Extracto
La detección de mutantes raros utilizando la secuenciación de próxima generación tiene un potencial considerable para aplicaciones de diagnóstico . La detección de ADN tumoral circulante es la principal aplicación de este enfoque. El principal obstáculo para su uso es la alta tasa de error de lectura de los secuenciadores de última generación. En lugar de aumentar la exactitud de las secuencias finales, que hemos detectado mutaciones raras utilizando un secuenciador de semiconductor y un conjunto de criterios de detección de anomalías en base a un modelo estadístico de la tasa de error de lectura en cada posición de error. Los modelos estadísticos se deduce de los datos de secuencia de muestras normales. Detectamos receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR
) mutaciones en el ADN en plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Una sola pasada secuenciación profunda (& gt; 100.000 lecturas) fue capaz de detectar la activación de un alelo mutante en 10.000 alelos normales. Se confirmó el método que utiliza 22 prospectivo y 155 muestras retrospectivas, en su mayoría consiste en ADN purificado a partir de plasma. Un análisis temporal sugiere posibles aplicaciones para la gestión de la enfermedad y por hacer para seleccionar el factor de crecimiento inhibidores de la tirosina quinasa del receptor epidérmico (EGFR-TKI) la decisión terapéutica.
Visto: Kukita Y, Uchida J, Oba S, K Nishino, Kumagai T, Taniguchi K, et al. (2013) Cuantitativa Identificación de alelos mutantes derivadas de cáncer de pulmón en plasma de ADN libre de células a través de la detección de anomalías Uso de secuenciación profunda de datos. PLoS ONE 8 (11): e81468. doi: 10.1371 /journal.pone.0081468
Editor: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Marzo, 2013; Aceptado: October 13, 2013; Publicado: 21 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kukita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Osaka Centro Médico de cáncer y enfermedades cardiovasculares. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
para algunos medicamentos moleculares dirigidas contra el cáncer, el examen de los cambios genómicos en los genes diana se ha convertido en una rutina de diagnóstico y es indispensable para las decisiones de tratamiento. Por ejemplo, los fuertes efectos de los inhibidores de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa del factor (EGFR-TKI; es decir, gefitinib y erlotinib) en cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) se correlacionan con la activación de mutaciones somáticas en
EGFR
[1,2]. Los pacientes que se administran estos fármacos están seleccionados en base a la presencia de estas mutaciones activantes. La identificación de las mutaciones se basa en muestras de biopsia; el procedimiento es invasivo y, a menudo difícil de realizar. Un procedimiento de diagnóstico no invasivo es deseable.
ADN libre de células en la sangre se compone de ADN derivado de tejidos de cáncer y ha sido estudiado para procedimientos diagnósticos no invasivos [3]. Este ADN, denominado ADN tumoral (ctDNA) circulante, es raro en la sangre, y su detección es un desafío técnico. Una serie de métodos se han examinado, pero la mayoría de ellos tienen limitaciones de sensibilidad y robustez. BEAMing (perlas, emulsión, amplificación y magnetismo) [4] es muy probablemente el método más sensible. En BEAMing, productos de PCR amplificados a partir de una sola molécula se fijan a una única perla magnética usando PCR en emulsión. El sitio de la mutación se marca con una sonda fluorescente o de extensión del cebador, y el alelo mutado se detecta cuantitativamente contando las perlas marcadas con fluorescencia. Radiante cuantificado con éxito
APC
y
KRAS
mutaciones en el ctDNA de los pacientes con cáncer colorrectal [5,6] y
EGFR
mutaciones en el ctDNA de pacientes con cáncer de pulmón [7] . A pesar de su alta sensibilidad y capacidad de cuantificación, radiante no ha ganado en popularidad debido a que es una tecnología laborioso y requiere oligonucleótidos para cada posición de la mutación.
Debido a BEAMing y secuenciadores de última generación, es decir, secuenciadores masivamente paralelas, utilizan la misma o una técnica de preparación de plantilla muy similar, es posible aplicar secuenciadores de última generación para el mismo propósito. Se han realizado varios estudios sobre la secuenciación profunda de ADN libre de células [8,9]. Estos estudios sugirieron la posibilidad de que el enfoque, pero carecían de evaluación crítica de los sistemas de detección. En particular, no abordaron el problema de múltiples pruebas, que es inherente a las aplicaciones de diagnóstico.
En este informe, se estableció un método de detección de
EGFR
mutaciones en ctDNA en la sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón utilizando un solo pase profundo de secuenciación amplificados
EGFR
fragmentos . El reciente desarrollo de un secuenciador de semiconductor (Ion Torrent PGM) [10] ha abordado las deficiencias de otros secuenciadores disponibles en la actualidad (es decir, un largo tiempo de ejecución para un único ensayo y altos costos de operación) y es aplicable para fines de diagnóstico. Aplicamos la detección de anomalías [11,12] y determinamos un conjunto de criterios de detección basado en un modelo estadístico de la tasa de error de lectura en cada posición de error. El método detecta cuantitativamente
EGFR
mutaciones en el ADN libre de células a un nivel comparable al BEAMing, con la promesa de diagnóstico no invasivas que complementan la biopsia.
Resultados
Principio de detección
secuenciación profunda de un fragmento amplificado por PCR que contiene un sitio de mutación puede llevar a cabo para detectar y cuantificar los alelos mutados entre la enorme cantidad de alelos normales derivados de los tejidos del huésped. El principal problema asociado a este enfoque es la frecuencia de los errores introducidos durante la secuenciación y amplificación por PCR. La cuestión clave aquí es el establecimiento y la evaluación precisa de los límites de detección. Cuando la frecuencia de un cambio de base en un locus diana es mayor que una tasa de error de lectura predeterminado (RER), podemos juzgar que el cambio sea debido a la presencia de una secuencia mutante. Es decir, las anomalías que caen significativamente fuera de la distribución RER se consideran como mutaciones. El RER se define como la tasa de error calculado a partir de datos de secuencias finales, incluidos los errores tanto en la secuenciación y etapas de PCR. En la detección de anomalías [11,12], al igual que en la prueba de hipótesis, los falsos positivos se controla en base a un modelo estadístico. En nuestro caso, el modelo estadístico de la RER puede construirse a partir de datos de la secuencia de las regiones diana de un número suficiente de individuos normales que llevan mutaciones.
Si errores de lectura se producen bajo una distribución de probabilidad, el número de lecturas requerida para conseguir un cierto límite de detección puede ser estimado. La figura 1a muestra la relación entre el límite de detección de mutaciones, leer la profundidad, y el RER a un nivel de significación de p = 2x10
-5 para cada individuo sin detección de corrección de la multiplicidad, asumiendo que se producen errores al leer siguiendo una distribución de Poisson. Los datos ilustrados en la Figura 1a se suministran en la Tabla S1. Con una profundidad de lectura aumentar y disminuir el RER, el límite de detección disminuye. En un estudio previo realizado por nuestro grupo [7], el límite de detección de alelos mutantes raros en que mediante la transmisión [4] fue de 1 en 10.000 (0,01%). Debido a que una muestra de ensayo de ADN de plasma contiene aproximadamente 5.000 moléculas, este límite de detección es razonable. Este objetivo se puede lograr con 100.000 lee cuando el TCR está por debajo de 0,01%.
a, Relación entre la tasa de error de lectura, lectura de profundidad, y límite de detección de mutaciones cuando el nivel de significación es p = 2x10
-5. eje horizontal, la profundidad de leer; eje vertical, límite de detección (%). De arriba a abajo, cada línea indica una tasa de error de lectura (RER) de 1%, 0,2%, 0,05%, o 0,01%. b, la representación tridimensional de RER sustitución. el eje x, posiciones de base de los exones 19-21 del EGFR. De izquierda a derecha, las flechas indican las posiciones de T790M, L858R, y L861Q. eje y, 48 muestras de ADN de individuos normales. De adelante hacia atrás, las conversiones a A (verde), C (amarillo), G (magenta), o T (azul) están alineados para cada muestra. eje z, RER (%). c, la representación tridimensional del error de inserción /deleción. el eje x, posiciones de base de los exones 19-21 del EGFR. La barra indica la posición de la deleción del exón 19. eje y, 48 muestras de ADN de individuos normales. , DNA plasma azul; azul claro, el ADN del CMB (gran cantidad); azul oscuro, el ADN del CMB (pequeña cantidad). eje z, RER (%). d, Distribución del TCR. Columna de color blanco, el error de sustitución; columna gris, inserción /deleción de error. eje horizontal, gama de RER (%); eje vertical, la incidencia (%).
Error de lectura de la
EGFR
región objetivo
Para el tratamiento de EGFR-TKI, un activador
EGFR
mutación es indicativa de la eficacia del tratamiento [ ,,,0],1,2]. Los pacientes que se administran estos fármacos están seleccionados en base a la presencia de estas mutaciones activantes. Además de activar
EGFR
mutaciones, un resistente
EGFR
mutación T790M conoce como aparece en aproximadamente la mitad de los pacientes sometidos a tratamiento de EGFR-TKI [13,14]. Por lo tanto, tres mutaciones activadoras, es decir, una deleción en
EGFR
exón 19 y L858R y L861Q en
EGFR
exón 21, así como la mutación T790M resistentes en
EGFR
exón 20 fueron seleccionados como lugares de destino.
determina los RPR en una región 169 de base alrededor de la meta loci que consiste mediante la realización de secuenciación profunda de muestras de ADN de individuos normales. Se utilizó un secuenciador Ion Torrent PGM [10] para este trabajo. secuenciación de una sola pasada se llevó a cabo, y el número de lecturas oscilado entre 44.400 a 373.000, con un promedio de 162.000. Empleamos tres tipos de muestras de ADN: muestras de ADN 19 de plasma con cantidades comparables a las muestras de los pacientes, 16 de leucocitos (células blancas de la sangre, WBC) de muestras de ADN con cantidades que eran 10 o 50 veces el tamaño de la muestra de un paciente, y ADN de WBC 13 muestras con cantidades que eran una décima parte del tamaño de la muestra de un paciente. Dividimos errores de sustitución en cuatro modelos, correspondiente a la conversión a A, C, G o T. Por lo tanto, había 507 posibles tipos de sustituciones (169 posiciones de base x 3 patrones) en la región de destino. A RER sustitución se muestra gráficamente en la Figura 1b, con exclusión de la conversión de G a A en la posición 2361 debido a un SNP frecuente. Los RPR de sustitución no son uniformes ni son independientes unos de otros, y los altos RPR están asociadas con posiciones de base específicas. Además, un patrón de sustitución es dominante en cada posición de base. Un RER inserción /deleción se muestra gráficamente en la Figura 1c. Nosotros no distinguimos entre deleción e inserción errores, como inserciones son a menudo reconocidas como deleciones y viceversa por el software de alineamiento de secuencias. El RER inserción /deleción es generalmente más alto que el RER sustitución. Se observa una tendencia similar a la de sustitución, en que la alta inserción /deleción RPR están asociadas con posiciones de base específicas. Figura 1d presenta la distribución de los RPR. Hubo diferencias sustanciales entre la sustitución y RPR inserción /deleción. En 410 de los posibles 506 tipos de sustitución (81,0%), el TCR fue menor que 0,01%. Por el contrario, fuera de los 169 tipos de inserciones /eliminación, el TCR fue menor que 0,01% en sólo 79 (46,7%). Estos resultados concuerdan con las observaciones ya se ha informado de la plataforma PGM [15]. Los datos ilustrados en las figuras 1b y 1c se suministran en las Tablas S2 y S3, respectivamente.
Debido a la alta inserción /deleción errores de lectura, que emplea un método específico para detectar el exón 19 mutaciones por deleción. Preparamos ocho plantilla exón 19 secuencias con deleciones representativos y se rastrearon las secuencias de deleción, haciendo coincidir con las secuencias de plantilla. Este método era muy eficaz para la detección de los errores de lectura; no hay secuencias con errores de lectura de deleción se encontraron entre las 48 muestras analizadas.
Los modelos estadísticos de las tasas de error de lectura y criterios para la detección de anomalías
Luego examinaron modelos estadísticos de error de lectura. En un modelo de distribución de Poisson, se espera que la media y la varianza del número de incidencias que ser la misma y están determinados por el parámetro de intensidad
lambda
. Aquí, en lugar de utilizar el RER, la incidencia error de lectura se presentó como la incidencia en 100.000 lee, y su promedio y la varianza en cada posición de base se calcularon. Las relaciones entre la media y la varianza se muestran en la Figura 2a y la Figura S1 en S1 de archivos para la sustitución y la inserción /deleción errores de lectura, respectivamente. En ambos casos, la diferencia se hace mayor que la media en una proporción considerable de los casos. En estos casos, la aplicación de la distribución de Poisson conduciría a un mayor número de falsos positivos. Este fenómeno, denominado "sobredispersión", es común en estudios biológicos, y en tales casos, se aplica una distribución binomial negativa [16]. Sobredispersión es debido a las fluctuaciones de la intensidad de parámetros, y es racional suponer que el parámetro de intensidad sigue una distribución gamma. Bajo este escenario, el número de incidencia sigue teóricamente una distribución binomial negativa. En la Figura 2b, el aumento del umbral para la sustitución de una Poisson a una distribución binomial negativo se representa frente a la relación de varianza /media del error de lectura para los tipos de sustitución cuya varianza /relación media varió de 1 a 2. Cuando la relación excede aproximadamente 1,2-1,4, hubo aumentos sustanciales en el umbral. Por lo tanto, hemos construido nuestro modelo estadístico de cada sustitución bajo los siguientes criterios.
a, la relación entre la media y la varianza del error de sustitución presentada como el número por cada 100.000 lee. eje horizontal, la media; eje vertical, la varianza. La línea roja indica el lugar donde la media y la varianza son iguales. b, la diferencia entre los umbrales calculados de acuerdo a una distribución binomial negativa y una distribución de Poisson. El umbral es el número mínimo de cambios de base en 100 000 lee cumplir con el nivel de significación estadística (p-0.01). eje horizontal, varianza relación /media de la sustitución error de lectura; eje vertical, diferencia entre los umbrales. Los tipos de sustituciones cuya varianza /proporción promedio oscilaron desde 1 hasta 2 se representan. c, la exactitud de la cuantificación. Cada punto de datos representa la media de tres ensayos. eje horizontal, fracción de alelos mutantes en productos artificiales; eje vertical, fracción de alelos mutantes estimados a partir de secuenciación profunda. d, la reproducibilidad de la cuantificación. eje horizontal, la tasa de cambio de base en el primer ensayo; eje vertical, la tasa de cambio de base en el segundo ensayo.
1. Cuando el error de lectura media de 100.000 lee era menor que 1, una distribución de Poisson con λ puesto a 1 se aplicó (169 tipos de sustituciones).
2. Cuando el promedio fue mayor que 1 y la relación de varianza /media del error de lectura fue menor de 1,2, se aplicó una distribución de Poisson (15 tipos de sustituciones).
3. Cuando el promedio fue mayor que 1 y la relación de varianza /media del error de lectura era mayor que 1,2, se aplicó una distribución binomial negativa (323 tipos de sustituciones).
La deleción del exón 19 y L858R pertenecía a la primera categoría, mientras que los sitios de mutación T790M L861Q y pertenecían a la segunda y tercera categorías, respectivamente. Los límites de detección para la deleción del exón 19 y el L858R, L861Q, y mutaciones por sustitución T790M a un nivel de significación de p = 2x10
-5 fueron menos de 0,01% y menos del 0,01%, 0,01% y 0,05%, respectivamente . En el siguiente análisis, se utilizó p = 2x10
-5 como el umbral de significación para cada sola detección, sin tener en cuenta una corrección multiplicidad, esperando un falso positivo en 50.000 muestras.
El esbozo del método es 1) amplificación de
EGFR
fragmentos con cebadores específicos de exón de ADN en plasma; 2) secuenciación profunda de
EGFR
fragmentos con PGM (& gt; 100.000 lecturas /fragmento), la combinación de los productos de PCR; 3) acorde con las secuencias de salida con
EGFR
secuencias de molde; 4) la detección de deleciones y sustituciones, y la conversión de número de eventos en que en 100.000 lee; y 5) la evaluación de los cambios de base con los criterios de detección de anomalías. En la detección de anomalías, los cambios de bases son juzgados como mutaciones, cuando el número de eventos en los 100.000 lee es igual o supera el valor umbral (exón 19 supresión, 7; L858R, 7; L861Q, 12; T790M, 60). Una representación esquemática se muestra en la Figura S1 S2 en Archivo.
Quantitativity y reproducibilidad
En primer lugar, hemos examinado la capacidad de cuantificación del método. Preparamos muestras de prueba que incluyen diversas fracciones de los productos de PCR de mutados
EGFR
fragmentos. Hubo una muy buena linealidad (
r = 0,998
) entre las cantidades inoculadas de los productos de PCR y las proporciones observadas-mutante-a la normalidad de los alelos deducidas de secuenciación profunda (Figura 2c). A continuación, examinó la reproducibilidad del método usando muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón primario cuyas lesiones fueron confirmados para llevar a la activación de mutaciones. Las fracciones de los alelos mutantes medidos en dos ensayos se representan gráficamente en la Figura 2d. A alta concordancia (
r
= 0,989) se observó, excepto en las muestras que contenían pequeñas cantidades de los alelos mutantes, correspondientes a una fracción de aproximadamente 0,3% de los alelos presentes o menos. En estos casos, la fase inicial de la amplificación por PCR era probable que sea correcto debido a los bajos números de las plantillas de mutantes, que se estima en 15 copias o menos. Por lo tanto, el límite de cuantificación fue de aproximadamente 0,3%.
Validación con muestras de pacientes con cáncer de pulmón
Además, evaluó usando nuestro método de muestras de biopsia de cáncer de pulmón, el muestreo de ADN en plasma y la lesión primaria al mismo tiempo como parte de un estudio prospectivo. Los resultados de las muestras procedentes de 22 pacientes mostraron 86% de concordancia (intervalo de confianza del 95%, el 66 - 95), 78% (44 - 93) la sensibilidad, y el 92% (66 - 98) especificidad, el establecimiento de la biopsia de tejido como el estándar. Estos resultados son prometedores con respecto al desarrollo de una herramienta de diagnóstico para complementar la biopsia del cáncer de pulmón.
A continuación, se analizó un total de 155 muestras: 144 muestras de plasma, ocho de líquido cefalorraquídeo, y uno de orina, derrame pleural y lavado alveolar bronquial. En cuanto a las muestras de plasma, dos o más muestras se obtuvieron de 32 pacientes en diferentes puntos de tiempo de los cursos de la enfermedad. Todos los datos obtenidos se muestran en la Tabla S4. Los datos clínicos de los pacientes incluidos etapa, la histología, el tratamiento y el estado de resistencia a EGFR-TKI también se enumeran en esta tabla. Entre los 33 pacientes asociados con una lesión primaria que contiene la deleción del exón 19, esta mutación se encontró en por lo menos una de las muestras de plasma de 24 pacientes (72,7%). De los 23 pacientes para los que las lesiones primarias exhiben los L858R o L861Q sustituciones, estas mutaciones se encontraron en por lo menos una de las muestras de plasma de 18 pacientes (78,2%). Se observó una mutación doble (detección simultánea de la deleción del exón 19 y L858R) en 12 muestras de plasma, aunque las mutaciones dobles no son frecuentes en las muestras de biopsia. No se observaron discrepancias entre los tipos de mutación de activación identificados en muestras de biopsia y de ADN de plasma en cinco muestras de plasma. T790M se encontró en 13 de 57 muestras de plasma (22,8%) de los pacientes con resistencia a EGFR-TKI, y en 7 de cada 87 muestras de plasma (8,0%) sin resistencia EGFR-TKI.
Los cambios temporales de
EGFR
niveles de mutación durante el curso de la enfermedad
Un número considerable de muestras se obtuvieron de un mismo paciente en diferentes momentos en el curso de la enfermedad. Los cambios temporales de
EGFR
niveles de mutación en el ADN en plasma de pacientes con tres o más muestras se muestran esquemáticamente en la Figura 3. Debido al periodo de muestreo relativamente corto, las muestras se obtuvieron a partir de sólo una parte del curso de la enfermedad en la mayoría de los casos . Nos hemos centrado en dos transiciones: transición debido al inicio del tratamiento EGFR-TKI y que después de la adquisición de resistencia a EGFR-TKI. Los datos anteriores a la iniciación del tratamiento se obtuvo en seis casos. Una disminución significativa en la activación de los niveles de mutación con el tratamiento se observó en todos los casos (p = 1.7x10
-4). Liquidación de ctDNA por el inicio del tratamiento es un fenómeno general.
Cada punto representa un punto de muestreo de tiempo. El diagrama no es una representación exacta de la escala de tiempo, y sólo el orden de los puntos es información válida. Las cifras representan
EGFR
10.000 mutaciones en la secuencia lee: negro, el exón 19 de su eliminación; azul, L858R; rojo, T790M. Sólo se muestran cifras superiores a los umbrales. "La mutación de tipo" indica que en las muestras de biopsia.
Los datos se obtuvieron antes y después de la adquisición de resistencia a EGFR-TKI en siete casos. Después de adquirir la resistencia, la activación de nivel de mutación se aumentó en cinco pacientes (218, 226, 259, 61, 66), disminución en un paciente (44), y se incrementó con retraso en el otro paciente (178). Aumento de la activación de mutaciones se puede correlacionar con la progresión de la enfermedad. A pesar de la clara correlación entre T790M y el estado de EGFR-TKI-resistencia en el estudio de validación anteriormente, dinámica de T790M durante el curso de la enfermedad no fue tan claro como el de la activación de las mutaciones; T790M apareció a menudo antes de adquirir resistencia.
Tres pacientes se describen con más detalle. El paciente fue tratado con 226 gefitinib como quimioterapia de primera línea. El tratamiento con gefitinib fue detenido varias veces debido a los efectos adversos. Se observó una respuesta radiológica (respuesta parcial, PR) del mes 1 al mes 9, y se observó progresión de la enfermedad en mes 10. Antes del tratamiento gefitinib, la fracción del alelo mutante fue muy alta (& gt; 50%), pero después de sólo una semana de este tratamiento, la fracción del alelo mutante se redujo a 0,3%, antes de cualquier cambio radiológicos (Figura S3a en File S1). T790M apareció a los 10 meses, cuando comenzó la progresión de la enfermedad. Paciente 243 también mostraron una disminución en la fracción sesgada alelo mutante en el inicio del tratamiento con gefitinib (Figura S3b en File S1). Este paciente fue tratado con cirugía y quimioterapia adyuvante (CDDP más VNR) anteriormente, y después se sometió a gefitinib. El paciente 41 presentó con la progresión de la meningitis neoplásica, y se sometió a tratamiento con erlotinib-pemetrexed en combinación. Los tratamientos previos fueron CDDP más gemicitabine, gefitinib, erlotinib y. Se observó una respuesta radiológica menor de meses uno a cuatro, y la progresión de la enfermedad se produjo posteriormente. Hubo una disminución sesgada en la fracción de alelo mutante en el comienzo de la terapia, y el aumento en la progresión de la enfermedad fue de sólo una ligera (Figura S3c en File S1). Cabe señalar que el respose de ctDNA del inicio del tratamiento EGFR-TKI fue rápida en los tres casos (paciente 229, una semana; 243, dos semanas; 41, un mes).
Detección de mutaciones en toda la región de destino
Hemos explorado la posibilidad de identificar mutaciones de sustitución en todo el destino
EGFR
región que corresponde a 503 tipos de sustituciones, con exclusión de L858R, L861Q y T790M. Debido a que el nivel de significación se fijó en p = 2x10
-5 para cada detección, se esperaba que los falsos positivos a aparecer una vez en 100 muestras. En realidad, una mediana de tres sustituciones se encontraron por muestra. La distribución del número de sustituciones por muestra se muestra en la Figura 4a. Sobre la base de la experiencia adquirida en las muestras de biopsia, la mayoría de estas sustituciones eran propensos a ser falsos positivos. Una fracción considerable de los diferentes tipos de sustituciones no presentó falsos positivos (56,2%, la Figura 4B), y los modelos estadísticos eran de uso práctico con estos tipos de sustituciones. Para otros, la estimación de parámetros a partir de los datos de 48 individuos normales no era suficientemente conservador para la exclusión de los falsos positivos.
a, Distribución del número de diferentes tipos de sustituciones juzgadas como mutaciones por muestra. El eje horizontal, el número de los tipos de sustituciones; eje vertical, número de muestras. b, Distribución del número de muestras con un tipo de sustitución juzgado como una mutación. eje horizontal, el número de muestras con un tipo de sustitución juzgado como una mutación; eje vertical, número de los tipos de sustituciones.
Discusión
detección de mutaciones raras de loci objetivo a través de la secuenciación profunda de ADN libre de células de plasma tiene una sensibilidad comparable a BEAMing. La especificidad también es aceptable porque el
EGFR
tipos de mutación en muestras de biopsia y de plasma mostraron una alta concordancia. Por lo tanto, la detección de mutaciones raras con profunda secuenciación ahora ha alcanzado un nivel suficiente para proceder a la confirmación a través de un estudio prospectivo. El método se puede aplicar a un número limitado de loci diana en cualquier posición de la base; utilizando el método de par de extremo o la secuenciación de la dirección opuesta sería aumentar la precisión de las posiciones de tasa de error alta, el aumento de sensibilidad y especificidad a niveles aceptables.
Sin embargo, es difícil extender la detección de mutaciones de una región más grande. La incidencia de falsos positivos no es aceptable para aplicaciones de diagnóstico. Estimación de parámetros con un mayor número de muestras normales y /o métodos de estimación más conservadores, como la inferencia bayesiana, podría disminuir los falsos positivos. Se utilizó ADN libre de la mutación de individuos normales para la encuesta de error de lectura, pero la detección de mutaciones se realizó con muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Una posible causa de la insuficiencia de los umbrales puede ser la diferencia en la calidad del ADN. El reciente descubrimiento de mutaciones de artefactos introducidos durante los procesos experimentales [17] sugiere la posibilidad de causas aún no descubiertas de artefactos utilizando muestras de plasma.
Nuestro procedimiento se optimiza para nuestros objetivos y entorno social, pero no hay espacio para la mejora técnica. Además del método de extremo emparejado [9], métodos para producir secuencias libres de errores a través de la secuenciación repetida de plantillas a partir de una sola molécula de [18,19] podría ser aplicable para mejorar la precisión. Empleamos pequeñas cantidades de ADN en plasma para la amplificación por PCR, debido a las normas éticas de nuestro hospital y los hospitales regionales pertinentes. Sin embargo, en un entorno social diferente, usando una cantidad de aumento de la DNA plasma puede mejorar la reproducibilidad de la detección de mutaciones de bajo nivel.
Además de ser aplicado para el diagnóstico no invasivo de
EGFR
mutaciones, como se muestra en los análisis temporales anteriores, este método también es informativo para elucidar la dinámica de alelos mutantes en el curso de la enfermedad. En particular, hay que señalar que una disminución en la fracción sesgada alelo mutante precedida cambios radiológicos, lo que probablemente serán útiles para la predicción de la eficacia del fármaco.
Las biopsias de los casos avanzados y biopsias repetidas son técnicamente exigentes, y la sustitución con un método no invasivo sería beneficioso. En este contexto, el seguimiento T790M con nuestro método tendría beneficios sustanciales para el manejo del paciente. Por ejemplo, la detección de la mutación T790M en muestras de sangre sería útil para la selección de pacientes para el tratamiento con EGFR-TKI nueva para los cánceres de pulmón que son resistentes a gefitinib y erlotinib [20]
.
Recientes estudios sugieren dos otras posibilidades de El análisis ctDNA. Dawson et al. seguido la dinámica de ctDNA en pacientes con cáncer de mama metastásico mediante mutaciones en
TP53
y /o
PIK3CA
, y encontró su mérito para el seguimiento de progresión de la enfermedad [21]. El uso de mutaciones comunes puede permitir su aplicación a una amplia variedad de tumores. Por el contrario, nuestro enfoque de la investigación es más específico, es decir, la detección de mutaciones para la toma de decisión terapéutica, aunque nuestro método también se puede aplicar para su propósito. Murtaza et al. realizado la secuenciación del exoma usando ADN de plasma de pacientes con cáncer [22], el análisis de los genomas del cáncer en cualquier etapa de la evolución de la enfermedad podría descubrir cambios genéticos que conducen a la progresión de la enfermedad o la resistencia a los medicamentos. Análisis de ctDNA tendrá un valor profundo en los aspectos científicos y de diagnóstico de la investigación del cáncer.
Materiales y Métodos
Características de los pacientes
Los pacientes con mutaciones activadoras de EGFR en los tejidos tumorales fueron reclutados en el Centro Médico de Osaka para el cáncer y enfermedades cardiovasculares. líquido pleural, líquido cefalorraquídeo y /o de orina se recogieron muestras de algunos pacientes. En todos los pacientes, la activación de
EGFR
se encontraron mutaciones en las muestras de biopsia usando el método de abrazadera PNA-LNA PCR [23]. La respuesta a la terapia y progresión de la enfermedad se evaluó principalmente de datos radiológicos basados en los criterios RECIST [24].
extracción de ADN de muestras de líquido
Se preparó el plasma por centrifugación de 4 a 5 ml de sangre tratada con EDTA en 800
g
durante 10 min a temperatura ambiente. El plasma se transfirió a un tubo nuevo y se volvió a centrifugar a 15.100
g
durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, el plasma superior se transfirió a un tubo nuevo. muestras de fluidos pleurales y orina se centrifugaron a 800
g
durante 10 min a temperatura ambiente, y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. muestras de líquido centrifugado se congelaron a -80 ° C hasta la extracción de ADN. El líquido cefalorraquídeo se congeló sin centrifugación. Se extrajo el ADN 1,5 a 2,0 ml de una muestra líquida (o 5 ml de orina) usando el QIAamp circulante kit de ácido nucleico (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se determinó midiendo el número de copias de LINE-1 [25] o utilizando el qubit ssDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.).
amplicón construcción de la biblioteca y la secuenciación profunda
construcción de bibliotecas de secuenciación.
Para amplificar las regiones diana de la
EGFR
gen, pares de cebadores de PCR fueron diseñados con Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/). Los pares de cebadores tienen índices 5-nt (para discriminar los individuos) y secuencias adaptadoras para semiconductor de secuenciación. Las posiciones de las regiones PCR diana y secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S5. La amplificación por PCR se realizó en un ADN que contiene plasma 50 l mezcla de reacción obtenida a partir de 300 l de plasma (10 ng o más), 20 pmol de cada uno de cebadores y 1 unidad de ADN polimerasa KOD profesor, más (Toyobo, Osaka, Japón). Para analizar el error de lectura, se utilizó ADN genómico a partir de plasma o leucocitos de individuos sanos como una plantilla de PCR. El perfil de ciclos fue el siguiente: 2 min a 94 ° C para la desnaturalización inicial, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 94 ° C para la desnaturalización, 30 segundos a 55 ° C para el recocido, y 50 seg a 68 ° C para la extensión.
Información de Apoyo
archivo S1. Figura S2. Figura S3.