Extracto
El Suprimido en cáncer de hígado uno (DLC1) gen supresor de tumores codifica una proteína activadora de RhoGTPase (RhoGAP). El gen DLC1 tiene múltiples isoformas de la transcripción y hemos establecido previamente una cepa de ratón que contiene una inserción de trampa de genes (gt), lo que reduce específicamente la expresión de la isoforma de 6,1 kb (isoforma 2). Este gen alelo atrapado cuando los resultados de homocigotos en letalidad embrionaria y los ratones heterocigotos gen atrapados no muestran un aumento de la incidencia de los cánceres, lo que sugiere que los cambios oncogénicos cooperar puede ser necesaria para la transformación. En el presente trabajo, hemos estudiado el
in vivo
cooperación entre los genes oncogénicos K-ras2 y DLC1 en la génesis tumoral. Hemos observado un aumento en los cánceres invasivos del timo, incluyendo tanto los timomas y linfomas, lo que resulta en la vida acortado significativamente abarca en ratones heterocigotos para el alelo gt DLC1 y una inducible LSL-K-Ras2
alelo G12D en comparación con el LSL-K- ras2
G12D sólo los ratones. Los ratones heterocigotos mostraron un alto grado de metástasis en el pulmón. Hemos encontrado hipermetilación selectiva específica de tumor de la isoforma 2 promotor DLC1 y la reducción de la expresión de la proteína correspondiente en el linfoma tímico (TL) y carcinoma epitelial tímico (TCE) derivado de los tumores del timo. Las líneas celulares de linfoma de timo deficientes DLC1 exhiben una mayor migración de las células trans-endotelial. líneas celulares TEC también mostraron la formación de fibras de estrés aumentado y la actividad de Rho. Introducción de las tres isoformas DLC1 etiquetados con GFP en estas células dio lugar a diferentes cambios morfológicos. Estos resultados sugieren que la pérdida de expresión de la única isoforma 2 puede ser suficiente para el desarrollo de tumores del timo y la metástasis
Visto:. Sabbir MG, Prieditis H, Ravinsky E, Mowat MRA (2012) El papel de la isoforma DLC1 2 en K-Ras2
G12D inducida por el cáncer del timo. PLoS ONE 7 (7): e40302. doi: 10.1371 /journal.pone.0040302
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 8 de Diciembre, 2011; Aceptado: 7 Junio 2012; Publicado: 5 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Sabbir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado con subvenciones de la Sociedad de Investigación del cáncer Inc. (http://www.src-crs.ca/en-CA) y CancerCare Manitoba Foundation Inc. (http://www.cancercarefdn.mb.ca). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) gen supresor de tumores codifica una proteína activadora de GTPasa Rho (RhoGAP) que aumenta la hidrólisis intrínseca del GTP unido a la Rho PIB forma inactiva unida de Rho. El gen DLC1 se ha encontrado con frecuencia eliminado o, abajo regulada por el promotor de hipermetilación en mama, pulmón, hígado, colon y tumores de próstata [1] - [6]. Un estudio reciente utilizando el análisis de microarrays de oligonucleótidos de representación ha mostrado deleción heterocigota de DLC1 locus en ~ 50% de hígado, tumores de mama y de pulmón y 70% de los cánceres de colon [7].
In vitro
estudios han demostrado que la transfección del gen DLC1 puede inhibir el crecimiento celular [5], [7], abolir
in vivo
la formación de tumores [2] e inducir la apoptosis. Recientemente, los experimentos utilizando
ex vivo
desmontables de DLC1 en nula p53 y las células progenitoras hepáticas inducidas por Myc han demostrado reducción de la supervivencia después de la inyección en ratones [7].
El gen DLC1 tiene al menos tres grandes isoformas de transcripción expresados bajo la influencia de tres promotores alternativos en el ratón [8]. Hemos establecido previamente una cepa de ratón que contiene una inserción de trampa de genes, lo que reduce específicamente la expresión de la isoforma de 6,1 kb de la transcripción (isoforma 2) de DLC1, creando así un hypomorph [8]. los ratones homocigotos atrapados DLC-1 de genes muestran un fenotipo letal embrionaria [8], que phenocopies el exón 5 DLC1 ratón knockout de Durkin et al. [6]. Los ratones heterocigotos knockout de genes y atrapados son viables y no muestran ningún aumento de los tumores espontáneos [6], [8]. Esto indica que se requieren eventos oncogénicos adicionales además DLC1 eliminación para la transformación
Se ha demostrado que en ciertas situaciones la activación de las Ras señalización detenciones de la vía del ciclo celular que induce la senectud en lugar de causar la proliferación celular [9] -. [12 ] a través de la inducción de p21
WAF1 [13], [14]. También se ha demostrado que en células activadas Ras, un requisito para la señalización de Rho es para la supresión de p21
waf1 [15]. Una vez más, en los fibroblastos Ras transformadas, la señalización de ERK-MAP quinasa sostenida favorece la selección de altos niveles de activo Rho-GTP para permitir regular por disminución los altos niveles de p21
waf1 [16]. Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la activación de la vía Rho través de la pérdida de la expresión DLC1 RhoGAP complementará las Ras oncogén en la transformación celular
in vivo
. Asimismo, no se conoce, que DLC1 isoforma es crítica para la supresión de tumores. En este estudio, se presenta alta incidencia de cáncer metastásico del timo en DLC1 isoforma 2 gen ratones heterocigotos atrapado con un oncogén K-Ras2
alelo G12D. También encontramos la hipermetilación del promotor selectivo DLC1 isoforma 2 en estos tumores.
Resultados
alta incidencia de cáncer del timo en el DLC1
p /gtLSL-K-Ras2
en peso /Ratones G12D infectadas con AdCMV-cre
Para probar si la pérdida DLC1 cooperaría con el gen K-Ras2 en la transformación, hicimos uso de la LSL-K-Ras2
G12D ratón transgénico [17]. Para activar el oncogén K-Ras2
alelo G12D, DLC1
p /gt; K-Ras2
p /G12D (KD) y DLC1
p /p; K-Ras2
p /ratones G12D (K
+) fueron inyectados con adenovirus Cre-expresando AdCMV-Cre a través de la vena de la cola. La mayoría de los ratones desarrollaron tumores tímicos primarias dentro de 6 a 9 meses con 52,6% (10/19) de la K ratones
+ frente a 69,5% (16/23) de los ratones KD que tienen tumores (Figura 1a & amp; B , Tabla 1). Los ratones fueron sacrificados por lo general de seria dificultad para respirar debido a la compresión de la cavidad torácica por los tumores de crecimiento del timo (Figura 1C). Al necroscopy, algunos de estos ratones también mostraron lesiones neoplásicas en otros órganos como el riñón, hígado, pulmón, testículo y ovario pero, la mayoría de los ratones mostraron tumores del timo (Figura 1A, Tabla 1). La mayoría de los tumores de pulmón eran células de linfoma de timo metastásicos en origen (Figura 2E, Tabla 2). Para determinar la supervivencia global, el análisis de Kaplan-Meier de los ratones inyectados Cre-AdCMV se llevó a cabo. Esto reveló una supervivencia significativamente menor en los ratones de genes atrapado KD heterocigotos en comparación con K
+ ratones (valor de p = 0,0077, Figura 3A).
(A) Frecuencia de los diferentes tipos de tumores primarios. (B) Frecuencia relativa de los diferentes tipos de cánceres del timo (C) Imagen principal del timo ampliada (flecha) en el ratón y un timo diseccionado con linfoma.
Para entender la la naturaleza de los cánceres del timo, se realizó inmunohistoquímica utilizando una célula T marcador específico CD3 y marcadores específicos de células epiteliales tímicas, citoqueratina 5 (CK5) y citoqueratina 8 (CK8 /Troma) [18]. En los ratones joven normal (6 semanas de edad) los linfocitos T se encuentra distribuida de manera uniforme en las regiones tanto corteza y la médula del timo, mientras que las células epiteliales medulares eran fuertemente CK5 y células epiteliales corticales fueron fuertemente CK8 positiva (Figura 2A). Sin embargo, en los ratones adultos los linfocitos T fueron predominantemente desplazado hacia la región central médula y las células epiteliales corticales fueron fuertemente CK8 positiva con parches aislados de células positivas CK5 (Figura 2B). El uso de estos marcadores se han encontrado un número significativamente mayor de los linfomas tímicos 80% (8/10) en el K ratones
+ frente a 68,7% (11/16) en los ratones KD (Figura 1B & amp; 2D, Tabla 3) . Una fracción menor (20% (2/10)) fueron predominantemente carcinomas epiteliales del timo (timomas) en el K ratones
+ en comparación con el 31,2% (5/16) en los ratones heterocigotos KD (Figura 1 B & amp; 2C), como por la clasificación histológica de Bernatz et al. [19]. La frecuencia de los timomas entre el K + y ratones KD no fue estadísticamente significativa. Hemos encontrado sólo un tumor en un ratón KD, que mostró un tipo de timoma mixto, que puede tener tanto linfoma de células T y timoma.
Normal timo de ratón a las 6 semanas (A) y 18 semanas (B) que muestra la expresión de marcadores de células T (CD3) y diferentes marcadores de citoqueratina específicas a las células tímicas medulares epiteliales (CK5) y células epiteliales corticales (CK8). La inmunohistoquímica que muestra el carcinoma epitelial tímico (C), linfoma de células T (D) y la metástasis de pulmón de linfoma de células T (F).
Primaria tímico Tumores metástasis frecuentemente a los pulmones
la inmunohistoquímica también reveló que la mayoría de los tumores de linfoma tímico había hecho metástasis en múltiples focos en el pulmón. La mayoría de las metástasis de pulmón eran de linfoma de células T de origen (Figura 2E, Tabla 2). La cuantificación de las lesiones metastásicas de pulmón de cada cohorte muestra significativamente mayor frecuencia de metástasis en ratones KD en comparación con la K
+ ratones (Figura 3B).
(A) la supervivencia acumulativa de heterocigotos LSL-K-Ras2
G12D; DLC1
p /GT y LSL-K-Ras2
G12D; DLC1
en peso /peso de los ratones tras la inyección de adenovirus Cre expresar a través de la vena de la cola. El tiempo de supervivencia se define como el tiempo después de la inyección a la muerte o sacrificio, debido a llegar a puntos finales humanas. Un total de 15 LSL-K-Ras2
G12D; DLC1
peso /peso y 18 LSL-K-Ras2
G12D; DLC1
peso /gt ratones fueron utilizados para el estudio de supervivencia. Los datos censurados fueron ratones que murieron de causas desconocidas que no tuvieron tumor detectable o leucemia. (B) La frecuencia de los tumores de pulmón metastásico. Los cuadrados en forma de puntos grises indican las lesiones metastásicas derivados de los ratones que fueron la fuente de las líneas celulares de linfoma T 1 y 2. valor de p = 0,0257 (mediante la prueba de Mann-Whitney).
Primaria de células T y linfoma Timoma líneas celulares son deficientes en proteína isoforma 2 DLC1 y mostraron una mayor actividad de RhoA
4 estableció linfoma de timo (TL) y 3 líneas celulares de carcinoma tímico epitelial (TEC) (Figura 4A) de la tumores primarios para el estudio de la expresión de la proteína DLC1. Estos tumores eran o CD3 + células T o CK o CK 5 8 células epiteliales positivas (Figura 2C & amp; D). Las líneas celulares TEC TL y espontáneamente inmortalizados y se cultivaron hasta 20 pasajes sin ninguna disminución en el potencial de crecimiento. las tasas de proliferación celular, por un método de recuento de células, mostraron que las líneas de células TEC 1-2 (KD) tuvieron una mayor tasa de crecimiento en comparación con la línea celular TEC 3 (K +) (Figura 4A /ii). Las líneas celulares TL no mostraron diferencias significativas en la tasa de proliferación de las células en cultivo.
A (i) micrografía de campo claro de la TEC y las células TL en la cultura. (Ii) tasa de proliferación de las líneas celulares TEC. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y luego el crecimiento de las células se analizó contando el número de células en consecuencia, durante 7 días. B (i) de inmunofluorescencia que muestra células epiteliales tímicas que expresan de CK8 y CK5 y (ii) el linfoma de células T que muestra la expresión de CD3. (C) la expresión de mRNA en DLC1 TEC y líneas celulares TL. (I) Representación esquemática del locus y empalme patrón DLC1 de las tres isoformas principales. La estrategia y los cebadores utilizados en la cuantificación relativa de la DLC1 isoformas 2 y 3 mediante RT-PCR multiplex. (Ii) Multiplex RT-PCR que muestra la intensidad relativa de la isoforma 2 y 3 la expresión de ARNm en las líneas celulares de linfoma de células T y de timoma. (Iii) Multiplex PCR que muestra la intensidad relativa de la isoforma 2 y 3 la expresión de mRNA en 5-AzaC tratada TL y TEC líneas de células (D) expresión de la proteína DLC1: (i) la proteína DLC1 de linfoma de células T y líneas celulares de carcinoma epiteliales del timo, así como timo adulto normal y el tejido hepático de los ratones C57BL 6J /y las células T de linfocitos de sangre periférica (PBL). (Ii) gráfico que muestra la intensidad relativa de DLC1 123 KDa (isoforma 2) y 127 KDa proteínas anónimas en líneas de linfoma de células T y de células de carcinoma así como timo adulto y el tejido hepático de los ratones C57BL 6J /(* p & lt; 0,05, * * P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, **** P & lt; 0,0001). E. DLC1 expresión de la proteína a partir del 5 AzaC tratado TL y líneas celulares TEC.
En nuestro estudio anterior, hemos reportado la existencia de dos isoformas de peso molecular diferentes de proteínas DLC1 en diferentes tejidos de ratón y en el ratón fibroblastos de embriones (MEF), que presumiblemente se origina a partir de las isoformas 2 y 3 mRNAs o por modificaciones posteriores a la traducción [8]. La proteína de 123 kDa regulares DLC1 (isoforma 2) se expresa en un nivel bajo en el timo adulto. Considerando que, la proteína de reacción cruzada 127 KDa se expresa a un nivel más alto en el timo, en comparación con el hígado en transferencias Western (Figura 4D /i). Curiosamente, las líneas de células de timoma y linfoma mostraron menor expresión de la banda de proteína 123 KDa y el mRNA isoforma 2 correspondiente cuando se compara con el timo normal (Figura 4C & amp; D /i-ii). Las líneas celulares y TL4 TEC3 de K + ratones mostraron niveles de expresión comparables con DLC1 timo de tipo salvaje. (Fig. 4C /i-ii). El TL1, 2 & amp; 3 y TEC 1 & amp; 2 líneas mostraron niveles más bajos en comparación con las líneas de los ratones K + (Figura 4D). También, había un aumento significativo de la banda de proteína 127 kDa en los tumores en comparación con el timo (Figura 4D). En nuestro estudio anterior, así como en el presente estudio, se han dado cuenta de que el nivel de expresión de la proteína de 127 kDa proteína aumenta en presencia de niveles reducidos de la proteína de 123 kDa, que es particularmente evidente en el gen homocigoto células de fibroblastos de embriones de ratón atrapado ( Figura 4D). La mayor parte de las células del linfoma y TEC también mostraron una mayor expresión de la proteína KDa 127 (Figura 4D).
Para determinar si las bandas de alto peso molecular adicionales son formas fosforiladas de la proteína DLC1, los lisados celulares fueron tratados con alcalina fosfatasa. La presencia continua de la banda de 127 kDa después del tratamiento con fosfatasa indica que no es una forma fosforilada de la proteína 123 kDa DLC1 regular (Figura 4C /i & amp; E).
Para identificar el 127 kDa proteína de reacción cruzada, inmunoprecipitados usando los anticuerpos DLC1 se sometieron a espectrometría de masas. Hemos sido capaces de identificar los péptidos 7 corresponden a la región de consenso de DLC1 común a todas las isoformas y por lo tanto, la espectrometría de masas fue concluyente de la existencia de las otras isoformas DLC1 (Figura S1).
La mayoría de las las líneas de células de linfoma y TEC también mostraron alta expresión de la p21
waf1 proteína en contraste con las células de fibroblastos de embrión de ratón de genes homocigotos atrapado donde p21 se redujo
WAF1 expresión (Figura 5A /i-ii). El nivel de expresión de la proteína p21 fue comparable en MEF
+ /+ y las líneas celulares y TL4 TEC3, que tienen alelos de tipo salvaje DLC1 Sin embargo, los heterocigotos genetrap DLC1 alelo que contienen TL 2/3 líneas celulares y la célula TEC1 /2 líneas mostraron niveles significativamente más altos de expresión de la proteína p21 en comparación con el tipo silvestre correspondiente, TL4 y TEC-3 líneas celulares, respectivamente. Por el contrario, la línea TL1 heterocigotos, con la expresión DLC1 más bajo, mostró que la expresión de p21 comparable al MEF tipo salvaje
+ /+ y TEC 4 células. Por lo tanto, la expresión de p21 no se correlaciona con la expresión DLC1 en líneas de células del timo, al contrario que en los fibroblastos.
A (i) p21
WAF1 proteína en líneas de linfoma de células T y de células de carcinoma, (ii) gráfico que muestra el intensidad relativa de p21
waf1 proteína en líneas de linfoma de células T y de células de carcinoma en relación con la actina. Los medios y el error estándar de la media se determinaron a partir de al menos cinco experimentos independientes. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, **** P & lt; 0,0001). (B) Medición de RhoGTP activo en líneas celulares. (I) RhoGTP tire hacia abajo de ensayo que muestra los niveles constitutivos e inducidos de LPA RhoGTP activa en el linfoma de células T y líneas celulares de carcinoma epiteliales del timo. (Ii) gráfico que muestra el RhoGTP al total de proporción de proteína Rho mediante el escaneo de la intensidad relativa de las bandas de proteína en la no tratada y LPA inducida en TEC, TL, líneas de células MEF. Medios y error estándar de la media determinada a partir de cuatro experimentos independientes. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001 y **** P & lt;., 0001 mediante la t de Student y la prueba de ANOVA de dos vías
Todo el timoma y . líneas celulares de linfoma mostraron diversos grados de RhoA activada cuando se trató con ácido lisofosfatídico (LPA) (Figura 5B /i-ii) La inducción LPA de RhoA activo fue significativamente mayor en dos linfoma (TL-1 & amp; -2) y dos líneas de TEC (TEC-1 & amp; -2), que también mostró los 2 niveles más bajos Dlc 1 isoforma, en comparación con las líneas celulares de tipo salvaje correspondientes (Figura 5 B /I-II) Esta fue similar a homocigotos DLC1
gt /GT. las células, lo que indica que estas líneas pueden haber inactivado el alelo de tipo salvaje DLC1.
los tumores han activado K-Ras2 G12D mutación
para determinar que los tumores se deben a la activación de K-Ras2
alelo G12D, se extrajo el ARN celular de los tumores primarios y las líneas de células tumorales y luego realizó un análisis de la mutación basada pirosecuenciación para K-Ras2
mutación G12D (Figura 6). Todos los tumores primarios mostraron expresión del mutante K- alelo Ras2 (Figura 6F). Sin embargo, la expresión del alelo mutante fue de menos de 50% en los tumores primarios como lo revela la pyrogram, presumiblemente debido a la infiltración normal de las células (Figura 6D & amp; E). En las líneas celulares tumorales del tipo alelo mutante y salvaje se expresaron a niveles iguales indican ausencia de contaminación normal de las células (Figura 6F).
(A) Representación esquemática de la estrategia de PCR para la amplificación de K-Ras2 ADNc. (B) secuencia de K-Ras2 con la ubicación de las mutaciones y los cebadores pirosecuenciación posiciones relativas. (C) picos de referencia del programa que muestra el orden de dispensación y la secuencia. (D) Una pyrogram de tipo salvaje K-Ras2 alelo mostrando ninguna mutación, (E) un alelo mutante en una línea de células tumorales que muestra la presencia de mutantes, así como de tipo salvaje alelos y (F) el alelo mutante en una primaria micro diseccionado tumor. En la figura E, la diferencia en la intensidad relativa entre la base de nucleótidos específica alelo normal y mutante indica la presencia de células normales en el tumor.
DLC1 isoforma 2 metilación en el promotor timomas y los linfomas
a fin de comprender el mecanismo de reducción de la expresión de proteínas DLC1 en líneas de células tumorales, se ha estudiado el estado de metilación de DLC1 isoforma 2 y 3 promotores por tratamiento con bisulfito del ADN seguido de PCR y pirosecuenciación (Figura 7). Hemos identificado fuertes islas CpG en los promotores de isoformas DLC1 2 y 3 utilizando la versión v1.0 de metilo software Primer Express (Applied Biosystems) (Figura 7A). Un análisis más detallado de estas islas CpG utilizando MatInspector (suite de software Genomatix) reveló dos sitios adecuados para la secuenciación de bisulfito de cerca de un sitio de unión al promotor SP1 en DLC1 isoforma 2 y 3 promotores. Hemos dirigido cinco islas CpG ubicados 502 pb aguas arriba del codón de inicio para la isoforma 2 y cuatro islas CpG situado 851 pb corriente arriba del codón de inicio de la isoforma 3 (Figura 7B). ADN de los tumores primarios microdissected así como la línea de células tumorales derivadas de ADN reveló extensa metilación del promotor DLC1 isoforma 2 (30-70%) en los 5 islas CpG en comparación con ADN de timo normal (Figura 7F). El promotor de la isoforma DLC1 3 se ha encontrado para ser altamente metilada (40-100%) en el tejido normal y en tumores primarios para todas las 4 islas CpG analizado (Figura 7F). La frecuencia de metilación en el tumor primario también coincide con el patrón de metilación del ADN observada en la línea celular.
(A) Representación esquemática de las islas CpG (barra horizontal de color rosa), sitio de unión al promotor Sp1 (barra vertical de color amarillo ), la traducción codón de inicio (barra vertical roja cerca del extremo 3 '), y las islas CpG seleccionadas para el análisis de metilación (barra vertical verde oscuro) en la región promotora de DLC1 isoformas 2 y 3. (B) secuencia de ADN y la ubicación del cebadores de secuenciación para la pirosecuenciación (subrayados en rojo y verde - adelante y atrás cebador de PCR, respectivamente, cebador de secuenciación-cursiva). (C) Para Dispensación y pyrogram referencia de las isoformas 2 (i) y (ii). Pirograma de la normal (D) y el tejido tumoral (E) para las isoformas 2 (i) y 3 (ii). F: gráfico que muestra el porcentaje medio de metilación en los diferentes sitios CpG en las isoformas DLC1 2 y 3 promotores de tumores y timo normal
La deleción del locus DLC1 se ha notificado a ser responsable de la pérdida. expresión de la proteína en diferentes tumores humanos. Por lo tanto, para examinar la pérdida alélica en el locus DLC1, se utilizó pérdida basado microsatélite polimórfico de heterozigosidad análisis (LOH) alrededor del locus del gen DLC1 (Figura 8). El análisis LOH no reveló ninguna pérdida significativa en el locus DLC1 en la mayoría de los tumores; Sin embargo, hemos encontrado alteración tamaño de microsatélites para el marcador D8Mit293 en un tumor, así como la línea celular correspondiente ADN (Figura 8C). También hemos encontrado pérdida heterocigótica de D8Mit174 marcador en una lesión de pulmón metastásico (Figura 8C).
(A) Representación esquemática de la posición relativa de los diferentes marcadores de microsatélites usados para la pérdida de análisis de heterocigosidad. (B) autorradiografías representativas que muestran los alelos específicos a los diferentes marcadores de microsatélites. La flecha indica la LOH de un alelo y el asterisco indica alteración del tamaño de microsatélites (MA) de un alelo, N-Normal, el estado T-tumor (C) de los alelos de los marcadores de cromosoma 8qA4 en los tumores del timo y del TCE y líneas celulares TL, así como tumores primarios y metastásicos correspondiente; HR - Mantenimiento de la homocigosis. Los tumores son tumores del timo 1-7 primarias correspondientes a las líneas de células TL y TEC. La subcategoría A y B bajo tumor 1-7 representa el ADN obtenido a partir de dos lesiones metastásicas pulmonares independientes del tumor primario correspondiente, respectivamente.
Con el fin de averiguar si la metilación del promotor DLC1 fue el responsable de la disminución DLC1 expresión de ARNm y proteínas, que trata las líneas celulares derivadas de tumores con agente de desmetilación del ADN 5'-azacitidina (5 AzaC) y luego estudió la expresión de ARNm y proteínas DLC1. Curiosamente, el tratamiento con 5 AzaC aumentó la expresión de DLC1 isoforma 2 en comparación con las líneas de células tumorales de control (Figura 4C-/III y amp; E). El multiplex RT- PCR usando ADNc derivados de 5 AzaC tratadas líneas de células también mostraron uniformemente una alta expresión de DLC1 isoforma 2 y 3 mRNA en todas las líneas celulares tratadas.
Altered Estructura Citoesqueleto y el aumento de la motilidad celular en células tumorales
Como el incremento de la actividad de Rho está asociada con la formación de fibras de estrés y la motilidad celular, se analizó la frecuencia de formación de fibras de estrés y de adhesión focal en las líneas celulares cultivadas TEC y se compararon con las células epiteliales del timo normales. Las células tumorales contenían significativamente mayor número de fibras de estrés (26 ± 11/1000 m
2) y adherencias focales (28 ± 18/1000 m
2) en comparación con las células normales con 8 ± 9/1000 m
2 y 7 ± 15/1000 m
2, respectivamente frecuencia (valor de P & lt; 0,0001) (Figura 9). El tamaño promedio de las células tumorales (8-12 × 10
3 m
2) también fue significativamente mayor que su contraparte normal (6-8 × 10
3 m
2) (valor de p = 0,016). Por otra parte, las células tumorales mostraron más fibras de estrés ventral [20], mientras que, en las células epiteliales del timo normales subrayan fibras se organizaron sobre todo como arcos transversales [21] (Figura 9 A-C). También hemos observado fibras de estrés organizados en malla triangular como redes overarching el núcleo en la superficie celular dorsal en las células de timoma (Figura 9C).
(A) formación normal de las células epiteliales del timo que muestra fibras de estrés en la forma de un arco transversal anular. (B) tímico epitelial de células de carcinoma (Z pila-1) que muestra la formación de fibras de estrés ventral extensa y el aumento de la frecuencia de las adhesiones focales, (C) de la misma célula tumoral que muestra una organización estructural diferente de vinculina y actina en pila Z -7 en el dorsal superficie de la célula. (D) Western blot que muestra la expresión transitoria de DLC1 isoforma 2 & amp; 3 proteínas marcadas con GFP C terminal en la línea celular de TEC. carcinoma de células epiteliales del timo transfectadas con (E) pEGFP C1 vector, (F) DLC1 isoforma 2 GFP construyen; (G) DLC1 isoforma 3 GFP. Diagrama (H) de barras que representa el número relativo de células que están mostrando las neuritas como extensiones expresa como un porcentaje de células que expresan GFP transgén totales.
Las fibras de estrés fueron abolidos cuando las células fueron transfectadas con TEC GFP etiquetada longitud completa DLC1 isoforma 2 (Figura 9E-G). La expresión de las proteínas de fusión GFP-DLC1 también se verificaron en una transferencia de Western usando el anticuerpo contra GFP (Figura 9D). Se encontró que la proteína de fusión GFP-2 isoforma DLC1 localizada a las adhesiones focales (Figura 9F). También hemos notado que las células tumorales mostraron la formación abundante de "neuritas como" extensión citoplasmática o estructuras filipodial junto con la destrucción del conjunto de fibras de estrés cuando transfectadas con GFP etiquetados DLC1 isoforma 3 (Figura 9H). Todas las células transfectadas DLC1 finalmente murieron 3-4 días después de la transfección.
Para determinar si las células T de linfoma con niveles más bajos DLC1 mostraron un aumento de la extravasación y la migración, un ensayo de migración transendothalial se llevó a cabo (Figura 10). La tasa de invasión de las células de linfoma T se encontraron significativamente más alta en la línea celular de linfoma de 1 y 2 en comparación con la sangre periférica normal (PBL) derivados de células T línea (valor p = 0,0007 y 0,021, respectivamente, la Figura 10C). Sin embargo, las líneas celulares de linfoma 2 restantes, con comparativamente mayor expresión DLC1, no mostraron diferencias significativas en la invasión (valor de p = 0,068). Todas las líneas celulares de linfoma también mostraron significativamente más alta tasa de dirigir la estructura pseudopodal ventaja en comparación con las células T normales PBL (valor de P & lt; 0,04) (Figura 10D). El aumento de la formación de borde principal seudópodo y la migración transendotelial en línea celular de linfoma 1 y 2 coincide con el aumento de la metástasis en el correspondiente cohorte ratones (Figura 3).
(A) mostrados son dos células TL que habían invadido entre el endotelial Células. Las células TL se tiñeron con anticuerpos anti-CD3 específicos de marcador receptor de las células T y las células endoteliales fueron teñidas con DAPI y TRITC-faloidina. El panel superior muestra imágenes representativas de pila Z del tramo superior (por encima de las células endoteliales) y la flecha indica la formación de pseudópodos (B) ensayo de migración transendotelial de células de linfoma T. Tres reconstrucciones tridimensionales que muestran dos células TL que habían invadido la monocapa endotelial confluente. Z imágenes apiladas tomadas a intervalos de 0,5 micras se han utilizado para la reconstrucción de la imagen en 3D. (C) El porcentaje de trans-endotelial migró líneas de células T de linfoma. La media y el error estándar se muestran para 5 experimentos (D) Porcentaje de células que mostró una estructura que lleva seudópodo borde debajo de las células bEnd.3. La media y el error estándar de la media se muestran para 4 experimentos en los que se analizaron más de 200 células por experimento. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001 y **** P & lt; 0,0001 por prueba t de Student).
Discusión
La gen DLC1 al igual que otros genes supresores de tumores, por ejemplo TP53, APC y BRCA1, utiliza promotores alternativos para producir al menos tres isoformas de longitud completa en ratones [22] - [25]. Existe una creciente evidencia de un uso selectivo de promotores alternativos, que regula la transcripción diferencial, pueden estar implicados en la iniciación y progresión del cáncer [26]. El uso aberrante de un promotor sobre otro en genes, tales como TGFB3, LEF1 y CYP19A1, está directamente relacionada con el crecimiento de células cancerosas (por [26]). Los promotores alternativos utilizados por el gen DLC1 son conservadas evolutivamente y común entre los otros miembros de la familia Dlc [27], [28]. El gen DLC1 tiene tres transcritos mayoritarios alternativos que se describieron anteriormente como 7.4, 6.1 y 6.2 Kb transcripción por Sabbir et al. [8]. Estas isoformas han sido designados como isoforma 1, 2 y 3, respectivamente, en la UCSC Genome Browser de ratón julio de 2007 (NCBI37 /mm.9) Asamblea. Para esta discusión, vamos a utilizar la nomenclatura de las isoformas de la UCSC. Anteriormente, se ha demostrado que las tres isoformas de la transcripción de gen DLC1 se expresan en diversos grados en diferentes tejidos de ratón, pero su papel individual en la génesis tumoral es aún desconocido [8]. La expresión espacio-temporal de las isoformas DLC1 humanos equivalentes a DLC1 ratón todavía es insuficiente. Recientemente, Low et al. han identificado una nueva isoforma DLC1 4 en los seres humanos, que corresponde a la isoforma DLC1 3 en el ratón y se ha encontrado silenciado en múltiples líneas de carcinoma de la hipermetilación del promotor [29]. El ratón genetrap que hemos utilizado en nuestro estudio ha mostrado previamente para atrapar DLC1 isoforma 2 y reduce su expresión pero, no isoformas 1 y 3 [8]. El promotor de la isoforma 3 mostró un alto grado de metilación constitutiva en el tejido del timo normal y células tumorales del timo. Ambos tipos de células todavía mostraron expresión de la isoforma 3 del ARNm. Alta metilación del promotor DLC1 con la continuación de la expresión del gen también se ha informado de la isoforma 2 en el linfoma canino [30]. Estos resultados indican que el estado de metilación por sí sola puede no ser suficiente para predecir la expresión de DLC1 isoforma 3, al menos en el timo y los linfocitos T. Estos resultados también sugieren que la pérdida seleccionadas de DLC1 isoforma 2 expresión puede ser suficiente para la progresión del tumor.
El genetrap DLC1 por sí solo es incapaz de inducir tumores sin embargo, en presencia de K-Ras2
mutación G12D, aumenta frecuencias de tumores y metástasis en comparación con K-Ras2
mutación G12D sólo los ratones, lo que indica un efecto aditivo. El condicional K-Ras2
ratón G12D utilizado en este estudio se informó anteriormente para desarrollar adenocarcinoma de pulmón en el momento de la entrega intranasal de virus AdenoCre [17]. Otro modelo de ratón transgénico, LA1-K-Ras2, donde el K-Ras2
alelo G12D puede ser activado por un evento de recombinación intracromosómica somática, mostró una elevada incidencia de tumores de pulmón, pero, también una incidencia 30% de linfoma tímico y otra tumor tipos [31]. En nuestro estudio, hemos encontrado tumores predominantemente del timo, junto con lesiones neoplásicas en muchos otros órganos que utilizan la inyección en vena de cola de AdenoCre. Estudios anteriores han demostrado que la inyección en vena de cola de AdenoCre principalmente se dirige al hígado, el bazo y los riñones y a un extender el timo, el corazón y el tejido pulmonar [32], [33].
La frecuencia global menor de lesiones neoplásicas y los tumores del timo fue significativamente mayor en los ratones KD lo que sugiere que la captura DLC1 isoforma 2 puede haber proporcionado una ventaja para la iniciación de la génesis tumoral. Los ratones KD también mostró una reducción significativa en la supervivencia global. El aumento de la metástasis de linfoma en los pulmones de los ratones KD puede ser la causa de la reducción de la supervivencia en estos ratones.