaluación por western blot. Los tejidos congelados se homogeneizaron en tampón RIPA frío con cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) usando un homogeneizador de mano, seguido por sonicación. Las muestras de proteína se prepararon para transferencia de Western siguiendo un protocolo de rutina de Life Technologies (Grand Island, NY). Se utilizaron anticuerpos primarios contra H-cadherina humana, OPCML, RASSF1A (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), y beta-actina (Santa Cruz Biotechnology) para identificar las proteínas específicas. LI-COR C dígitos Blot escáner se utiliza para explorar las transferencias Western; las bandas se analizaron mediante el software Image Studio (LI-COR). Se utilizó el índice de densidad de la proteína específica frente al control de actina de carga de cada muestra para presentar los niveles de expresión de proteínas semi-cuantitativamente.
El análisis estadístico
Las diferencias entre los diferentes grupos fueron analizadas por dos caras log-rank test (Mantel-Cox). Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando P & lt; 0,05.
Resultados
modelos ortotópico de NSCLC
NSCLC es una enfermedad del epitelio de las vías respiratorias como consecuencia de la exposición crónica de sustancias cancerígenas en el aire . Con el fin de imitar este crecimiento del tumor en particular en las vías respiratorias en un modelo de xenoinjerto, que intra-traqueal inocularon células de NSCLC humanos directamente en las vías respiratorias, y luego comparamos este modo de trasplante de la inyección IV de células tumorales en ratones desnudos. El examen histológico de los pulmones reveló que el patrón de distribución de tumor y el crecimiento fue más similar a cáncer de pulmón humano en el modelo de implantación de TI: la mayoría de la semilla de las células cancerosas en la superficie del epitelio de las vías respiratorias en aproximadamente una semana después de la implantación. Por 3 semanas, pequeños nódulos tumorales mucosa se localizaron dentro de la vía aérea o el tejido pulmonar adyacente a la vía aérea, lo que indica el crecimiento del tumor primario dentro de la vía aérea y la invasión del parénquima pulmonar (Figura 1 fila superior). El crecimiento y el tamaño del tumor son de línea celular y el inóculo tamaño- dependiente. En nuestra experiencia, H460 (carcinoma de células grandes) desarrollaron tumores más rápido que H358 (carcinoma broncoalveolar) y mucho más rápido que el H226 (carcinoma de células escamosas) cuando se inocularon en ratones TI. En ausencia de cualquier intervención, los ratones sucumben a los tumores de pulmón entre los días 40 y 102. No hubo metástasis a distancia identificables. En contraste, casi todo visible /detectable IV implantado células cancerosas sembradas en el sistema capilar del pulmón y relativamente lejos de la vía aérea (Figura 1 fila inferior), que se asemeja más estrechamente las células tumorales metastásicas que emigran de otros órganos al pulmón. Los tumores también desarrollaron más rápido que después de la implantación de TI, y los ratones murieron por lo general en los días 35 a 68 (datos no presentados). Nuestros resultados sugieren que la implantación es un modelo de xenoinjerto ortotópico más apropiada para imitar NSCLC humano que el modelo IV u otros modelos ectópicos.
El modelo fue creado por vía intratraqueal la inyección de células NSCLC H460 en ratones desnudos. Arriba: H & amp; E manchadas secciones de pulmón de ratones inoculados TI en el día 35. Los tumores (T) se presentan dentro de las vías respiratorias y crecen vecinal en el parénquima pulmonar. En pocas palabras: H & amp; E manchadas secciones de pulmón de los ratones inoculados IV en el día 35. Los tumores se presentan dentro de los vasos pequeños en el parénquima pulmonar. El aumento del objetivo era 40X. Las barras de escala eran 50 micras.
Aerosol formulación
Hemos desarrollado una formulación de aerosol para el agente de desmetilación prototípico, azacitidina (AZA). La formulación se compone de Aza y el grado de inyección de solución salina normal estéril o agua. El poder Aza se puede disolver rápidamente (& lt; 30 seg) en la solución acuosa justo antes de la administración en aerosol. Se ha sugerido que las gotitas de aerosol & lt; 5 m, en particular & lt; 3 m, en depósito diámetro mayor frecuencia en las vías respiratorias inferiores y, por lo tanto, son apropiadas para inhalación farmacéutica de preparados de aerosol por los seres humanos [39] [40]. Se midió el tamaño aerodinámico de la formulación Aza aerosol, bajo nuestro sistema de generación de aerosol con el método de extrusión-precipitación [34], y se encontró que alrededor del 80% de las gotitas (% en peso) eran entre 0,25 a 5 m de diámetro, y alrededor 71% entre 0.25~3 micras (Figura 2). Nuestros resultados sugieren que aproximadamente 71~80% de las gotitas debe depositar en la vía aérea distal en los seres humanos [39] [40].
T determinado con el método de extrusión-precipitación usando una 7-Etapa Cascade Impactor vinculado a PARI de compresor de personal y sistema de nebulizador estrellas LC. solución Aza (4 ml) se aerosol a una velocidad de flujo de aire de 5 L /min. Las muestras de aerosol condensados se recogieron a intervalos de 3 diferentes, 1-1,5 min, 3 a 3,5 min, y 5 a 5,5 min. tamaño aerodinámico y la fracción de aerosol con un intervalo de tamaño particular, se midieron y calcularon según el protocolo del fabricante. Los datos fueron la media ± desviación estándar del tamaño aerodinámico basado en el peso (barras sólidas) y el peso acumulado (barras vacías) de 3 experimentos independientes.
La toxicidad y la dosis de selección
De nuestro estudio anterior hemos aprendido que la concentración efectiva de desmetilación Aza para las células cultivadas podría ser de 3 registros por debajo de su IC
50. La dosis efectiva antitumoral (7,5 mg /m
2 × 3) por inyección intratraqueal de Aza en el modelo de ratón no provocó toxicidad pulmonar o toxicidad aguda sistémica detectable, y la toxicidad pulmonar sólo se produjo en la dosis más alta de 270 mg /m
2, que fue la dosis máxima tolerada por inyección IV [32]. Basándose en estos resultados, se seleccionó una dosis de aerosol Aza que predicho que tienen una función de desmetilación y la eficacia terapéutica sin una toxicidad significativa. Los resultados indican que la dosis de aerosol seleccionado de 2,5 mg /m
2 (alrededor de 21 min aerosol exposición a una 25 g de ratón) al día durante 7 días o una dosis de inyección de bolo intratraqueal más alta de 75 mg /m
2 para 5 días no causaron ningún tipo de toxicidad pulmonar detectable (evaluados histológicamente) o toxicidad sistémica (medida por la mielosupresión) en el día 7 después de la administración final (Figura 3A, B). La toxicidad pulmonar (neumonitis) (Figura 3C) y mielosupresión (Figura 3D), sólo se produjo cuando los ratones recibieron la dosis más alta de la inyección intravenosa o intratraqueal de Aza a 270 mg /m
2 (la MTD de Aza intravenosa). Del mismo modo, el aerosol Aza a la dosis terapéutica seleccionada no causó ninguna muerte de las células de la vía aérea epitelial determinados por citometría de flujo, en comparación con el control positivo en los ratones tratados con la más alta dosis de Aza a 270 mg /m
2 ( Figura 3E).
secciones de pulmón de ratones tratados con aerosol Aza a 2,5 mg /m
2 × 7 (a), IT Aza a 75 mg /m
2 × 7 (B), y IT Aza a 270 mg /m
2 × 5 (C), muestran, respectivamente, sin toxicidad a 2,5 y 75 2,5 mg /m
2 pero neumonitis a 270 mg /m
2. El aumento del objetivo era 40X. Las barras de escala eran 50 micras. razón del recuento de glóbulos blancos (después vs. tratamiento antes del tratamiento, n = 6) (D) y el porcentaje de células viables de las células epiteliales de las vías respiratorias ordenados (n = 6) (E), respectivamente.
eficacia terapéutica
sistémica (IV) de Aza ha dado lugar a sólo una eficacia limitada en pacientes con NSCLC [41] [42], que ha sido recapitulan en nuestros modelos de ratones experimentales de CPNM tratados con IV Aza, (Figura 4A-C). En realidad, hay poca evidencia experimental que apoya el uso de un agente de desmetilación para inhibir eficazmente el cáncer de pulmón en modelos animales [43] [32]. Una de las posibles razones es que este fármaco muy inestable no se entregó de manera eficiente a los tumores de pulmón. Fuimos el primer grupo para informar de un estudio de prueba de concepto en el que la administración de Aza directamente en las vías respiratorias prolonga efectivamente la supervivencia de ratones con cánceres de pulmón ortotópico [32]. En el estudio actual, estamos reportando los resultados usando aerosoles Aza para el tratamiento de xenoinjertos de NSCLC humanos ortotópico en ratones. Uno de nuestros objetivos era demostrar que la administración en aerosol de Aza al epitelio de las vías respiratorias podría inhibir eficazmente el crecimiento de modelos de NSCLC clínicamente relevantes. Además, estos estudios se han diseñado además para investigar si la administración en aerosol de la agente de desmetilación podría inhibir el crecimiento de tumores dentro de las vías respiratorias a dosis bajas de desmetilación en lugar de dosis citotóxicas (Figura 4A-C).
ratones por vía intratraqueal inocularon con las líneas celulares H226 (a), H358 (B) o H460 (C) fueron tratados con aerosol Aza (línea roja gruesa) a 2,5 mg /m
2 al día durante 7 días o vehículo de aerosol (línea azul fina) con el mismo volumen. El tratamiento con IV Aza (línea de trazos) a la dosis óptima de 75 mg /m
2 al día durante 5 días se utilizó como control. La comparación estadística de las curvas de supervivencia se realizó con la prueba de log-rank (Mantel-Cox). Los valores de p para H266, H358, H460 y modelos eran 0,0135, 0,0150, y 0,0719, respectivamente. Pre-farmacocinética del aerosol Aza (D). ICR ratones fueron tratados con aerosol Aza a 2,5 mg /m
2. Los datos obtenidos en cada punto de tiempo fue la media ± desviación estándar de la media del porcentaje de dosis administrada /inicial de los pulmones de los ratones 3. La ecuación para cada curva se simuló curva con el mejor ajuste (la más alta de I
2 Valor) bajo el programa Microsoft Excel.
Nuestros resultados indican que un aerosol de dosis baja Aza prolongan significativamente la vida útil de los ratones portadores de tumores endobronquiales. Los ILS% y la mediana de supervivencia se prolongaron por 5.1 y 1.5-, (p = 0,0135), y 6.4- 1.9- (p = 0,0150), y 8.9- y 1.6- (p = 0,0719) veces en los grupos tratados con el aerosol aza utilizando una dosis de más de 20 veces menor que la dosis utilizada en el grupo de control el tratamiento sistémico, en el modelo H226, H358, y H460, respectivamente. Estos resultados demuestran claramente que la administración en aerosol de Aza en desmetilantes, las dosis no citotóxicas es superior a la administración sistémica de Aza en términos de eficacia inhibidora del crecimiento del tumor.
Pre-farmacocinética
Para determinar la deposición de Aza en los pulmones que llevamos a cabo estudios de pre-farmacocinética in vivo. Inyectado por vía intravenosa Aza con la misma dosis se utilizó una comparación. En el primer punto de tiempo (3 min, el posible punto de tiempo más temprano), podríamos recuperar ~89% de la dosis inicial de aerosol desde el pulmón. Sin embargo, cuando la misma dosis se administra por inyección sistémica, la concentración máxima en los pulmones fue sólo 1,62% de la dosis inicial. El área bajo la curva de concentración frente al tiempo (AUC
0~24 h) de aerosol Aza era 15 veces mayor que el de IV Aza (Tabla 1). Aza dada a través de las dos vías mostró un patrón de disminución similar: un rápido descenso dentro de los primeros 2 h después de la administración seguido por una disminución más lenta. Aerosol Aza mostró una menor tasa de deterioro en la fase más lenta, mientras IV Aza mostró una concentración pico retraso en el pulmón (Figura 4D). Estos datos demuestran que el aerosol Aza concentración en el tejido más alta en los pulmones con menor exposición sistémica predecible que el IV Aza.
Aerosol Aza desmetilación
Para analizar si Aza tiene un efecto desmedíante en los modelos de NSCLC clínicamente relevantes, se cosecharon los tumores de pulmón a partir de los modelos de xenoinjertos tratados con aerosol Aza o IV Aza y determinó el estado de metilación de las regiones promotoras de los genes supresores de 24 tumores, cuya hipermetilación del promotor ha sido reportado como relevantes en el cáncer de pulmón literatura. Normales las células epiteliales bronquiales de los animales sin tratamiento Aza se utilizaron como control metilación línea de base. Los 24 ETG seleccionados son APBA1, APC, CADM1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, prdm2, RARB, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, SLIT2, TCF21 y TGFB1. Se encontró que 11 de los 24 promotores fueron hypermethylated en las muestras de tumores de 3 modelos de xenoinjerto diferentes y que aerosol Aza podría demethylate 5 de ellos (Figura 5A). En el contrato, IV Aza a la misma dosis no mostró ningún efecto de desmetilación (Figura 5B). Los datos mostrados en la Figura 5 representan nivel de metilación detectadas por una matriz de metilación q-PCR y se presentan como% de metilación de la citosina total de CG de la región promotora particular.
Tumor-teniendo ratones de 3 modelos de cáncer de pulmón ortotópico (H226-xeno, H358-xeno, y H460-xeno) fueron tratados con aerosol Aza (a) o IV Aza (B) a 2,5 mg /m
2 × 7 diaria. Los pulmones se resecaron 14 días después del tratamiento final y los nódulos tumorales mayor que 1,5 mm se aislaron para la detección de metilación por la tecnología de matriz qPCR en Qiagen (SA Biosciences). Los datos son la metilación% del total citosina CG de la región promotora en particular.
TSG reexpresión
Con el fin de analizar si la desmetilación en la región promotora del ETG puede reactivar la ETG, se resecó los tumores de pulmón y se mide la expresión de la proteína de la ETG cuyos promotores fueron desmetilado significativamente después del tratamiento Aza aerosol. ensayo de transferencia de Western se utilizó para detectar la expresión de genes en las muestras tumorales de los mismos ratones usados en el estudio desmetilación. Se seleccionaron 5 ETG cuyos promotores fueron demethylated significativamente después del tratamiento Aza aerosol. Se encontró que el H-Cad y RASSF1 en los tumores H266, H-cad, OPCML, y SFRP1 en tumores H358 y H460 OPCML en los tumores se reactivaron a nivel de proteínas (Figura 6 A y B) después del tratamiento Aza aerosol. La expresión de estas ETG se ha demostrado para inhibir o retrasar el desarrollo del cáncer en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de pulmón. Por ejemplo, hemos informado antes de que la pérdida de H-cadherina en NSCLC humano se asocia con la tumorigenicidad [44]. La región del promotor de RASSF1A también se encuentra fuertemente metiladas en el cáncer de pulmón [45]. OPCML, un supresor de tumor amplio encontrado originalmente en los cánceres de ovario, se encuentra metilado en muchas líneas celulares de cáncer de pulmón [46]. SFRP1 en la vía de señalización Wnt está transcripcionalmente silenciados por hipermetilación del promotor en NSCLC [47]. Los resultados de este estudio in vivo implican que el tratamiento aerosol de desmetilación puede ser eficaz en la inhibición de tumores de pulmón endo-bronquial y lesiones premalignas bronquiales.
ensayo de transferencia de Western se utilizó para determinar la expresión de la proteína de la ETG con significativa desmetilación promotor después de aerosol tratamiento Aza identificado por la metilación matriz q-PCR. Las muestras tumorales fueron los mismos tal como se utiliza en la Figura 5; Histograma de las transferencias de Western (B). Las películas de fotos de Western blot fueron escaneados y la relación de la densidad de la proteína específica frente al control de actina carga de cada muestra se presentan como el nivel de expresión de la proteína.
Discusión
El cáncer de pulmón es visto como una "enfermedad genética" [48], [49]. Tras la demostración de que TSG desactivación y activación de oncogenes juegan un papel crítico en la carcinogénesis, los esfuerzos terapéuticos se han desplazado progresivamente de la optimización de las formas de radiación y quimioterapia no específicos de terapia que principalmente matan a las células de rápida división para desarrollar agentes que se dirigen a los cambios genéticos específicos . La evidencia reciente sugiere una relación directa entre los cambios epigenéticos aberrantes y el desarrollo del cáncer; indica que el cáncer es también, en parte, una enfermedad epigenético. A diferencia de los cambios genéticos, cambios epigenéticos ocurren temprano en la progresión del cáncer y son reversibles. Por lo tanto, una estrategia terapéutica que apunta a revertir los cambios epigenéticos aberrantes debe ser una estrategia más eficaz que los que se centran en el uso de agentes citotóxicos no específicos o en la orientación de defectos genéticos irreversibles.
De acuerdo con el modelo de campo de cancerización [3 ] [50], todas las células epiteliales bronquiales acumulan epigenética y lesiones genéticas hasta que una sola célula adquiere un fenotipo maligno y da lugar a un tumor invasivo, mientras que el resto del campo continúa acumulando epigenética y daño genético y está en riesgo de desarrollar otros primaria los cánceres de pulmón (segundas primarias) [51] [52]. Durante este proceso, los cambios epigenéticos aberrantes, tales como la hipermetilación de los promotores de ETG, se producen antes y pueden hacer que los cambios genéticos posteriores, y persisten en células tumorales a través de todo el proceso de la carcinogénesis.
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