Extracto
La angiogénesis se produce durante el crecimiento de los tejidos, el desarrollo y la cicatrización de heridas. También se requiere para la progresión tumoral y representa un objetivo racional para la intervención terapéutica. NBM-T-BMX-OS01 (BMX), derivado de la semisíntesis de osthole, un ingrediente activo aislado de hierba china
Cnidium monnieri
(L.) Cuss., Se ha demostrado recientemente para mejorar el aprendizaje y la memoria en ratas . En este estudio, hemos caracterizado las actividades anti-angiogénicos de NBM-T-BMX-OS01 (BMX) en un esfuerzo por desarrollar nuevos inhibidores para suprimir la angiogénesis y el crecimiento tumoral. BMX inhibe el factor de crecimiento endotelial (VEGF) inducida por la proliferación vascular, la migración y la formación de tubo endotelial en células endoteliales umbilicales humanas (HUVEC). BMX también atenuada microvascular inducida por VEGF que brota de anillos de aorta
angiogénesis inducida por células ex vivo
y cáncer colorrectal HCT116 reducida
in vivo
. Por otra parte, BMX inhibe la fosforilación de VEGFR2, FAK, Akt y ERK en HUVECs expuestas a VEGF. BMX también ha demostrado inhibir la proliferación de células HCT116 y para suprimir el crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de células HCT116
in vivo
. Tomados en conjunto, este estudio proporciona pruebas de que BMX modula la remodelación de las células endoteliales vasculares y conduce a la inhibición de la angiogénesis tumoral. Estos resultados también apoyan el papel de BMX como un candidato potencial de drogas y garantiza el desarrollo clínico en el tratamiento del cáncer
Visto:. Yang HY, Hsu YF, Chiu PT, Ho SJ, Wang CH, Chi CC, et al. (2013) Actividad anti-cáncer de un derivado Osthole, NBM-T-BMX-OS01: Alcance de crecimiento endotelial vascular del receptor del factor de señalización y la angiogénesis. PLoS ONE 8 (11): e81592. doi: 10.1371 /journal.pone.0081592
Editor: Masuko Ushio-Fukai, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Junio, 2013; Aceptado 15 de octubre de 2013; Publicado: 27 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de subvención del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán [NSC98-2320-B-038-007]; conceder [99TMU-FMH-02-4] en el Hospital de la Universidad de Fang Medicina de Taipei-Wan, Taipei, Taiwán; y otorgar [LSH-2012-04] del Hospital Landseed, Taoyuan, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. NatureWise Biotech & Amp; Medicals Corporation es el desarrollador y propietario de la patente en BMX y sus derivados en varios países. Nombre de patente: COMPUESTOS Y DERIVADOS DE LOS MISMOS para la inhibición de la histona deacetilasa cinámico. Número de patente: US7994357. Shiau-Ho Jing, Chi-Han Wang, Chih-Chi Chin, Cheng-Feng Lee y Li Ying-Shiuan son empleados por NatureWise Biotech & amp; Medicals Corporation. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La angiogénesis es un proceso complejo por el cual nueva los vasos se forman a partir vasculatura preexistente. No sólo contribuye a diversos procesos fisiológicos, sino que también desempeña un papel importante en la progresión del tumor y la diseminación metastásica de los tumores [1] - [3]. vascularización del tumor generalmente se correlaciona con un mal resultado. La angiogénesis tumoral iniciada ha sido por lo tanto un objetivo atractivo para el desarrollo de terapias contra el cáncer [4]. Durante el crecimiento inicial del tumor avascular, las células tumorales superan la limitación de la distancia de difusión de los vasos sanguíneos cercanos y hipóxico convertido. El equilibrio entre la señalización angiogénica y anti-angiogénica se desplaza hacia la formación de vasos sanguíneos [5]. Este cambio angiogénico activa entonces una serie de transcripciones de genes e inicia la angiogénesis [6]. Numerosos factores angiogénicos que incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [7], factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) [8], [9], factor de crecimiento epidérmico (EGF) y angiopoyetina [10] han sido implicados en la angiogénesis tumoral. Entre estos reguladores angiogénicos, VEGF-A, un miembro de la familia VEGF, es el mediador más importante y específica que promueve la angiogénesis [11], [12]. Se requiere VEGF-A de la quimiotaxis y la diferenciación de las células endoteliales precursoras, proliferación de células endoteliales, la vasculogénesis y la remodelación angiogénico [13]. Las respuestas celulares a VEGF-A son mediados por el receptor tirosina quinasa VEGFR2 (conocido también como KDR o Flk-1) en la superficie de las células endoteliales [14]. La activación de VEGFR2 enciende las cascadas de señalización, incluyendo la quinasa extracelular regulada por señal (ERK), Akt (también conocida como proteína quinasa B), la quinasa de adhesión focal (FAK) y quinasas de la familia Src [15]. La vía de señalización de Akt regula la migración de células endoteliales, la proliferación y la apoptosis [16]. vía ERK activado por VEGF se ha implicado en diversas actividades celulares incluyendo la proliferación, la diferenciación, la motilidad celular y la supervivencia [17]. FAK también contribuye a la malignidad del tumor [18]. Por estas razones, VEGF y VEGFR2 son reconocidos como objetivos atractivos para la intervención terapéutica de cáncer [19]. Muchas estrategias para inhibir la señalización de VEGF se están evaluando en ensayos clínicos. Estos incluyen receptores solubles que secuestran VEGF [20], anticuerpos dirigidos a VEGF o VEGFR [21], y los inhibidores de molécula pequeña de VEGFR2 [22]. Por otra parte, algunos inhibidores de moléculas pequeñas tales como sorafenib y sunitinib ya han sido aprobados por la Food and Drug Administration para el tratamiento de determinados tipos de cáncer [23].
Cnidium monnieri gratis (L. ) Cuss. Desde hace tiempo ha sido ampliamente utilizado en la medicina oriental para mejorar la inmunidad y para aliviar la hepatitis. Osthole, un componente bioactivo extraído de las semillas de
Cnidium monnieri gratis (L.) Cuss., Por lo tanto se espera que tenga actividades inmunomoduladoras. Estudios recientes también han demostrado que posee osthole [24], [25] hepatoprotector, actividades anti-diabéticos [26], y neuroprotectores contra el cáncer [27], [28]. amplio espectro de osthole Dada de actividades biológicas, que parece ser un compuesto de plomo prometedor para el descubrimiento de fármacos. Recientemente, NBM-T-BMX-OS01 (BMX) (Fig. 1), un derivado semisynthesized de osthole, fue identificado como un inhibidor de la histona desacetilasa potente y se muestra para mejorar el aprendizaje y la memoria en ratas [29]. En un esfuerzo por descubrir los inhibidores de la angiogénesis del tumor, de este modo, evaluamos las propiedades anti-angiogénicas de BMX. En este estudio, hemos demostrado que BMX inhibió la proliferación inducida por VEGF de células, la migración y la formación de tubos en las células endoteliales umbilicales humanas (HUVEC). fosforilación inducida por VEGF de VEGFR2, Src, ERK, Akt y FAK también fueron suprimidas en HUVECs expuestos a BMX. Mediante el uso de células de cáncer colorrectal HCT116 modelo de angiogénesis xenoinjerto, BMX se muestra adicionalmente para suprimir la angiogénesis asociada a tumores. Además, BMX inhibió significativamente la proliferación de HCT116 colorrectal de células cancerosas y suprimió el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de tumor. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren la posibilidad de BMX como un agente terapéutico con actividad doble, conforme a la proliferación tumoral y la angiogénesis.
Materiales y Métodos
Reactivos
3 - [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT), azul de toluidina O, y medio McCoy5A fueron de Sigma (St Louis, MO). 199 (M199), medio de suero fetal bovino (FBS), y todos los reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Los anticuerpos contra CDK4, VEGFR2, VEGFR2 fosforilados en tirosina 1175 (Y1175), VEGFR2 fosforilados en tirosina 1214 (Y1214), ERK1 /2, ERK1 /2 fosforilada en la treonina 202 /tirosina 204 (T202 /Y204), Akt, Akt fosforilada en serina 473 (S473), y FAK FAK fosforilada en la tirosina 397 (Y397), Src y Src fosforilados en tirosina 416 (Y416) fueron adquiridos de Señalización celular (Danvers, MA). Los anticuerpos específicos para p21 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra GAPDH, α-tubulina, survivin y cyclinD1 y anti-anticuerpos de ratón y peroxidasa IgG anti-conejo conjugada se adquirieron de GeneTex Inc (Irvine, CA). El kit de detección de quimioluminiscencia fue de GE Healthcare (Little Chalfont, Reino Unido). La proliferación de células kit de ensayo de ELISA, BrdU fue adquirido de Roche (Indianápolis, IN). Todos los materiales para la inmunotransferencia se adquirieron de GE Healthcare (Little Chalfont, UK). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
NBM-T-BMX-OS01 (BMX)
BMX, (
E
) -2 - (4-metoxibenciloxi) -3-prenil-4-metoxi
N
-hydroxycinamide, fue proporcionada por NatureWise Biotech & amp; Medicals Corporation (Taipei, Taiwán), y sus grados de pureza (& gt; 99%) fueron confirmados por
análisis de 1H-RMN y HPLC.
1H NMR Los espectros se registraron en un espectrómetro Bruker Avance DRX-500 MHz de transformación de Fourier a temperatura ambiente.
1 H RMN (DMSO
D
6
, 500 MHz) δ: 7,70 (1H, d,
J
= 16,0 Hz), 7,46 (1H, d,
J
= 8,5 Hz), 7,40 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,97 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,87 (1H , d,
J
= 8,5 Hz), 6,38 (1H, d,
J
= 16,0 Hz), 05.11 a 05.05 (1H, m), 4,65 (2H, s), 3,82 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,28 (2H, d,
J
= 7,0 Hz), 1,64 (3H, s), 1,60 (3H, s). Anal. HPLC
t
R = 9,57 min (pureza 99,3%). Analytical pureza HPLC UV se evaluó mediante un sistema JASCO LC-2000plus y el siguiente método. Para el método en 210 nm, un Phenomenex Luna 5 m, 250 mm x 4,60 mm C18 (2) la columna se utilizó con una velocidad de flujo de 1,0 ml /min y una fase móvil de metanol /agua (v /v = 80:20 ) durante 30 min.
declaración ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. Los protocolos que se describen a continuación fueron aprobados por la Universidad de Medicina de Taipei Laboratorio Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Número de Permiso: ALC-100-0097). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
se obtuvieron de cultivos celulares
células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) de la colección del Centro de Investigación y bio-( Hsinchu, Taiwan). Las células se mantuvieron en medio M199 que contiene vascular suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECG) (Millipore), 10% de FBS, 5 U /ml de heparina, HEPES 20 mM, 100 U /ml de penicilina G, y 100 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada 37 ° C incubadora. línea celular de cáncer colorrectal HCT116 se obtuvo de la Colección del Centro de Investigación y bio-(Hsinchu, Taiwán). Las células se mantuvieron en McCoy5A que contiene 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina G y estreptomicina 100 mg /ml en un incubador humidificado con 37 ° C.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se midió por el ensayo colorimétrico de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil (MTT) como se describe anteriormente [30]
lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo de liberación.
pérdida de LDH se midió para cuantificar la citotoxicidad con un kit no radiactivo CytoTox96 ensayo de citotoxicidad (Promega). Los sobrenadantes de cultivo se analizaron en base a las indicaciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas. Tampón de lisis añadido para se utilizó 10 min como un control positivo para la necrosis celular completa. Los datos se calculan entonces como el porcentaje de lisis grupo de tampones tratados.
ensayo de proliferación celular (ensayo de incorporación de BrdU)
HUVECs (2 × 10
4 por pocillo) se sembraron en 96 placas de cultivo de tejido -bien y se incubaron durante 24 h. Las células fueron entonces mueren de inanición en medio M199 que contiene 2% de FBS en ausencia de suplementos de crecimiento de células endoteliales durante otras 16 h. Después de la inanición, las células se trataron previamente durante 30 minutos con diversas concentraciones de BMX, seguido de la estimulación con VEGF (20 ng /ml) durante otras 24 h. a continuación, la proliferación celular se determinó usando un ELISA de proliferación celular, BrdU (colorimétrico) kit (Roche) basado en la detección colorimétrica de la incorporación de BrdU, siguiendo las instrucciones del fabricante.
análisis de citometría de flujo
HUVECs se mantuvieron en ayunas con 2% de FBS M199 en ausencia de suplementos de crecimiento de células endoteliales durante 16 h. Las células fueron incubadas con BMX a las concentraciones indicadas durante 30 min seguido por el tratamiento con VEGF (20 ng /ml) durante otras 24 h. Al final de los experimentos, las células apoptóticas se detectaron mediante yoduro de propidio (PI) y el etiquetado de anexina V-FITC como se describe anteriormente [31]. El doble etiquetado se realizó a 37 ° C mediante el tratamiento de las células con PI (50 mg /ml) y la anexina V-FITC (2 mg /ml) durante 15 min en la oscuridad.
ensayo de migración cero Wound
Después de inanición en medio M199 que contenía FBS al 2% durante 16 h, en monocapa HUVEC fueron heridos al rascarse con las puntas de pipeta y se lavó con PBS. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de BMX en ausencia o presencia de VEGF (20 ng /ml) durante otras 16 h. Las células se fotografiaron usando el microscopio de contraste de fase con la cámara digital de 0 h y 16 h después del tratamiento VEGF. La tasa de migración de células se determinó contando el número de células migradas en un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon, Japón).
Transwell ensayo de invasión
ensayo de migración se llevó a cabo como se describe anteriormente [32 ]. En pocas palabras, la cara inferior del filtro en la placa transwell (Corning, NY, EE.UU.) se recubrió con 0,2% de gelatina. Las cámaras inferiores se rellenaron con medio M199 que contiene 2% de FBS en presencia de VEGF (20 ng /ml) y HUVECs (10
4 células por pocillo) en 200 l de medio M199 (sin factores de crecimiento) se sembraron en la parte superior cámaras. La cámara superior contenía vehículo o varias concentraciones de BMX. Las células se dejaron migrar durante 16 h. Las células no migradas (en el lado superior del filtro) se rasparon con un hisopo de algodón y células migraron fueron fijadas y teñidas con 0,5% de azul de toluidina paraformaldehído al 4%. Las células se fotografiaron y se cuantificaron contando el número de células teñidas con un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon, Japón).
Matrigel la formación de tubos de ensayo
El ensayo de formación de tubo se realizó como se describió previamente [32]. Matrigel, una matriz de membrana basal (Becton Dickinson, Mountain View, CA), se polimeriza a 37 ° C durante 30 minutos. HUVECs en suspensión en medio M199 que contiene 2% de FBS en presencia o ausencia de VEGF (20 ng /ml) fueron sembradas en el Matrigel. Ellos fueron tratados con vehículo o BMX a las concentraciones indicadas. Después de 16 h, las células fueron fotografiados utilizando un microscopio de contraste de fase.
Se realizaron análisis por inmunotransferencia
Los análisis de inmunotransferencia como se describe anteriormente [30]. Brevemente, las células se lisaron en un tampón de extracción que contiene Tris 10 mM (pH 7,0), NaCl 140 mM, PMSF 2 mM, DTT 5 mM, 0,5% NP-40 leupeptina, 0,05 mM pepstatina A, y 0,2 mM. Las muestras de cantidades iguales de proteína se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de NC que después se incubó en un tampón de TBST que contiene leche desnatada al 5%. Las proteínas se visualizaron por incubación con anticuerpos primarios específicos seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. La inmunorreactividad se detectó sobre la base de un aumento de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron datos cuantitativos utilizando un densitómetro de computación con un sistema de imagen científica (Sistema de CA BioSpectrum, UVP).
anillo aórtico ensayo de brotación
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [32]. arco aórtico se disecó 8-10 semanas de edad, las ratas Sprague-Dawley. Después de retirar los tejidos fibro-adiposo circundantes y a fondo de enjuagar con medio de cultivo M199, las aortas se cortaron en segmentos de 1 mm de anillo. Los anillos aórticos se sumergieron en Matrigel en los pocillos de la placa de 48 pocillos. A continuación se añadió VEGF (20 ng /ml) con o sin BMX a los pocillos. Los anillos de aorta se cultivaron en 37 ° C con 5% de CO
2 y el medio de cultivo se cambió cada 3 días. No se observaron brotes de crecimiento de las células endoteliales y se fotografiaron en el día 8. Las imágenes fueron fotografiados bajo el microscopio, y el área del brote se determinó en las imágenes digitalizadas por ordenador con el software Image-Pro Plus (Media Cybernetics). El análisis del área de brotación fue hecho por un observador que desconocía el grupo de tratamiento. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Laboratorio y Uso de la Universidad de Medicina de Taipei.
angiogénesis inducida por tumor de células Matrigel ensayo de tapón
3-5 semanas de edad desnudos
nu /nu ratones eran obtenido a partir de BioLasco (Taipei, Taiwán) y alojados en libres (SPF) habitaciones limpias de patógenos específicos. se recogieron las células HCT116 y se resuspendieron en PBS. Las células (5 × 10
6 células) en un volumen de 150 ml en presencia de heparina (20 U) se mezclaron con Matrigel (150 l) y después se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Después de la implantación, los animales fueron asignados al azar en el grupo control y los grupos de tratamiento, que recibió BMX 20 mg /kg /día. El tratamiento se administró por vía intraperitoneal una vez al día durante 10 días. Al final del tratamiento, los animales se sacrificaron, se retiraron los tapones de Matrigel y los tejidos circundantes recortados. Los niveles de hemoglobina de los tapones de Matrigel se evaluaron con el kit de reactivo de Drabkin (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de hemoglobina se calcula en base a un conjunto de normas de hemoglobina. Además, las secciones embebidas en parafina se tiñeron con un anticuerpo de CD31 específico (Santa Cruz) para detectar la densidad de los vasos en Matrigel enchufe como se describe anteriormente [33]. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Laboratorio y Uso de la Universidad de Medicina de Taipei.
Ratón modelo de xenoinjerto
3-5 semanas de edad desnudos
nu /nu ratones se obtuvieron de BioLasco (Taipei , Taiwán) y alojados en SPF) habitaciones limpias de patógenos específicos (. se recogieron las células HCT116 y se resuspendieron en PBS, y se inyectaron 5 x 10
6 células en un volumen de 0,3 ml por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Una vez que el tumor alcanzó aproximadamente 150 mm
3, los animales fueron distribuidos aleatoriamente en el grupo control y el grupo de tratamiento que recibe BMX 20 mg /kg /día. El tratamiento se administró por vía intraperitoneal una vez al día durante 22 días. Los tumores se midieron todos los días por un calibrador digital. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula
V gratis (mm
3) = [
ab
2] × 0,52, donde
a
es la longitud y
b
es la anchura del tumor [34]. Al final del tratamiento, los animales fueron sacrificados y los tumores se retiraron y se pesaron. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Laboratorio y Uso de la Universidad de Medicina de Taipei.
El análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media ± S. E. de al menos tres experimentos independientes. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) fue seguido por la prueba de Newman-Keuls, cuando sea apropiado, para determinar la significación estadística de la diferencia entre las medias. Un
p
valor de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
BMX inhibe la proliferación celular inducida por VEGF en HUVEC
proliferación celular endotelial es. un paso esencial en el progreso de la angiogénesis. Para evaluar la actividad anti-angiogénica de BMX (Fig. 1), que primero evaluaron sus efectos inhibidores sobre la proliferación celular en HUVECs estimulada por VEGF. Las células se mueren de inanición con 2% de FBS que contenía medio durante 16 h y después se estimularon por VEGF (20 ng /ml) en presencia o ausencia de BMX para otro 24 h. Como se muestra en la Fig. 2A, el tratamiento de las células con BMX dependiente de la concentración disminución de la viabilidad celular en HUVECs estimulada por VEGF como se determina mediante el ensayo de MTT. a continuación, se empleó el análisis de etiquetado BrdU para confirmar si decremento inducida BMX en la viabilidad celular fue atribuible a la inhibición de la proliferación celular. Higo. 2B muestra que el porcentaje de células marcadas con BrdU se incrementó significativamente después de un tratamiento VEGF 24 h en comparación con el grupo tratado con vehículo. BMX inhibió significativamente la proliferación celular inducida por VEGF de una manera dependiente de la concentración. Para determinar si BMX ejerció ningún efecto citotóxico en HUVECs expuestas a VEGF, se empleó un ensayo de LDH. Como se muestra en la Fig. 2C, el tratamiento de células con BMX en 10 M durante 24 h no aumentó significativamente la liberación de LDH. También se utilizó el análisis por citometría de flujo con yoduro de propidio (PI) y el etiquetado V-FITC anexina para detectar la apoptosis en células estimulada por VEGF en presencia de BMX. Como se muestra en la Fig. 2D, BMX no alteró significativamente el porcentaje de la anexina V
+ PI
- células (cuadrante inferior derecho, las células temprana de apoptosis) y la anexina V
+ PI
+ células (cuadrante superior derecho , avanzado células apoptóticas y /o células necróticas). Estos resultados sugieren que BMX puede ejercer la actividad anti-proliferativa sin causar efecto citolítico o apoptótica en HUVECs expuestas a VEGF.
HUVECs (A) se mueren de inanición en 2% FBS que contenía medio sin ECGS, por 16 h. Después de la inanición, las células fueron pretratadas con concentraciones indicadas de BMX, seguido de la estimulación con VEGF (20 ng /ml) durante otras 24 h. La viabilidad celular se determinó entonces por el ensayo de MTT. Cada columna representa la media ± S.E.M. de cinco experimentos independientes realizados por duplicado *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo. (B) HUVECs se trataron como en (A), y se determinó la proliferación celular como se describe en el "
Materiales y Métodos
" sección. Cada columna representa la media ± SEM de cinco experimentos independientes realizados por duplicado. *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo. (C) HUVECs se trataron como en (A), y la citotoxicidad de BMX se determinó por el ensayo de LDH. Las células también se trataron con tampón de lisis celular (lisis total) para servir como control positivo. (D) HUVECs se trataron como en (A), el porcentaje de células apoptóticas fue luego analizada por análisis de citometría de flujo como se describe en el "
Materiales y Métodos
" sección. El cuadrante inferior izquierdo de cada panel (anexina V
-PI
-) muestra las células viables, que excluyen PI y son negativas para la unión de anexina V. El cuadrante inferior derecho (anexina V
+ PI
-) representa las células apoptóticas tempranas, anexina V positivo y negativo PI, lo que demuestra integridad de la membrana citoplasmática. El cuadrante superior derecho (anexina V
+ PI
+) contiene células apoptóticas avanzadas y células necróticas, que son positivos para la unión de anexina V y para la captación de PI. Los resultados mostrados son representativos de cuatro experimentos independientes.
BMX inhibe la migración inducida por VEGF y la formación de la estructura capilar de HUVECs
migración celular endotelial es un paso fundamental para la angiogénesis [35]. El efecto de BMX en HUVEC motilidad se determinó por la migración cero herida y transwell ensayos de invasión. Como se muestra en la Fig. 3A, BMX inhibió significativamente la migración HUVEC inducida por VEGF de una manera dependiente de la concentración. BMX en 5 M también redujo significativamente el número de células migradas a través de la barrera de la membrana Transwell utilizando VEGF como el quimioatrayente (Fig. 3B). La angiogénesis es un proceso complejo y formación tubular de las células endoteliales también es un paso clave en la angiogénesis. Para evaluar el efecto de BMX en la formación tubular de las células endoteliales, HUVECs sembradas en la superficie de Matrigel en presencia de VEGF fueron tratados ya sea con BMX o vehículo como control. Las células en el grupo tratado con vehículo se hicieron alargadas y la estructura de tipo capilar formadas dentro de 16 h. VEGF aumentó significativamente la red de tipo capilar. Sin embargo, el tratamiento de BMX dependiente de la concentración suprime la formación de red capilar similar (Fig. 3C). A continuación exploramos los efectos potenciales de BMX sobre la angiogénesis inducida por VEGF usando un ensayo de la brotación de aorta de rata anillo de microvasos. Como se muestra en la Fig. 3D, VEGF activa significativamente la germinación de los microvasos, lo que lleva a la formación de una red compleja de microvasos alrededor de los anillos de aorta, mientras que el tratamiento con BMX (5 M) antagoniza la germinación. Estos resultados indican que BMX puede exhibir actividad anti-angiogénica a través de la inhibición de la proliferación celular, la migración y la formación de tubos de células endoteliales.
HUVECs (A) se mueren de inanición en 2% FBS que contenía medio sin ECGS, por 16 h. monocapa de células fueron luego se rascó y se trató con vehículo o indicado concentraciones de BMX en presencia de VEGF para otro 16 h. Después se determinó el número de células migradas. Cada columna representa la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo. (B) Después de la inanición como se describe en (A), las células se siembran a continuación en la cámara superior, en ausencia o presencia de BMX (5 mM) utilizando VEGF como quimio-atrayente. Después de 16 h, las células invadieron a través de la membrana recubierta con gelatina se tiñeron y cuantificados. Cada columna representa la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo. (C) Se sembraron HUVEC en Matrigel en presencia de VEGF (20 ng /ml) con o sin BMX a las concentraciones indicadas. Las células fueron fotografiados con un microscopio de contraste de fase después de 16 h. Los gráficos de barras muestran los datos del número promedio de brotes arco compilados (n = 4). *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo. anillos de aorta (D) de la rata se colocaron en Matrigel y se trataron con VEGF (20 ng /ml) en presencia o ausencia de BMX (5 M). El efecto de BMX en la formación de vasos brote de diversas muestras de aorta fue examinado en el día 8. Los gráficos de barras muestran los datos del área de microvasos promedio compilado (n = 4). *
p
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo
BMX inhibe ERK inducida por VEGF y la fosforilación de Akt
VEGF señalización a través de VEGFR2 es la vía más importante en la inducción de proliferación de células endoteliales, la migración y la formación del tubo, que conduce a la angiogénesis [36]. la unión a VEGFR2 VEGF induce la dimerización de VEGFR2 y, posteriormente, la autofosforilación en sus residuos de tirosina. Takahashi et al reveló que los residuos de tirosina 1175 y 1214 son los dos principales sitios de autofosforilación dependiente de VEGF de VEGFR2 [37]. por lo tanto, determinar si afecta BMX VEGFR2 Y1175 e Y 1214 fosforilación en HUVEC estimulada por VEGF. También examinamos el estado de fosforilación de Src, Akt, ERK y FAK, que son las proteínas quinasas esenciales que participan en la señalización de VEGFR2. Como se muestra en la Fig. 4, BMX inhibió VEGFR2 Y1175 y Y1214 fosforilaciones en HUVEC estimulada por VEGF (Fig. 4B). BMX también se demostró para suprimir la fosforilación de Src (Fig. 4C), FAK (Fig. 4D), Akt (Fig. 4E) y ERK (Fig. 4F) en HUVECs estimulada por VEGF. En conjunto, estos resultados muestran que BMX ejerce su actividad de la angiogénesis mediante la inhibición de la activación de VEGFR2 y el bloqueo de las cascadas de señalización de VEGFR2 mediada.
Las células se trataron previamente con concentraciones indicadas de BMX para 30 (20 ng /ml) durante otros 5 (VEGFR2 y Src) o 30 (FAK, Akt y ERK1 /2) min. estado de fosforilación de VEGFR2, Src, FAK, Akt, y ERK1 /2 se determina a continuación por inmunotransferencia. Las cifras mostradas en (A) son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares. Se muestran los resultados compilados de fosforilaciones ERK1 /2 T202 /Y204 (F) VEGFR2 Y1175 y Y1214 (B), Src Y416 (C), FAK Y397 (D), Akt S473 (E), y. Cada columna representa la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. *
p
& lt; 0,05, en comparación con el grupo de control;#
p
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con VEGF solo
BMX aumenta p21
expresión CIP /Waf1, pero disminuye cyclinD1, CDK4 y expresiones survivina
el paso a través del ciclo celular es regulada por complejos de ciclina-CDK, proteínas quinasas heterodiméricas [1] - [3]. Muchos estudios han demostrado que la inducción o la expresión ectópica de p21
cip /Waf1, un regulador negativo de las CDK, inhibe la proliferación celular y provoca la diferenciación en varios tipos de células. p21
cip /Waf1 es, pues, un importante regulador de la proliferación durante el desarrollo, la diferenciación, y la tumorigénesis [38]. Además, survivin, un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia, se encontró que era sobreexpresada en los cánceres humanos y se informó a desempeñar un papel crucial en la regulación de la progresión del ciclo celular, apoptosis, y la tumorigénesis [39] - [42] . Desde BMX suprime la proliferación de HUVEC sin causar apoptosis como se describe anteriormente, se examinó si BMX afecta a los niveles de proteína de p21
cip /Waf1 y survivina en HUVECs. Los niveles de proteínas reguladoras del ciclo celular tales como cyclinD1 y CDK4 también se determinaron en HUVECs estimuladas con BMX. Como se muestra en la Fig. 5, el tratamiento de HUVECs con BMX durante 24 h causó un aumento en el nivel de proteína de p21
cip /Waf1 (Fig. 5B). En contraste, los niveles de proteína de la ciclina D1 (Fig. 5C), CDK4 (Fig. 5D) y survivina (Fig. 5E) se redujeron en HUVECs estimuladas con BMX. Estos resultados sugieren que la proliferación de células BMX inhibida en HUVECs también puede ser mediada a través de alteraciones de los niveles de proteína de p21
cip /Waf1, cyclinD1, CDK4 y survivina.
Las células se trataron con las concentraciones indicadas de BMX durante 24
CIP /Waf1, cyclinD1, CDK4 y survivina a continuación se determinaron por inmunotransferencia. Las cifras mostradas en (A) son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares. Los resultados compilados de p21
CIP /Waf1 (B), cyclinD1 (C), CDK4 (D), y se muestran survivina (E) niveles. Cada columna representa la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con el grupo control
BMX suprime la angiogénesis inducida por tumores en ratones desnudos
A continuación, se utilizó una angiogénesis inducida por tumores modelo para investigar más a fondo si BMX inhibe la angiogénesis inducida por el tumor. células de cáncer colorrectal HCT116 se mezclaron con Matrigel y se inyectan en los costados de ratones. tapones de gel se cosecharon 10 días después de la implantación. Como se muestra en la Fig. 6A, las células HCT116 inducidos profundamente formación de vasos sanguíneos en el tapón (Fig. 6A). Sin embargo, el color pálido de los tapones eliminados de los ratones administrados por vía intraperitoneal con BMX (20 mg /kg /día) indicó que las células HCT116 indujeron menos neovascularización durante el período de 10 días. Se realizó CD31 tinción inmunohistoquímica para detectar la densidad de los microvasos en tapones. Como se muestra en la Fig. 6B, tapones derivadas de ratones tratados con BMX exhibió una disminución en la densidad de microvasos en comparación con los de los ratones de control tratados con vehículo. También cuantificado el nivel de la angiogénesis mediante la determinación del contenido de hemoglobina de los enchufes. Una marcada reducción de la neovascularización se muestra en tapones de ratones tratados con BMX en comparación con los de los ratones de control tratados con vehículo (Fig. 6C). Estos datos indican que la administración sistémica con BMX suprimió significativamente la angiogénesis en este
ensayo in vivo
.
(A) HCT 116 células de cáncer colorrectal se mezclaron con Matrigel y luego se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Después de la implantación, los animales fueron tratados por vía intraperitoneal con vehículo o BMX 20 mg /kg /día durante 10 días. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.