Extracto
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina quinasas. EGFR se activa tras la unión a, por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), que conduce a la supervivencia celular, la proliferación y la migración. sobreactivación EGFR se asocia con la progresión del tumor. Hemos demostrado anteriormente que la iluminación baja dosis UVB de las células cancerosas que sobreexpresan EGFR antes de añadir EGF detuvo la vía de señalización de EGFR. Nosotros mostramos aquí que la iluminación UVB del dominio extracelular de EGFR (sEGFR) induce cambios conformacionales de proteínas, la rotura de puente de disulfuro y la formación de triptófano y tirosina fotoproductos como dityrosine, N-formylkynurenine y quinurenina. La espectroscopia de fluorescencia, dicroísmo circular y estudios térmicos confirman la ocurrencia de cambios conformacionales. Un inmunoensayo ha confirmado que la luz UVB induce cambios estructurales en el sitio de unión de EGF. Se utilizó un anticuerpo monoclonal que compite con el EGF para sEGFR de unión. Presentamos evidencia clara de que la luz UVB induce cambios estructurales en EGFR que deteriora la correcta unión de un anticuerpo específico de EGFR que compite con el EGF para la unión de EGFR, lo que confirma que la estructura 3D del dominio de unión a EGFR sufrió cambios conformacionales tras la iluminación UV. La irradiancia usada está en el mismo orden de magnitud que la intensidad integrada en el rango UVB solar. La nueva tecnología fotónica desactiva un receptor clave y es más probable aplicable al tratamiento de diversos tipos de cáncer, solos o en combinación con otras terapias
Visto:. Correia M, Thiagarajan V, Coutinho I, Gajula GP, Petersen SB, Neves-Petersen MT (2014) la modulación de la estructura del EGFR con Luz UV: nuevas posibilidades en la terapia del cáncer. PLoS ONE 9 (11): e111617. doi: 10.1371 /journal.pone.0111617
Editor: Federico Quaini, Universidad-hospital de Parma, Italia |
Recibido: 18 de mayo de 2014; Aceptado: 6 Octubre 2014; Publicado: 11 de noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Correia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. MC reconoce el apoyo de "Fundaco para a Ciência e Tecnologia" (FCT) para la concesión de doctorado (SFRH /BD /61012/2009) con el apoyo de "Programa Operacional potencial Humano "(POPH) en el marco de" Quadro de Referencia Estratégica Nacional "(QREN) y cofinanciado por el Fondo Social Europeo (" Fundo Europeu Social ", FSE). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la familia ErbB de receptores tirosina quinasas (RTK) juega un papel clave en la regulación de procesos celulares normales, tales como la supervivencia celular, la proliferación y la migración [1], [2] y tienen un papel crítico en el desarrollo y progresión de los cánceres de [3]. El receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR; ErbB1) es un miembro de esta familia [4]. la unión a ligandos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o la transformación del factor alfa de crecimiento (TGF-α) EGFR conduce a la dimerización del receptor y a la activación del dominio de tirosina quinasa intracelular [1], [2]. El dominio extracelular de EGFR (sEGFR, región extracelular soluble de EGFR) consta de 4 subdominios: 2 grandes dominios de unión homólogas (I y III), y 2 dominios ricos en cisteína similar a furina homólogas (II y IV). Dominios I, II y III se han encontrado a participar directamente en la unión del ligando y la formación de dímeros que preceden el mecanismo de la transducción de señales por las RTK [1], [5], [6]. la progresión del cáncer se ha correlacionado con el aumento en el número de moléculas de EGFR en la superficie celular [7]. Alta expresión de EGFR se asocia generalmente con la invasión, metástasis, enfermedad en etapa tardía, la resistencia a la quimioterapia, la resistencia a la terapia hormonal y los pobres resultados terapéuticos en general. la sobreexpresión de EGFR se ha encontrado que es un fuerte indicador de pronóstico en cabeza y cuello, de ovario, cervical, de la vejiga y el cáncer de esófago, un indicador de pronóstico modesto en mama, colorrectal, cáncer gástrico y de endometrio y de un indicador de pronóstico débil en no de células pequeñas de pulmón cáncer [7]. EGFR es el objetivo de muchos enfoques quimioterapéuticos porque los resultados de activación de EGFR en células cascadas de señalización que promueven el crecimiento del tumor. La inhibición de la función de EGFR es un enfoque de tratamiento racional. agentes quimioterapéuticos típicos son inhibidores de tirosina quinasa de EGFR que compiten con ATP en el dominio de tirosina quinasa intracelular, y anticuerpos monoclonales (mAbs) que impiden la unión del ligando o receptor de la dimerización. El bloqueo de la unión de EGF a EGFR puede suprimir la proliferación del cáncer, invasión, metástasis, la angiogénesis y la inhibición de la apoptosis [8].
Hemos informado anteriormente de que los rayos UVB iluminación (280 nm, 0,35 W /m
2 durante 30 min) de las células cancerosas que sobreexpresan EGFR llevado a la detención de la vía de señalización del EGFR [9]. Prueba de concepto se ha documentado en líneas celulares A431 (células de carcinoma epidermoide humano) y Cal39 (derivado de células de carcinoma de células escamosas de la vulva humanos). La irradiancia utilizado fue inferior al total UVB irradiancia solar [10]. UVB impidió la activación inducida por EGF de EGFR, la abolición de la fosforilación del dominio intracelular de EGFR y de otras proteínas de señalización clave aguas abajo tales como AKT (proteína quinasa B) y las activadas por mitógenos proteína quinasas (ERK1 y 2). AKT desempeña un papel clave en, por ejemplo metabolismo de la glucosa, la apoptosis, la proliferación celular, la transcripción y la migración celular. AKT está implicado en las vías de supervivencia celular mediante la inhibición de los procesos de apoptosis [11] - [16]. Las quinasas ERK actúan de una cascada de señalización que regula los procesos celulares como la proliferación, la diferenciación y la progresión del ciclo celular [17].
Una de las posibles razones de la detención inducida por la luz UV observado de la vía de señalización del EGFR es la UVB inducido fotoquímica, que conduce a cambios conformacionales en EGFR que muy probablemente impiden la unión correcta de EGF. Nuestro trabajo previo sobre la fotoquímica inducida por UVB en proteínas (longitudes de onda 275-295 nm utiliza) [18] - [22] apoya esta hipótesis. excitación UVB de residuos aromáticos en las proteínas conduce a la interrupción de los puentes disulfuro y a la formación de fotoproductos, tal como N-formylkynurenine (NFK), quinurenina (Kyn) [23], [24] y dityrosine (DT) [25] - [27] (véase la Figura 1). Tales reacciones más probable es inducir cambios estructurales en proteínas que perjudiquen su actividad [22]. Las proteínas que son ricos en residuos y puentes disulfuro aromático es probable que tengan su estructura considerablemente disminuida tras la excitación UVB prolongada. sEGFR es extremadamente rica en puentes disulfuro cuando se compara con el promedio de abundancia natural de puentes disulfuro en las estructuras de proteínas de la talla de sEGFR, como se muestra en la sección de resultados. El% de puentes disulfuro en sEGFR es aproximadamente 13 veces mayor de lo esperado para una proteína de su tamaño. Los resultados medios previstos han sido reportados previamente por nuestro grupo después de un análisis exhaustivo de las características de los puentes disulfuro presentes en 131 no homólogas estructuras proteína de cadena única [28]. Además, el dominio extracelular de sEGFR tiene 40 residuos aromáticos y 25 puentes disulfuro por monómero y muchos de los residuos aromáticos están muy cerca de puentes disulfuro (ver Figura 2). Por lo tanto, es probable que la iluminación UV de esta proteína dará lugar a la rotura de disulfuro de puente y a fotoproductos. Esta hipótesis se pondrá a prueba en nuestro documento actual.
(A) Estructura cristalina del dominio extracelular del EGFR (1ivo.pdb, cadena A) [1]. Los puentes disulfuro y átomos de residuos aromáticos se muestran como CPK: puentes SS en amarillo, Trp en verde, Tyr en violeta (TRY 246 y Tyr 251 se muestran en color rosa) y Phe en cian. Sólo 18 de los 25 puentes SS, 5 de 6 residuos de Trp, 13 de los 16 residuos Tyr y 17 de los 18 residuos de fenilalanina se visualizan ya que algunos residuos no están presentes en el archivo PDB. estructura (B) Crystal de un complejo entre 1:01 EGF humano y la forma dimérica de EGFR dominio extracelular (1ivo.pdb, cadena A y B y 2 EGF moléculas [1]). EGF se muestra en rojo. (C) Zoom en la región de interfaz presente en el dimérica del EGFR (dominios extracelulares). También se muestran las distancias entre algunos de los residuos aromáticos y de los puentes disulfuro cercanas. estructura (D) Crystal de un complejo entre 1:01 EGF humano y la forma dimérica de EGFR dominio extracelular. (1ivo.pdb, cadena A y B y 2 moléculas de EGF [1]) EGF se muestra en rojo. En el panel derecho de todos los átomos se muestran como CPK. EGF de acoplamiento para sEGFR implica amplios contactos no covalentes.
Mientras que los peligros de la exposición excesiva a la luz solar han sido publicados, se ha prestado menos atención a los beneficios para la salud de la exposición UV. Los efectos de la luz UV en biomoléculas, células y tejidos dependerá de la energía entregada por unidad de área. UVB (280-315 nm) de radiación es el principal contribuyente a la producción de vitamina D, que tiene un efecto protector en el colon, próstata, y cáncer de mama [29], [30]. La exposición a la luz solar en dosis bajas también se ha relacionado con la mejora de las tasas de supervivencia del cáncer [31], [32]. luz UV se ha utilizado con éxito para tratar el raquitismo, la psoriasis, el lupus vulgar, vitíligo, dermatitis atópica y esclerodermia localizada e ictericia (Organización Mundial de la Salud Los efectos conocidos para la salud de la radiación UV
ULTRAV Programa INTERSUN Radiat -..... Preguntas frecuentes
en http://www.who.int/uv/faq/uvhealtfac/en/index1.html). No hay evidencia directa y concluyente que sugiera un aumento del riesgo de cáncer de piel por tratamientos UVB para la psoriasis si se respetan las dosis de radiación. luz UV se utiliza actualmente para tratar el linfoma cutáneo de células T (American Cancer Society, 2011 a http://www.cancer.org). Esta terapia ha sido mejorada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, EE.UU.). Se han notificado los efectos protectores de la exposición al sol de fin de semana regular, en particular en el caso de los tumores de las extremidades [33]. El melanoma es más frecuente entre las personas con ocupaciones de interior que entre las personas que tienen actividades al aire libre (sin quemadura solar), tales como agricultores, pescadores, y los niños que juegan al aire libre [34], [35]. El cáncer de piel está todavía en aumento, pero esto es un resultado de la exposición a la luz UV tanto por sobredosis aguda (eritema solar) y la exposición acumulativa de toda la vida [36]. Es principalmente la fracción UVB de la radiación solar que da eritema, la melanogénesis (la producción de melanina, que actúa como un protector solar la protección contra el daño solar de ADN y eritema), la síntesis de vitamina D, y cáncer de piel no melanoma, mientras que el melanoma es probable que sea causada por UVA [37]. Jones et al (1987) encontraron que entre las longitudes de onda UVA, 365 nm tenían el más alto efecto mutagénico [38]. las tasas de fluidez UVA son varias veces más alto para las tumbonas que en el caso de la radiación solar directa [39]. Los ejemplos anteriores documentan que los efectos sobre la salud de la exposición a los rayos UV son dosis dependientes y longitud de onda.
El objetivo del presente trabajo es investigar si una dosis baja de la luz UVB puede inducir cambios estructurales en el sitio de EGF de EGFR de unión que podría poner en peligro el correcto unión de moléculas, tal anticuerpo específico que se sabe que competir con EGF por la unión de EGFR. Si se observa, lo que nos dará una idea de la razón por la iluminación UVB (280 nm) de las células cancerosas que sobreexpresan EGFR condujo a la detención de la vía de señalización del EGFR [9]. La irradiancia UVB usada está en el mismo orden de magnitud que la irradiancia total de UVB solar. La espectroscopia de fluorescencia y estudios de dicroísmo circular se llevaron a cabo con el fin de detectar cambios conformacionales inducidos UVB. estudios de desplegamiento térmico se han realizado con el fin de determinar el punto de la proteína de fusión antes y después de la iluminación. rotura inducida por la luz de puentes disulfuro se ha cuantificado y se ha detectado la formación de fotoproductos Trp /Tyr. Un inmunoensayo de unión se llevó a cabo con el fin de inferir los efectos de iluminación UVB en la estructura del sitio de unión de EGF. Nuestro estudio confirma que bajo UVB dosis (280 nm) iluminación de sEGFR induce cambios estructurales en el dominio de unión a EGFR que altera la unión de un anticuerpo específico conocido para competir con EGF de EGFR de unión a ese dominio particular. Nos dirigimos a los efectos beneficiosos de la luz UV, su aplicación actual en el tratamiento de las enfermedades y el potencial de nuestra terapia fotónica nuevo putativo para el tratamiento de tumores localizados asociados con la sobreexpresión de receptores celulares sensibles UV.
Resultados
estructura tridimensional de monómero y dimérica sEGFR
en la Figura 2A se muestra la estructura 3D de sEGFR monomérica (1ivo.pdb, cadena a) unido a Factor de Crecimiento epidérmico (EGF, en rojo) . sEGFR contiene 25 puentes SS, 6 residuos de Trp, Tyr 16 residuos, y 18 residuos de fenilalanina, que se muestran como CPK: puentes SS en amarillo, Trp en verde, Tyr en violeta (Tyr246 y Tyr251 en rosa) y Phe en cian. Sólo 18 de los 25 puentes SS, 5 de 6 residuos de Trp, 13 de los 16 residuos Tyr y 17 de los 18 residuos de fenilalanina se visualizan ya que algunos residuos no están presentes en el archivo PDB. Varios residuos aromáticos se encuentran en estrecha proximidad espacial de los enlaces SS.
En la Figura 2B se muestra la estructura 3D del dímero EGFR (1ivo.pdb, las cadenas A y B) formado tras la unión de EGF (en rojo). La interfaz de dímero es rica en puentes disulfuro y residuos aromáticos (Fig. 2B). Los residuos Tyr246 y Tyr251 (Figura 2B, en rosa) de una cadena, se entrelazan con los mismos residuos de la otra cadena. Un zoom en una de las cadenas se muestra en la Figura 2C y se muestran las distancias entre los residuos aromáticos y puentes disulfuro. EGF a EGFR de acoplamiento se muestra en la Figura 2D (monómero EGFR). La interacción entre EGFR y EGF parece ser fuertemente dependiente de interacciones de Van der Waals. Algunas de esas interacciones son las interacciones π-pi, tales como la interacción entre Phe357 (en cian) de sEGFR y Tyr13 (en violeta) de EGF (5 Å).
Proteína Bioinformática
la Figura 3 se muestra la fracción de puentes disulfuro presentes en sEGFR y la dependencia de la fracción promedio de puentes de disulfuro en la longitud de la cadena de proteína [28]. La fracción media esperada de los puentes disulfuro de las proteínas con la secuencia de longitud de 600-650 residuos es ~ 0,3%, mientras que en sEGFR (622 aa) es ~ 4%, confirmando que esta proteína es muy rica en puentes disulfuro. Los resultados promedio esperados se ha informado anteriormente por nuestro grupo después de hacer un análisis exhaustivo de las características de los puentes disulfuro presentes en 131 no homólogas estructuras de proteínas de una sola cadena [28].
Se calculó la fracción de puentes disulfuro como el número de puentes disulfuro que se encuentran en una proteína dividida por la longitud de la secuencia de proteína (número de aminoácidos) x 100. se muestra la fracción de puentes disulfuro presentes en el dominio extracelular monomérico de EGFR.
Estado estacionario fluorescencia
La intensidad de emisión de fluorescencia de sEGFR a 350 nm disminuye tras la continua excitación de 280 nm (Figura 4A). La traza cinética se adapta mejor por un modelo bi-exponencial (Figura 4A y métodos). La raíz del error cuadrático R
2 fue de 0,99774. Los valores recuperados del apropiado para C1 y C2 fueron 367.240,44 ± 1182,23 y 1054,90 ± 208.449,95, respectivamente. Las constantes de velocidad de emisión de fluorescencia de intensidad disminución K1 y K2 valores ajustados fueron 117,63 ± 0,71 min-1 y 12,20 ± 0,10 min-1, respectivamente.
cinética de intensidad (A) emisión de fluorescencia a 350 nm de EGFR extracelular humana (sEGFR) muestra durante la iluminación UV 75 min a 280 nm. (B) los espectros de emisión de fluorescencia de las muestras de sEGFR obtenidos a 295 nm de excitación después de 280 nm para la iluminación 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. (C) de la fluorescencia de excitación espectros de muestras sEGFR grabados con emisión fijado a 334 nm de excitación después de 280 nm para la iluminación 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min.
Emisión Spectra (excitación 280 nm y 295 nm).
espectros de emisión de sEGFR se registraron a 280 nm de excitación antes y después de la iluminación continua 280 nm (15 min, 30 min, 45 min y 75 min a 2,5 W /m
2) (no mostrado). Una disminución en la intensidad de la emisión de fluorescencia a ~337 nm, donde Trp y Tyr emiten, se observa debido a la iluminación continua. La intensidad de emisión a 337 nm disminuye en un 43% y un 74% después de 15 min y 75 min de la iluminación continua de 280 nm, respectivamente. La longitud de onda del pico más intenso centrada a 337 nm se mantiene constante.
Los espectros de emisión de sEGFR registró a 295 nm de excitación antes y después de la iluminación continua 280 nm (15 min, 30 min, 45 min y 75 min ) se muestran en la Figura 4B. Una disminución en la intensidad de la emisión de fluorescencia a ~337 nm, donde Trp emite, se observa. La intensidad de emisión de sEGFR a 337 nm disminuye en 42% y 77% después de 15 min y 75 min de iluminación continua 280 nm, respectivamente. La longitud de onda del pico más intenso centrada a 337 nm se observa al desplazamiento hacia el rojo a 343 nm después de 75 min de la iluminación.
Excitación Spectra (emisión 334 nm).
En la Figura 4C es muestra los espectros de excitación de sEGFR con emisión de fluorescencia fijado en 334 nm, antes y después de la iluminación continua 280 nm de la proteína para diferentes períodos de tiempo: 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. Trp y Tyr absorción contribuyen a este espectro. Continua 280 nm iluminación conduce a una disminución progresiva de la intensidad de excitación de fluorescencia. Después de 15 min y 75 min de la iluminación, la intensidad de excitación a 282 nm disminuye en 40% y 71%, respectivamente. Los espectros de excitación normalizado correspondiente (no mostrado) no muestran ningún cambio en la longitud de onda en la intensidad de excitación máxima (~282 nm).
a base de proteínas de fluorescencia estudios de desplegamiento térmico.
La intensidad de emisión de fluorescencia a 330 nm (exc. 295 nm) de una muestra sEGFR fresco (no Illum.) y sistema de iluminación de la muestra sEGFR (75 min a 280 nm) se controló a partir de 4 ° C a 90 ° C y de 90 ° C a 4 ° C (ver Fig. 5). Para las dos muestras de la intensidad de emisión de fluorescencia disminuye con el calentamiento. Una transición entre 65-75 ° C se observa para el sEGFR no iluminado. Los datos se han ajustado utilizando una función de Boltzmann modificado (véase métodos). La raíz del error cuadrático medio para la instalación de I
2 fue de 0,99774. Los valores recuperados de la instalación de
Un
1,
B Opiniones 1,
Una página 2,
B página 2 y
dx
fueron 1,06202 ± 0,0014, 0,45482 ± 0,02255, -0.00426 ± 5.41E-04, -0.00296 ± 2.72E-04 y 1,74 ± 0,17, respectivamente. El parámetro recuperado
x
0 (69,7 ° ± 0,24 ° C C) se corresponde con el punto medio de la transición, es decir, a la temperatura de fusión de la proteína. Este valor está de acuerdo con los valores de los puntos de inflexión obtenidos a partir de la segunda derivada de los datos empotrados (no mostrado). La segunda derivada es cero (punto de inflexión) dentro del intervalo de 68,3 a 69,2 ° C. Tal transición no se observa para la muestra iluminada. Además, no se observa ninguna transición para ambas muestras cuando el enfriamiento de la proteína a partir de 90 ° C a 4 ° C.
sistema de iluminación (no Illum.) Y UV iluminado (Illum. Para 75 min) EGFR extracelular humana (sEGFR Non muestras) se calentaron a partir de 4 ° C a 90 ° C. valores ajustados (muestra no iluminada) se obtuvieron utilizando una función de Boltzmann modificado (véase la sección Resultados). La transición punto medio recuperado de la instalación se encontraba en 69,72 ± 0,24 ° C.
Tiempo Fluorescencia Resuelta.
Los tiempos de decaimiento (τ
i) y pre-exponencial factores (
f
i) se recuperó a partir del momento intensidad resuelto decae para la muestra de control sEGFR (75 min en el control oscuro, negativo, NC) y la muestra sEGFR sistema de iluminación (Illum. durante 75 minutos a 280 nm) a pH 7,5 se dan en la Tabla 1. la Figura 6 muestra los datos experimentales, el ajuste y los residuos suponiendo tres vida decae para la muestra de control sEGFR (NC). El valor de χ
2 se redujo significativamente cuando progresando desde un componente de una sola vida en condiciones de dos y de tres componentes. La fluorescencia media vida de sEGFR se muestra en la Tabla 1. No iluminado sEGFR muestra tres vidas: 1,04, 2,74 ns ns ns 6,23 y con fracciones de intensidad de 25,6%, 53,1% y 21,1%, respectivamente. Tras la iluminación, la contribución de los más cortos vivió 1,04 ns especies aumentó de 25,6% a 30,6%, la contribución de las especies de 2,74 ns se mantuvo constante y la contribución de las especies de larga vida se redujo de 21,1% a 16,4%. Además, la vida útil del componente de vida más larga aumentó de 6,2 a 7,0 ns ns mientras que el tiempo de vida de los otros dos componentes se mantuvo constante.
Los datos de tiempos con resolución de decaimiento intensidad, ajuste de curvas y los residuos obtenidos mediante la rutina de la ISS para la muestra de control sEGFR (mantenido en la oscuridad durante 75 min, control negativo, Carolina del Norte).
excitación Spectra (emisión 400 nm).
se muestran
en la Figura 7A los espectros de excitación (emisión a 400 nm) obtenidos antes y después de la iluminación continua 280 nm (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 62 min y 75 min). Los espectros se registraron con el fin de verificar la presencia de NFK, dityrosine y Kyn (Fig. 1). En la Tabla 2 se muestran sus propiedades de emisión de absorbancia y fluorescencia. En el min 0, un pico de excitación se observa centrada en ~281 nm. Su intensidad decae tras la iluminación UV de sEGFR, disminuyendo 52% después de 75 min. Sin embargo, la iluminación de sEGFR conduce a un aumento de la excitación de fluorescencia por encima de 305 nm. Después de 75 minutos, la intensidad de excitación de fluorescencia aumentó 115% a 315 nm, donde dityrosine absorbe al máximo (Abs
máximo en 316 nm, [40], véase la Tabla 2), 149% a 322 nm, donde NFK absorbe al máximo (Abs
máximo en 321 nm, [23], véase la Tabla 2) y 173% a 360 nm, donde Kyn absorbe al máximo (Abs
máximo a 360 nm, [23], véase la Tabla 2).
(a) fluorescencia de espectros de emisión de muestras de EGFR extracelular humana (sEGFR) registradas en 320 nm de excitación después de 280 nm para la iluminación 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. espectros de emisión (B) de la fluorescencia de sEGFR registró a 360 nm de excitación después de la iluminación 280 nm para 0 min, 15 min, 30 min, 45 min y 75 min. (C) de la fluorescencia de excitación espectros de sEGFR obtiene con la emisión de fluorescencia fijado en 400 nm después de 280 nm para la iluminación 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min.
emisión Spectra (excitación 320 nm).
a fin de comprobar la formación de dityrosine (DT) y NFK, espectros de emisión se obtuvieron a 320 nm de excitación antes y después de 280 nm de iluminación (Fig. 7B). Se observa un aumento en la intensidad de emisión de fluorescencia a 400-405 nm (exc. 320 nm). El máximo de emisión de fluorescencia se centra ~ 400 nm, que corresponde al máximo de emisión de DT (Em
max En 400 a 409 nm, [25], [40], véase la Tabla 2) y para una región espectral en la NFK también pueden emitir (por NFK, Em
max en 400-440 nm [23], Tabla 2). Después de 75 minutos, la intensidad de emisión de fluorescencia a 400 nm aumenta en un 129%. Un pequeño pico de emisión en ~368 nm se observa en los espectros obtenidos a 0 min y 15 min de iluminación debido a la contribución Raman de agua. correcciones espectrales Raman no eliminar por completo este pico.
espectros de emisión (excitación 360 nm).
Con el fin de verificar la presencia de quinurenina (Kyn) (Abs
máximo a 360 nm , [23], Tabla 2) en sEGFR, los espectros de emisión se obtuvieron a 360 nm de excitación antes y después de 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min de 280 nm iluminación (Fig. 7C). Kyn absorbe al máximo a 360-365 nm y emite fluorescencia al máximo en ~434-480 nm ([23], la tabla 2). iluminación UVB continua de sEGFR conduce a un aumento de la fluorescencia centrada en ~430-435 nm. La intensidad de fluorescencia a 430 nm aumentó 53% y el 172 después de 15 min y 75 min de iluminación, respectivamente.
El grupo tiol cuantificación
Con el fin de confirmar que la iluminación UV de sEGFR ha dado lugar a la interrupción de las SS , la concentración de grupos tiol accesibles al disolvente se ha determinado con el ensayo de Ellman para una muestra de control sEGFR mantenido en la oscuridad durante 75 min (control negativo, NC) y para una muestra previamente iluminado a 280 nm durante 75 min. La concentración detectada de grupos tiol libres es 2,9 veces mayor en la muestra iluminada (Fig. 8). grupos tiol libres en sEGFR sistema de iluminación es de ~ 1 M
.
La muestra de control de sEGFR se mantuvo en la oscuridad durante 75 min (control negativo, Carolina del Norte). grupos tiol libres se han detectado utilizando el ensayo de la Ellmann.
estudios de dicroísmo circular
En la Figura 9A Se muestran los espectros de CD de sEGFR fresca (no Illum.) e iluminadas sEGFR ( 75 min a 280 nm). El espectro CD UV lejano de la sEGFR no iluminado muestra algunas de las características clásicas UV lejano de estructura secundaria de proteínas, con la presencia de un doble mínima a 208-210 nm y 220-222 nm, característica de contenido de α-helicoidal . de hoja beta contenido estructural (mínimo característica a ~218 nm) también puede contribuir para el segundo mínima a 220-222 nm [41]. excitación prolongado con luz UVB conduce a una disminución en la intensidad de elipticidad a 205 a 225 nm y a un desplazamiento espectral. La elipticidad en 207,5 nm y a 220 nm se ha reducido en 9% y 20%, respectivamente. Por otra parte, el primer pico negativo ha pasado de 207,5 nm a 203 nm.
(A) Lejos UV CD espectros se registraron para una solución fresca sEGFR (no Illum.) Y una muestra sEGFR que fue iluminado con anterioridad a 280 nm (Illum. durante 75 min). (B) circulares dichroim curvas de desplegamiento térmico de sEGFR fresco (no Illum.) Y UVB iluminado sEGFR (Illum de 75 min.) Se obtuvieron tras el calentamiento de 4 ° C a 90 ° C (1 ° C.min
- 1). La señal de elipticidad se controló constantemente a 220 nm. La temperatura de fusión de la no iluminada sEGFR, que corresponde a la transición punto medio de la curva, se recupera tras ajustar la curva con una función de Boltzmann (véase métodos).
proteínas a base de dicroísmo circular desplegamiento térmico estudios.
La intensidad elipticidad a 220 nm de sEGFR fresca (no Illum.) y de sEGFR sistema de iluminación (75 min a 280 nm) fue monitorizada continuamente a partir de 4 ° C a 90 ° C (Fig. 9B). Para las dos muestras de la intensidad de elipticidad a 220 nm disminuye con el calentamiento. Una transición con el punto medio entre 60-70 ° C se observó para la muestra no iluminado sEGFR. Los datos ha sido equipado con una función de Boltzmann (véase métodos). La raíz del error cuadrático medio para la instalación de I
2 fue de 0,99921. Los valores recuperados de la instalación de
Un
1,
Una página 2 y
dx
fueron -0.96 ± 9.97E-4, -0.83 ± 0,002 y 2,59 ± 0,08 , respectivamente. La temperatura de mediados de transición
x
0 valor ajustado fue 64,70 ± 0,07 ° C, que corresponde a la temperatura de fusión de la proteína. Este valor está de acuerdo con el valor recuperado por espectroscopia de fluorescencia se muestra en la Figura 5. Tal transición no se observa para la muestra iluminada.
EGFR inmunoensayo de unión
A inmunoensayo de unión se utiliza para el acceso indirectamente los efectos de la iluminación UV en la estructura del sitio de unión a sEGFR EGF /TGF-α. Resultados que se muestran en la Figura 10 muestran que no iluminado sEGFR se une LA1 anti-EGFR (carriles "No-UV", muestra fresca; y "NC", el control negativo, muestra mantuvo en la oscuridad durante 75 min). muestra sEGFR ilumina con la luz 280 nm para 75 min ya no se une LA1 anti-EGFR, confirmada por la desaparición completa de la banda sEGFR (Figura 10, carriles "UV"). Se analizaron dos conjuntos de muestras duplicadas. se muestran los perfiles de intensidad de la señal a lo largo de las bandas de proteína. La intensidad observada en las regiones en las que estuvo presente iluminada sEGFR (carriles "UV") está dentro del nivel de ruido percibido (intensidad de ruido de ~0.02 a 0,2).
En cada pocillo, exactamente 1,4 g de la no iluminada ( "No-UV"), UV iluminó durante 75 minutos ( "UV") y el control negativo ( "NC") sEGFR muestras se cargaron. Las muestras cargadas en bien 1-3 son duplicados de las muestras 4-6, pero fueron tratados de forma independiente después de la iluminación UV. El perfil de intensidad a lo largo de los pozos de muestra que se observa la señal en los pocillos con la proteína no iluminado, pero no hay señal presente en los pocillos que contienen las muestras de proteínas UV iluminada.
Discusión
UVB excitación de residuos aromáticos conduce a la formación de fotoproductos. El triptófano puede formar triptofanoil radical catiónico, N-formylkynurenine (NKF) y quinurenina (Kyn) (Fig. 1). NFK y Kyn son de particular importancia, ya que son fotosensibilizantes que pueden generar especies reactivas de oxígeno (ROS) tras la absorción UV [42], lo que contribuye a los daños estructurales de proteínas. se conocen los residuos de tirosina para ser convertido en, por ejemplo, tirosil radicales, dityrosine, trityrosine y pulcherosine (Fig. 1). Estas reacciones son propensos a conducir a cambios o a la pérdida completa de la estructura y función de proteínas [22], [43]. excitación UVB también conduce a electrones de eyección de las cadenas laterales de los residuos aromáticos [20], [24], [44] - [46]. El electrón puede ser capturado por puentes de disulfuro, dando lugar a la formación de un electrón disulfuro RSSR aducto transitoria
• - (ver esquemas 1-8, [49]), que, después de la disociación se formarán grupos tiol libres (Esquema 9, [ ,,,0],47]). La naturaleza ha mantenido residuos aromáticos en estrecha proximidad espacial de disulfuro puentes (SS) en las proteínas [19], [28], por lo que la interrupción de las SS un caso probable tras la excitación UV. Los esquemas siguientes resumen algunos de los productos fotoquímicos formados que contribuyen a la interrupción de las SS, que conduce a cambios de conformación que pueden conducir a la pérdida de la función de las proteínas. Para más detalles, véase la bibliografía de referencia [21], [22], [24]. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Las proteínas ricas en residuos y puentes disulfuro aromático son más vulnerables a la fotoquímica y daños. sEGFR es una proteína tal. Cuenta con un total de 6 Trp, Tyr 16, 18 residuos de fenilalanina y 25 puentes disulfuro (Figura 2A). Curiosamente, residuos aromáticos y puentes disulfuro desempeñan un papel estructural crítico en la interfaz de dímero (figuras 2B, 2C, y 2D) que indica que UVB inducida fotoquímica lo más probable es poner en peligro la dimerización EGFR. La proximidad entre los residuos aromáticos y puentes de disulfuro (Figura 2C) promueve la transferencia de electrones a partir de los residuos aromáticos a los puentes, lo que lleva a su interrupción. inactivación de proteínas inducida por UV implica la transferencia de electrones de corto alcance rápido y entre los residuos aromáticos fotoexcitados y puentes disulfuro cercanos [20], [44], [45], [48]. Zhi Li et al. [49] demostraron que la transferencia de electrones rápida es coherente con la transferencia directa de electrones entre el triptófano triplete y un puente disulfuro en la zona, que lleva a RSSR
• - y probablemente puente rotura (esquemas 8 y 9). Como se muestra en la Figura 3, las proteínas tan grandes como sEGFR (600-650 aa) se observa que tienen una fracción media de puentes disulfuro no mayor de ~ 0,3%. Esto es probablemente debido al efecto estabilizador de la gran núcleo hidrófobo. Huang et al. Zhang et al.