Extracto
Aquí mostramos que 3'-hydroxypterostilbene (HPSB), un análogo Pterostilbene natural, era más potente que Pterostilbene contra el crecimiento de células cancerosas humanas (COLO 205, HCT-116, HT-y 29) con IC medidos
50 valores de 9.0, 40.2, 70.9 y M, respectivamente. Se encontró que HPSB inhibe eficazmente el crecimiento de células de cáncer de colon humano mediante la inducción de apoptosis y la autofagia. La autofagia se produjo en una etapa temprana y se observó a través de la formación de orgánulos vesiculares ácidos y la producción de proteína 1 de cadena ligera de 3-II asociada a microtúbulos. En los niveles moleculares, los resultados de análisis de transferencia Western mostraron que señalizaciones HPSB fosfatidilinositol significativamente regulada hacia abajo-3-quinasa (PI3K) /Akt y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), incluyendo disminución de la fosforilación de la diana de mamífero de la rapamicina (mTOR). Se demostraron efectos terapéuticos significativos
in vivo fotos: por tratamiento de ratones desnudos portadores de xenoinjertos tumorales COLO 205 con HPSB (10 mg /kg
i.p..
). Estos efectos inhibidores fueron acompañados por mecanicista baja regulación de los niveles de proteína de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), la matriz metalopeptidasa-9 (MMP-9), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y la ciclina D1, así como por la inducción de la apoptosis en los tumores de colon. Nuestros hallazgos sugieren que HPSB podría servir como un agente prometedor novedoso para el tratamiento del cáncer de colon
Visto:. Cheng T-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam N, Majeed M, Ho C-T, et al. (2014) potente efecto contra el cáncer de 3'-Hydroxypterostilbene de colon humano de xenoinjerto de tumores. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10.1371 /journal.pone.0111814
Editor: Ying-Jan Wang, de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Recibido: 8 Agosto, 2014; Aceptado: 8 Octubre 2014; Publicado: 12 Noviembre 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia NSC 101 a 2628-B-022-001-MY4, 102 a 2628-B-002-053-MY3, y NTU-103R7777 (por el Dr. Pan) y por el pago de la Salud y el bienestar de los productos del tabaco MOHW103-TD-B-111-01 (por el Dr. Ho). Sabinsa Corporación proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores NK & amp; MM, pero no tenía ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. NK y MM son empleados de Sabinsa Corporation. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Los estudios epidemiológicos proporcionan evidencia convincente de que los factores dietéticos pueden modificar los procesos de carcinogénesis, incluyendo la iniciación , promoción y progresión de varios tipos de cáncer humano [1]. quimioprevención del cáncer es el uso de agentes farmacológicos o naturales para inhibir el desarrollo de cáncer invasivo o revertir el proceso de la carcinogénesis. Podría ser el proceso más directa para reducir la morbilidad y la mortalidad por enfermedad cancerosa [2] - [4]. Un gran número de quimiopreventivo y agentes quimioterapéuticos, a partir de productos naturales, se han utilizado como una estrategia prometedora para luchar contra el cáncer mediante la inducción de apoptosis en las células malignas [5], [6].
Pterostilbene (
trans
-3,5-dimetoxi-4 'hidroxiestilbeno), un análogo de dimetiléter de resveratrol, se encuentra que es tan eficaz como el resveratrol en la prevención de lesiones preneoplásicas inducidas por carcinógenos en un modelo de cultivo de mama de ratón e inhibe el crecimiento metastásico de células de melanoma para el hígado [7], [8]. Nosotros y otros han demostrado que pterostilbeno exhibe efectos farmacológicos pleiotrópicos incluyendo anti-inflamatorio, antioxidante, anti-proliferativa, anti-cáncer, y las actividades para aliviar el dolor en cultivo celular y estudios en animales [9] - [14]. Recientemente, 3'-hydroxypterostilbene (Fig. 1), un nuevo análogo pterostilbeno natural ha sido aislado de
Sphaerophysa salsula
, es marcadamente más activo que pterostilbeno en la inducción de apoptosis en las células sensibles y resistentes de leucemia [15], [ ,,,0],dieciséis]. Sin embargo, el
in vivo
efecto antitumoral de HPSB sigue siendo poco clara.
La autofagia, también conocido como tipo II muerte celular programada, se caracteriza por la formación de una doble membrana o aislamiento membrana que deriva de una parte del retículo endoplásmico (ER) [17] o de la piscina de lípidos cytolplasmic [18]. La doble membrana formas autofagosoma por porciones Sequester del citoplasma y orgánulos intracelulares [11], [12], [19], [20].
La autofagia es una respuesta de las células eucariotas a varios tipos de estrés, incluyendo microambiente el hambre, la infestación de patógenos y la quimioterapia. Por otra parte, también hay varios informes han demostrado que la inducción de la autofagia parece facilitar el éxito de la matanza inducida por el tratamiento de las células tumorales [21], y las drogas pro-autofágicos tales como temozolomida son candidatos prometedores para la eliminación selectiva de los glioblastomas resistentes a la apoptosis [22].
La señal de iniciación de la formación de la autofagia es poco conocida, mientras que se ha establecido que varias moléculas y vías de señalización están implicadas en la regulación de la autofagia, tales como PI3K-AKT-mTOR (fosfatidilinositol 3-quinasa /proteína quinasa B /mamíferos objetivo de rapamicina), MAPK, Raf-1-MEK1 /2-ERK1 /2 y PTEN (fosfatasa y tensina homólogo) vías [10], [23]. PTEN y AKT son reguladores aguas arriba de la vía de mTOR, que actúan como un inductor o inhibidor de autophage, respectivamente. AKT inhibe autophage mediante la regulación de aguas abajo molecular 4E-BP1 (4 elongación-proteína se unen 1), p70S6K que resultan en la promoción de la traducción del ARNm.
En este estudio, se examinó por primera vez los efectos antiproliferativos de Pterostilbene y sus recursos naturales 3 'derivado hidroxi en las células de cáncer de colon humano. Nuestros resultados demuestran claramente que HPSB era más potente que pterostilbeno en la inducción de apoptosis de una manera dependiente de la dosis en las células COLO 205.
Además, evaluó los mecanismos moleculares de efectos apoptóticos y autofágicas inducidos por HPSB. Para dilucidar el mecanismo contra el cáncer de HPSB, hemos investigado las vías de señalización relacionadas con la autofagia inducida por HPSB en COLO 205 células de cáncer de colon humano.
In vivo
eficacia terapéutica se examinó mediante el tratamiento de los ratones desnudos portadores de xenoinjertos tumorales COLO 205 con 10 mg /kg
ip
HPSB. Este estudio proporciona nuevas pruebas de que el derivado de hidroxilo de Pterostilbene podría servir como un agente nuevo y prometedor contra el cáncer de colon humano.
Materiales y Métodos
2.1 Reactivos
El yoduro de propidio ( PI), naranja de acridina (AO) y la cloroquina (CQ) se adquirió de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EE.UU.). 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) y 3,3-dihexyloxacarbocyanine yoduro (DiOC6) se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR, USA). La PARP, DFF-45, LC-3 I /II, p-mTOR (Ser
2448), mTOR, p-p70s6k (Thr
398), p-p70s6k (Ser
371), p -Akt (Ser473), Akt, PI3K, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, p-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 y MMP-9 anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). La p85 p-PI3K (Tyr508), ERK1 /2, VEGF y anticuerpos de ciclina D1 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las caspasas 3, 8 y 9 anticuerpos fueron adquiridos de Imgenex (San Diego, CA, EE.UU.). El anticuerpo de la COX-2 se adquirió de Transduction Laboratories (BD Biosciences, Lexington, KY). El anticuerpo β-actina se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Pterostilbene y HPSB se obtuvieron de Sabinsa Corp. (East Windsor, Nueva Jersey). La pureza de pteroestilbeno y HPSB se determinó por HPLC como mayor que 99,2%.
2,2 Cell Cultura
El cáncer de colon humano líneas de células COLO 205, HCT-116 y HT-29 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las líneas celulares se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina), 2 mM L-glutamina (GIBCO BRL, Grand Island, NY), y se mantuvieron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 incubadora. Pterostilbene y HPSB se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, como concentración final de 0,05%). Las células fueron tratadas con 0,05% de DMSO como control del vehículo.
2.3 Ensayo de citotoxicidad
La viabilidad celular se ensayó por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT). Brevemente, COLO 205, HCT-116 y HT-29 células se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células /ml en placas de 96 pocillos. Después de un crecimiento durante la noche, las células se trataron con una serie de concentraciones de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene durante 24 h. Las concentraciones finales de DMSO en el medio de cultivo eran & lt; 0,05%. Al final del tratamiento, se añadió 0,2% de MTT y se incubaron las células durante otras 4 h. La viabilidad celular se determinó mediante el escaneo con un lector de ELISA con un filtro de 570 nm.
2.4 Flujo de análisis de población de células sub-G1, membrana mitocondrial la producción potencial y ROS
Para sub-G1 citometría análisis de la población de células, células COLO 205 (2 × 10
5 células /ml) se cultivaron en 12 bien y tratamiento con diversas concentraciones de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene para 24 h. a continuación, se recogieron las células, se lavaron con PBS, se resuspendieron en 200 l de PBS, y se fijaron en 800 l de etanol helado al 100% a -20 ° C. Después de dejarla reposar durante la noche, los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de tampón hipotónico (0,5% Triton X-100 en PBS y 0,5 mg /ml de RNasa) con PI (50 mg /ml) y se incubaron a 37 ° C en la oscuridad durante 30 min. La fluorescencia emitida desde el complejo de PI-ADN se cuantificó después de la excitación del colorante fluorescente por citometría de FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). En el estudio de inhibidor de la autofagia, las células se pretrataron 25 M CQ durante 1 h, seguido de incubación con pterostilbeno o HPSB.
Para potencial de membrana mitocondrial y la producción de ROS, de células se trataron como se ha descrito anteriormente para 15 min, y después se añadió DiOC6 (40 nM) o DCFH-DA (20 M) al medio durante 30 min a 37 ° C. Después de lavar con PBS, la intensidad de fluorescencia se determinó mediante citometría de FACScan.
2.5 Detección de la autofagia
inducción
autofagia se detectó por tinción con AO. Después de 24 h de tratamiento, las células COLO205 se lavaron con PBS, se suspendieron en PBS y se tiñeron con 1 mg /ml de AO 20 min. Las fotografías se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, NY) equipado con una lámpara de mercurio de 100 W, 490 nm de paso de banda de filtros de excitación azul, un espejo dicroico de 500 nm y un paso largo 515-nm filtro de barrera. Para la cuantificación de objetos AVO por citometría de flujo, las células se trataron como se ha descrito y se tiñeron con AO durante 15 min y se analizaron por FACScan citómetro de flujo láser y el software CellQuest.
2,6 Western Blotting
Las proteínas totales de COLO se extrajeron 205 células a través de la adición de tampón de lisis de oro (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaF 1 mM; NaCl 150 mM; mM EGTA 1; 1 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo; 1% NP-40, y 10 mg /ml leupeptina) a los sedimentos de células en hielo durante 30 min, seguido por centrifugación a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Las proteínas totales se midieron por proteínas Bio-Rad de ensayo (Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Las muestras (50 g de proteína) se mezclaron con 5 x tampón de muestra que contiene 0,3 M Tris-HCl (pH 6,8), 25% de 2-mercaptoetanol, 12% de dodecil sulfato de sodio (SDS), EDTA 25 mM, 20% de glicerol, y 0,1% de azul de bromofenol. Las mezclas se hierve a 100 ° C durante 5 min y se sometieron a 10% minigeles SDS-poliacrilamida a una corriente constante de 20 mA. La electroforesis se llevó a cabo a continuación en geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas en el gel se electrotransfirieron sobre una membrana inmóvil (PVDF; Millipore Corp., Bedford, MA) con tampón de transferencia compuesta de 25 mM Tris-HCl (pH8.9), glicina 192 mM, y 20% de metanol. Las membranas se bloquearon con solución que contiene 20 mM Tris-HCl de bloqueo, y luego a inmunotransferencia con diferentes anticuerpos primarios y β-actina. Las transferencias se lavaron tres veces con tampón PBST (Tween 20 0,2% en 1 x tampón PBS) durante 10 min cada uno. A continuación, las transferencias se incubaron con 1:5000 dilución de la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) y después se lavaron de nuevo tres veces con tampón PBST. Las proteínas transferidas se visualizaron con un kit de detección de quimioluminiscencia (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido). Las densidades de las bandas se cuantificaron con un densitómetro ordenador (AlphaImagerTM 2200 Sistema Alfa densitómetro. Innotech Corporation, San Leandro, CA).
2.7 Actividad de las caspasas
La caspasa 3, 8 y 9 la actividad en las extracciones de proteínas de células COLO 205 se determinó mediante un ensayo fluorogénico (sistema de ensayo CaspACE de Promega, Madison, WI). En resumen, 50 g de proteína total, como se determina por el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories), se incubó con sustrato de 50 mM Ac-Asp-Glu-Val-Asp-methylcoumaryl-7-amina (caspasa-3 sustrato específico), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (caspasa-8 sustrato específico) o Ac-Leu-Glu-His-Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( caspasa-9 sustrato específico) a 30 ° C durante 1 h. La liberación de methylcoumaryl-7-amina se midió mediante excitación a 360 nm y emisión a 460 nm usando un espectrofotómetro de fluorescencia (ECLIPSE, Varian, Palo Alto, CA).
2,8 COLO modelo 205 xenoinjerto
Hombre Balb /c ratones desnudos a las 3-4 semanas de edad (con un peso 16-18 g) se obtuvieron del Centro Experimental BioLASCO Animal (BioLASCO, Taipei, Taiwán). Todos los animales se mantuvieron en aisladores estériles libres de patógenos y en una atmósfera controlada (25 ± 1 ° C en 50% de humedad relativa) y con un 12 h de luz 12 h oscuridad ciclo de acuerdo con las directrices institucionales. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar de AIN-76 y toda la comida, el agua, las jaulas, y ropa de cama fueron esterilizados antes de su uso. Los animales tuvieron acceso libre a comida y agua en todo momento. tazas de alimentos fueron repuestas con la dieta fresca todos los días. Todos los animales protocolo experimental utilizado en este estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Nacional de Kaohsiung Marina (IACUC, NKMU,#099-AAA9-02, fechas de validez: 08/01 /2009-07 /31/2012) . Después de 1 semana de aclimatación, el cáncer de colon COLO 205 células (5 × 10
6) en 0,2 ml de PBS se inyectaron por vía subcutánea entre las escápulas de cada ratón desnudo. Después del trasplante, el tamaño del tumor se midió usando calibradores, y se calculó el volumen del tumor de acuerdo con la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = L x W2 /2, donde L es la longitud y W es la anchura. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 100 a 200 mm
3, los ratones fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (6 animales /grupo). Los ratones fueron
i.p.
. inyección con pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, respectivamente) durante 15 días, mientras que los animales de control se recibieron inyección de aceite de maíz. El peso ingesta de la dieta y el cuerpo de cada animal se monitorizó cada día. El volumen del tumor se evaluó y registró cada 5 días utilizando mediciones de la pinza. Después de 15 días, los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia y el hígado, los riñones, el bazo y tumores sólidos fueron extirpados inmediatamente y se pesaron. el volumen tumoral promedio y el peso del tumor de cada grupo se representan la media ± desviación estándar (SD). Los tejidos tumorales se cortaron en varias porción para análisis perno occidental o se almacenaron a -80 ° C.
2.9 estadístico El análisis
Los datos se presentan como media ± SE para el número indicado de experimentos llevados a cabo de forma independiente . Las comparaciones de significación estadística entre los grupos se realizaron mediante t-test o análisis unidireccional de un estudiante de la varianza (ANOVA). Un
P-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
3.1 La inhibición de la proliferación celular en las células tratadas con HPSB de cáncer de colon humano
primero Se compararon los efectos de pteroestilbeno y HPSB (Figura 1) sobre el crecimiento de células de cáncer de colon humano utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripán como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 2, HPSB disminución del crecimiento celular en células de cáncer de colon humano cultivadas (COLO 205, HCT-116 y HT-29) de una manera dependiente de la dosis, con IC
50 valores de 9.0, 40.2, y 70.9 mu M, respectivamente (Tabla 1). El efecto inhibidor del crecimiento celular en COLO 205 y las células HCT-116 (p53 de tipo salvaje) fue sensible a HPSB en comparación con HT-29 (p53 mutante). Estos resultados sugieren que p53 podría ser un regulador clave en las células COLO 205. En comparación con pterostilbeno, HPSB era un inhibidor fuerte de crecimiento de las células COLO 205. Como resultado, se examinaron adicionalmente los efectos citotóxicos de HPSB en 205 células COLO.
Las células se trataron con diversas concentraciones (5, 10, 25 y 50 mM) de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene para 24 h. (A) La determinación de células sub-G1 en células COLO 205 por citometría de flujo después de tinción PI como se describe en los Materiales y Métodos. (B, C) Después del tratamiento, los lisados de células totales se prepararon a partir células COLO 205 y la escisión de PARP, DFF-45, pro-caspasa 8 y pro-caspasa 9 se analizaron por transferencia Western. (D) Cinética de activación de la caspasa en las células COLO 205. Las células fueron tratadas con 25 y 50 M de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene durante 24 h. Se analizaron las actividades de caspasa como se describe en los Materiales y Métodos. (E) Las células se trataron con 50 mM de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene para 15 min. potencial de membrana mitocondrial y la producción de ROS se tiñeron con DiOC6 (40 nM) y DCFH-DA (20 mM) y se midió por citometría de flujo. Los valores se expresan como medias ± SE de pruebas por triplicado. *
P
. & Lt; 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa del grupo tratado con Pterostilbene
3.2 HPSB la apoptosis inducida en células de carcinoma colorrectal humano
Flujo citometría se utilizó para investigar la inducción de una población de células sub-G1, una característica de la apoptosis. Para investigar si los efectos citotóxicos de HPSB observaron en células COLO 205 se debían a la muerte celular apoptótica, las células se trataron con pterostilbeno y HPSB (5-100 mM) durante 24 h y el contenido de ADN de las células COLO 205 se realizaron por citometría de flujo (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2A, los porcentajes de células apoptóticas COLO 205 fue 6,2, 8,4, 10,2, 14,8, y 7,2 y 9,3, 20,1, y 36,3% después de la incubación con 5, 10, 25, y 50 mM pterostilbeno y HPSB, respectivamente. La figura 2B en comparación con Pterostilbene, HPSB marcadamente causan la degradación de 116 kDa PARP en 85 kDa fragmentos e inducir DFF-45 la degradación de proteínas. Estas escisiones de proteínas se asocian con la activación de la caspasa-3. Como se muestra en la Figura 2C, HPSB indujo un aumento dramático en la caspasa-9 escisión de pterostilbeno. Sin embargo, sólo un efecto menor en la actividad de caspasa-8 en HPSB células tratadas. Para controlar la actividad enzimática de la caspasa-3, -8, -9 y, se midió la actividad caspasa tras el tratamiento de las células COLO 205 con HPSB 10 y 50 mM. Como se muestra en la Figura 2D, HPSB indujo un aumento dramático en la actividad de caspasa-3 de aproximadamente 2,4 veces después de 24 h de tratamiento. Recientemente se ha vuelto evidente que la apoptosis implica una interrupción de la integridad de la membrana mitocondrial que es decisivo para el proceso de muerte celular. Por lo tanto, se evaluaron los efectos de HPSB en el potencial mitocondrial transmembrana (ΔΨ
m). Los resultados de la medición de la intensidad de fluorescencia en 205 células COLO expuestos a pterostilbeno y HPSB comparación con las células de control no tratados se resumen en la Fig. 2E. El (3) la intensidad de fluorescencia DiOC6 desplaza hacia la izquierda 224 a 117 y 75 en pterostilbeno y HPSB inducida 205cells COLO apoptóticas, respectivamente. Estos resultados confirmaron que HPSB causó una disminución en el potencial transmembrana mitocondrial en las células COLO 205. El papel de las ROS en la inducción de apoptosis es bien reconocido. Curiosamente, HPSB disminuyó notablemente la intensidad de fluorescencia media DCFH-DA a partir 114 a 38, mientras que aumentó la intensidad de fluorescencia Pterostilbene DCFH-DA 114-141 a los 15 min. El desequilibrio de las concentraciones de ROS podría juega un papel importante como mediador temprano en la apoptosis inducida por HPSB.
3.3 HPSB mostró fuertes efectos que inducen la autofagia en que Pterostilbene en células COLO 205
La acumulación de pruebas indica claramente que pterostilbeno tiene capacidad anti-tumorigénesis a través de la inducción de la apoptosis y la autofagia. A continuación evaluó si Pterostilbene y HPSB autofagia inducida también en células COLO 205. Como se muestra en la Figura 3A, el tratamiento resultó en HPSB marcada aparición de AVO que pterostilbeno cuando las células se tiñeron con naranja de acridina después del tratamiento 24 h. Para cuantificar la incidencia de la autofagia inducida por HPSB, las células con objetos AVO mostraron una mayor fluorescencia roja analizado por el flujo que aumenta significativamente después del tratamiento con HPSB de una manera dependiente de la dosis (Figura 3B y 3C). Para confirmar la ocurrencia de la autofagia inducida por Pterostilbene y HPSB, se analizó el proceso de LC3I /II, señas de identidad de la autofagia, mediante inmunotransferencia para detectar lisados extraído de células a partir de células COLO 205. Como se muestra en la figura 3D, HPSB más fuerte aumento de las cantidades de LC3B I /II proteínas que Pterostilbene.
Las células fueron tratadas con 50 mM Pterostilbene o 3'-hydroxypterostilbene durante 24 h y se tiñeron con naranja de acridina. (A) de la fluorescencia verde y roja en las células naranja manchado de acridina se observaron bajo el microscopio de fluorescencia. (B, C) Detección y cuantificación de la autofagia en las células COLO 205. Las células fueron tratadas con 25 y 50 M de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene durante 24 h y se tiñeron con naranja de acridina. La medición de la fluorescencia verde y roja en las células naranja manchado de acridina se realizó mediante citometría de flujo. (D) Se prepararon lisados celulares después de 24 h de tratamiento y la expresión de la proteína de LC3 I /II se analizaron por transferencia Western. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos. *
P Hotel & lt; 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa del grupo tratado con Pterostilbene
3.4 HPSB inhibe el mTOR /p70S6K, PI3K /Akt y MAPK vías de señalización en las células COLO 205.
Para entender mejor los mecanismos moleculares de la autofagia inducida HPSB en 205 células COLO, se analizó la fosforilación de mTOR /p70S6K, PI3K /Akt y MPaks en HPSB células tratadas. Los resultados mostraron que la fosforilación de mTOR y p70S6K (Thr389) se redujo marcadamente en las células tratadas con HPSB (Figura 4A). La evidencia acumulada sostiene que la PI3K /Akt y MAPK las vías participan en la regulación de la autofagia, sin embargo, la JNK1 /2 en esta vía queda por aclarar. Por lo tanto, se investigó cómo funcionaban estas vías de señalización en la inducción de la autofagia en las células por HPSB COLO 205. Como se muestra en la Figura 4B y 4C, la fosforilación de PI3K, Akt, y p38 MAPK disminuido en las células tratadas con HPSB de una manera dependiente del tiempo. Por el contrario, el tratamiento con HPSB aumentó la ERK1 fosforilados /2 y JNK1 /2 con eficacia durante 1 hy después disminuyeron gradualmente la fosforilación de ERK1 /2 y JNK1 /2 de 3 h a 9 h en comparación con el total de ERK1 /2 y JNK1 /2 proteína en las células COLO 205. Tomados en conjunto, estos resultados indican que HPSB inhibe la PI3K /Akt /mTOR /p70S6K, y las vías de p38MAPK y activa las /2, JNK1 /2 vías de MAPK ERK1 y sugiere que estos cambios median la autofagia inducida por HPSB en células COLO 205.
COLO 205 células fueron tratadas con 50 mM 3'-hydroxypterostilbene en diferentes momentos. lyates de células se prepararon y los niveles de proteína de (A) p-mTOR, p-p70S6K, (B) p-PI3K, p-Akt y (C) p-ERK1 /2, p-JNK1 /2, p-p38 eran se analizaron por análisis de transferencia de Western. Todos los análisis fueron representativos de al menos tres experimentos independientes. Los valores por debajo de cada carril indican la densidad relativa de la banda normalizado a ß-actina utilizando un densitómetro.
Además, se utilizó la cloroquina (CQ), un inhibidor de la autofagia, para determinar si la inhibición de la autofagia suprimido citotoxicidad HPSB inducida. Como se muestra en la Figura 5, los resultados indicaron que el tratamiento con CQ reveló significativo aumento de citotoxicidad (Fig. 5A) por un aumento de la apoptosis activada por HPSB (Fig. 5B y 5C). Estos resultados corroboran con la observación de que el tratamiento HPSB induce la muerte celular autofágica en 205 células COLO.
Las células se trataron previamente con CQ 25 M durante 1 h antes del tratamiento con 50 mM de pterostilbeno o 3'-hydroxypterostilbene para 24 h. (A) La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. (B, C) se analizó y cuantificación población de células sub-G1 (%) después de la tinción PI seguida de citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos.
*
P Hotel & lt; 0,05 y
**
P
. & Lt; 0,01 indica una diferencia estadísticamente significativa del grupo tratado con Pterostilbene
3.5 HPSB el crecimiento del tumor inhibió fuertemente la
in vivo
además, examinó la eficacia terapéutica de HPSB
in vivo fotos: por tratamiento de ratones desnudos portadores de carcinoma colorrectal humano COLO 205 xenoinjertos de tumores, usando pterostilbeno y HPSB a una concentración de 10 mg /kg. Durante el experimento, todos los ratones fueron monitorizados para investigar si Pterostilbene y tratamiento HPSB causaron efectos adversos. Como se muestra en la Tabla 2, los pesos corporales y de órganos en cada grupo no mostraron síntomas poco saludables en todo el curso del estudio. Estos resultados sugieren que no hay efectos secundarios notables o toxicidad fueron causadas por el
i.p..
Inyección de Pterostilbene y HPSB. Además, en los ratones que recibieron estos regímenes de tratamiento, no se observaron signos graves de toxicidad durante las inspecciones visibles de aspecto general y los exámenes microscópicos de los órganos individuales (datos no mostrados). Después de 15 días, el volumen del tumor en HPSB se inhibió significativamente en comparación con los ratones tratados con pteroestilbeno (Fig. 6A y 6B). El peso del tumor se inhibió en los ratones tratados con HPSB (Fig. 6C). Como se muestra en la figura 6D, los niveles de proteína de la COX-2, MMP-9, VEGF, ciclina D1, y pro-caspasa-3 se redujeron marcadamente en COLO 205 xenoinjertos de tumores del grupo tratado con HPSB /kg 10 mg en comparación con el Pterostilbene grupo. Nuestros resultados sugieren que HPSB podría servir como un agente prometedor novedoso para fines quimioterapéuticos contra el cáncer.
protocolo de tratamiento Experimental como se describe en Materiales y Métodos. Ratones portadores de xenoinjertos fueron COLO 205
i.p..
Inyección con Pterostilbene o 3'-hydroxypterostilbene durante 15 días en el grupo control se recibió aceite de maíz. (A) Fotografía de tumores de xenoinjertos desarrollados en cada grupo se muestra al final del Día 15. (B) volúmenes promedio de tumor se registraron durante los pesos tumorales medios de tratamiento y (C) se midieron al final del experimento. Seis muestras fueron analizadas en cada grupo, y los valores representan la media ± SD.
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P Hotel & lt; 0,05 y
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P Hotel & lt; 0,01, comparado con el grupo control.
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P Hotel & lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con Pterostilbene. (D) se extrajeron las proteínas totales de xenoinjertos de tumores en cada grupo para el análisis de transferencia Western. COX-2, MMP-9, VEGF, PCNA, ciclina D1 expresión de la proteína y se escindió de la caspasa-3 se detectaron mediante el uso de anticuerpos específicos. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
Discusión
En este estudio, por primera vez, se compara con el efecto inhibidor del crecimiento de células de cáncer de Pterostilbene y HPSB (Figura 1) en células de cáncer de colon humano. Los resultados de este estudio mostraron que HPSB más potentemente induce apoptosis y la autofagia que pterostilbeno en las células COLO 205. Este estudio indica que la diferencia en la bioactividad de HPSB comparar con pterostilbeno está relacionada con la presencia y posición de los grupos hidroxilo en la estructura química pterostilbeno básica. Las células humanas de cáncer de colon COLO 205 se sometieron a apoptosis después del tratamiento con HPSB, lo que sugiere que la apoptosis es la causa principal para el efecto inhibidor del crecimiento de HPSB. Estos datos deben proporcionar los químicos médicos con información novedosa para el diseño de agentes anti-tumorales, así como información para apoyar nuevos estudios biológicos de estos grupos funcionales modificados y no modificados en el futuro. Como se muestra en la Figura 2, HPSB es un fuerte inhibidor de la viabilidad celular y causa la inducción potente y rápida de la apoptosis en las células COLO 205. De hecho, el tratamiento con HPSB causa una reducción del potencial de membrana mitocondrial y la inducción de la caspasa-3 y caspage-9, que se asocia con la degradación de la DFF-45 y PARP, precedido de la aparición de apoptosis. El papel de las ROS en la inducción de apoptosis es bien reconocido. Curiosamente, un aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno intracelular en pterostilbeno, mientras que disminuyen significativamente los niveles de peróxido de hidrógeno en las células COLO 205 tratadas con HPSB (Fig. 2E). Especulamos que pterostilbeno penetra en la membrana celular en citosol y mitocondrias afecta ciclismo dioxígeno a través del conjunto de transporte de electrones. Sin embargo, HPSB podría recoger directamente en las células ROS y perturbar aún más el equilibrio redox intracelular.
El desarrollo del cáncer, un proceso dinámico y largo plazo, depende de muchos factores complejos con progresión gradual que conduce finalmente a una aplicación incontrolada y crecimiento de cancerosos las células de todo el cuerpo llama metástasis. Los estudios epidemiológicos han aportado pruebas convincentes de que los factores dietéticos pueden modificar este proceso [1]. La relación entre la apoptosis y la autofagia es compleja y varía entre tipos de células y diferentes tensiones. La autofagia también está genéticamente programada, promotores de la autofagia tienen el potencial de beneficio clínico en el contexto de la prevención del cáncer [24]. Como no se requiere la autofagia para el manejo efectivo del estrés metabólico, la promoción de la autofagia mediante la inhibición de mTOR podría esperarse para limitar la progresión del tumor [25]. compuestos naturales en la dieta ofrecen un gran potencial en la lucha contra el cáncer humano inhibiendo el proceso de carcinogénesis a través de defensa celular y los mecanismos de apoptosis [10]. La acumulación de pruebas indica claramente que la inducción de apoptosis y la autofagia como un mecanismo de prevención del cáncer de compuestos naturales en la dieta [24]. Hemos demostrado que los efectos anticancerígenos de HPSB están regulados por la apoptosis y la autofagia, y se identificaron las vías de señalización que median la autofagia inducida por HPSB. Nuestros resultados mostraron que después de la incubación con HPSB, las expresiones LC3I /II se aumentó notablemente en células COLO 205 (Fig. 3D). La PI3K /Akt y mTOR /p70s6k vías son las principales vías de señalización que regulan negativamente la autofagia [26].