Extracto
Introducción
se induce La proteína regulada por glucosa 78-kDa (GRP78) en el microambiente del cáncer y puede ser considerado como un nuevo factor de predicción de la capacidad de respuesta a la quimioterapia en muchos tipos de cáncer. En este estudio, se encontró que las especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) y factor nuclear relacionada con el factor de 2 eritroide 2 (Nrf2) translocación nuclear fueron mayores en GRP78 desmontables DLD-1 en las células de cáncer de colon en comparación con las células de control revueltos.
Metodología /Principales conclusiones
El tratamiento con epirubicina en GRP78 desmontables células DLD-1 aumento de la apoptosis y se asoció con una disminución de la producción de ROS intracelulares. Además, la apoptosis se incrementó por la galato de propilo antioxidantes (PG) y ditiotreitol (DTT) en células de control revueltos epirrubicina-tratada. células GRP78 desmontables epirrubicina tratados resultaron en los miembros más inactivadas Akt, tales como Akt fosforilada y GSK-3β, así como objetivos de abajo de la expresión de β-catenina. Desmontables de Nrf2 con pequeños ARN de interferencia (siRNA) aumento de la apoptosis en las células GRP78 desmontables epirrubicina tratados, lo que sugiere que Nrf2 puede ser un mecanismo de defensa primaria en las células GRP78 desmontables. Se demostró además que las células GRP78 desmontables epirrubicina tratados podrían disminuir vía de supervivencia señalización a través de la activación redox de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), que es una serina /treonina fosfatasa que regula negativamente la vía de Akt.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que la epirubicina disminuyó el intracelular de ROS en células GRP78 desmontables, que disminuyeron la señalización a través tanto de la ruta de Akt y la activación de PP2A supervivencia. En conjunto, estos mecanismos han contribuido a mejorar el nivel de la apoptosis inducida por epirubicina que se observó en las células GRP78 desmontables
Visto:. YJ Chang, Huang YP, Li ZL, Chen CH (2012) GRP78 Derribo potencia la apoptosis a través de la baja regulación del estrés oxidativo y Akt después del tratamiento epirubicina en cáncer de colon DLD-1 células. PLoS ONE 7 (4): e35123. doi: 10.1371 /journal.pone.0035123
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Febrero 2012; Aceptado: March 13, 2012; Publicado: 18 de abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC 99-2320-B-415-002-MY3; el sitio web del Consejo Nacional de Ciencia: http://web1.nsc.gov.tw/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GRP78 es un jefe regulador de la función del retículo endoplasmático (ER). Las funciones de GRP78 incluyen (1) el plegamiento de proteínas y de reunión, (2) proteína de direccionamiento mal plegada para la degradación, y (3) ER Ca
2 + unión a y control de la activación de los sensores de tensión transmembrana ER. Por otra parte, debido a su propiedad anti-apoptótica, GRP78 se induce en una amplia variedad de células cancerosas y las células cancerosas resistentes a los fármacos [1]. Curiosamente, la expresión GRP78 es significativamente más fuerte en el cáncer de colon que en adenoma de colon y el tejido normal [2]. Además, un estudio reciente mostró que desmontables GRP78 no sólo suprime de manera eficiente la proliferación de células de cáncer de colon RKO, sino también indujo la apoptosis temprana de las celdas [3]. Por otra parte, GRP78 regulación a la baja se ha demostrado que el resultado en la sensibilización del cáncer de colon a la apoptosis inducida por paclitaxel-[4]. Tomados en conjunto, estos informes ponen de relieve la importancia del papel de GRP78 en el tratamiento terapéutico.
Varios agentes contra el cáncer como resultado del estrés oxidativo mediante la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la inducción de citotoxicidad y apoptosis en células de cáncer [5]. El estrés oxidativo que se produce durante la quimioterapia, sin embargo, puede interferir con los efectos citotóxicos de los agentes contra el cáncer, que dependen de la rápida proliferación de las células cancerosas para la actividad óptima [5]. Otros estudios también han ilustrado que el estrés oxidativo moderado puede estimular la proliferación y la supervivencia de las células cancerosas a través de mecanismos de acondicionamiento, mientras que el aumento de ROS sobreproducción por prooxidantes bajo estrés oxidativo severo puede resultar en apoptosis y muerte celular [6]. En la señalización redox, Nrf2 juega un papel crítico en la transcripción de una serie de genes que contribuyen a la fase II /III enzimas y la defensa contra el estrés oxidativo [7]. Hay evidencia creciente de mutaciones frecuentes de Nrf2 en los cánceres humanos, que se traducen en una gran cantidad de Nrf2 translocación nuclear y conducen a la expresión constitutiva de genes citoprotectores y de desintoxicación. Las ventajas de crecimiento y resistencia a la apoptosis proporcionadas por estos genes proporcionan quimiorresistencia durante la terapia [8]. Otros informes también han ilustrado que el tratamiento con fármacos quimioterapéuticos activa la vía Nrf2, que induce genes citoprotectores y modula la quimiosensibilidad en células de cáncer de colon [9]. Por lo tanto, la inhibición de la translocación nuclear de Nrf2 se puede presumir de suprimir la proliferación celular y potenciar la apoptosis en el cáncer. Tomados en conjunto, estos estudios muestran que el estrés oxidativo y la regulación redox de juego un papel importante en la quimioterapia.
Akt es un regulador de apoptosis que se activa en muchos tipos de cáncer y puede promover la resistencia a los medicamentos
in vitro
[10 ]. las señales de supervivencia inducidas por diversos receptores están mediadas principalmente por Akt; por lo tanto, la vía de Akt puede promover fenotipos resistentes [11]. La desregulación recurrente de la Akt en los cánceres de señalización de supervivencia se ha traducido en un gran interés entre los investigadores que intentan bloquear esta vía para fines de tratamiento [12]. Por lo tanto, la inhibición de la vía de Akt está siendo considerada como una estrategia novedosa para sensibilizar a las células cancerosas a medicamentos contra el cáncer [13].
La epirubicina es un análogo de la antraciclina doxorrubicina derivado que tiene un mejor índice terapéutico que la doxorrubicina [14]. Con la misma dosis, epirubicina provoca menor toxicidad hematológica y cardíaca que la doxorrubicina [15]. El mecanismo de epirubicina sobre la citotoxicidad parece implicar la producción de ROS [16]. Hasta la fecha, el mecanismo anticanceroso detallada de epirubicina en células de cáncer de colon GRP78 desmontables no ha sido dilucidado. En el presente estudio, estábamos interesados en comprender el efecto anticancerígeno de epirubicina sobre el potencial apoptótico de GRP78 caída en las células DLD-1 de cáncer de colon humano. También estábamos interesados en comprender el mecanismo de apoptosis de GRP78 caída sobre el estrés oxidativo, la regulación redox y la vía de supervivencia Akt durante epirubicina tratamiento para que una guía puede ser desarrollado para terapias antineoplásicas adicionales para los cánceres de colon humano.
Materiales y métodos
línea celular, reactivos y productos químicos
la línea celular de cáncer de colon humano DLD-1 se obtuvo de la Colección del Centro de Investigación y bio-(Hsinchu, Taiwán). RPMI-1640 y suero fetal bovino (FBS) se obtuvieron de Hyclone (South Logan, UT) y Gibco Inc. (Freehold, NJ), respectivamente. En arrestar-agente de transfección se obtuvo a partir Abrir Biosystems Inc. (Huntsville, AL). El Nrf2 siRNA, revueltos siRNA, anticuerpos primarios contra p-Akt (Thr308), Akt, NRF-2, GSK-3β, β-catenina, SP-1 y GAPDH se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA ). El kit de ensayo de quinasa Akt fue adquirido de Cell Signaling Technology (Boston, MA). El reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad se adquirió de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). El kit de ensayo de fosfatasa Ser /Thr se adquirió de Millipore Corporation (Billerica, MA). Galato de propilo (PG), ditiotreitol (DTT), yoduro de propidio (PI), 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), de DNasa libre de RNasa A, dimetil sulfóxido (DMSO), azul de tripano, primario anti-actina anticuerpos y otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
cultivo de células y tratamiento
células DLD-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 10% de FBS . La solución madre de epirubicina se disolvió en DMSO, y se preparó la concentración tratado (500 ng /ml) en medio RPMI-1640.
Generación de células DLD-1 desmontables GRP78
La expresión de GRP78 fue derribado en las células DLD-1 con siRNA. Brevemente, la secuencia diana para el ARNm GRP78 humana era 5'-AAGGTTACCCATGCAGTTGTT-3 '. La secuencia de siRNA revueltos fue 5'-AAGGTGGTTGTTTTGTTCACT-3 '. El GRP78 siRNA y revueltos siRNA se insertaron en el vector pSUPERIOR y se transfectaron en las células DLD-1. Las células que se transfectaron con éxito y se seleccionaron por resistencia a los antibióticos como se describe anteriormente [17] - [19]. En el presente estudio, las células DLD-1 transfectadas con siRNA GRP78 fueron nombrados células GRP78 una caída, y las células DLD-1 transfectadas con siRNA revueltos fueron nombrados células de control revueltos. La expresión de GRP78 en las células de control revueltos y las células GRP78 desmontables se evaluó mediante Western Blot.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Las células (1 × 10
6) se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 60 mm durante 24 h. El medio de cultivo se reemplazó con medio nuevo, y las células fueron expuestas a la epirubicina durante 48 h. Después del tratamiento, una mezcla se hizo con 1 parte 0,4% de azul de tripano y 1 parte suspensión de células. a continuación, se incubó la mezcla durante aproximadamente 3 minutos a temperatura ambiente, se aplicó una gota de la mezcla azul /célula de tripano a un hemacitómetro y sin teñir (viable) y se tiñeron las células (no viables) se contaron por separado en el hemacitómetro.
daño del ADN y análisis del ciclo celular
daño en el ADN y el ciclo celular se evaluaron mediante tinción con PI y citometría de flujo. Las células (1 × 10
6) se cultivaron en 60 mm placas de cultivo de tejido durante la noche. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco, y las células se trataron con epirubicina durante 48 h. Después del tratamiento, las células se recogieron, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron en PBS-metanol solución (01:02, volumen /volumen), y se mantuvieron a 4 ° C durante al menos 18 h. Después de un lavado con PBS, los sedimentos celulares se tiñeron con una solución de PI (PBS, 40 mg /PI ml y 40 mg /ml de DNasa libre de RNasa A) por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron mediante un Becton-Dickinson FACScan citómetro de flujo (Franklin Lakes, NJ). Al menos 10.000 células fueron contadas por muestra, y los histogramas de ADN se evaluaron adicionalmente usando software Modfit en una estación de trabajo PC para calcular el porcentaje de células en las diversas fases del ciclo celular y para cuantificar las células con daño en el DNA (subG
1 fase).
intracelular de ROS medición
La producción de ROS intracelular fue detectado por citometría de flujo utilizando DCFH-DA. Después del tratamiento, las células se lavaron una vez con PBS, se trataron con 20 mM DCFH-DA durante 30 min en la oscuridad, se lavaron de nuevo con PBS, se recogió por centrifugación, y se suspendieron en PBS. Los niveles intracelulares de ROS, que fueron indicados por la fluorescencia de diclorofluoresceno (DCF), se midieron a través de un filtro de barrera de 530/22 nm usando un Becton-Dickinson FACScan citómetro de flujo.
Nrf2 siRNA transfección
Para silenciar la expresión génica de Nrf2, tres conjuntos de oligonucleótidos de ARNsi fueron diseñados: (1) 5'-GCAUGCUACGUGAUGAAGAtt-3 '(sentido) y 5'-UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt-3' (antisentido); y (2) 5'-CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt-3 '(sentido) y 5'-UUUCACAUCACAGUAGGAGtt-3' (antisentido); y (3) 5'-GUGUCAGUAUGUUGAAUCAtt-3 '(sentido) y 5'-UGAUUCAACAUACUGACACtt-3' (antisentido). Las células (4 × 10
5) se cultivaron en placas de 60 mm en 5 ml de medio RPMI-1640 complementado con 10% de FBS y se transfectaron a 40% de confluencia mediante la adición de detención-In agente de transfección (Huntsville, AL) y Nrf2 siRNA. Control de las células fueron tratadas con agente de transfección Arrest-A y el siRNA revueltos [5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '(sentido) y 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3' (antisentido)], que no dieron lugar a la degradación específica de cualquier mensaje de celulares . Las células se enjuagaron con medio después de 25 min de incubación y luego se mantuvieron en cultivo durante 24 h adicionales. La expresión nuclear de Nrf2 se evaluó mediante Western Blot.
Akt actividad quinasa ensayo
actividad quinasa Akt se detectó usando el kit de ensayo de quinasa Akt no radiactivo. Brevemente, las células cultivadas en placas de 60 mm se trataron con 500 ng /ml epirubicina o vehículo como control. Después de epirubicina tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se recogieron con un tampón de lisis celular [Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton, pirofosfato de sodio 2,5 mM , 1 mM de β-glicerofosfato, 1 mM Na
3Vo
4, y 1 mg /ml de leupeptina]. El contenido de proteína se midió usando un reactivo de ensayo de proteínas de Bio-Rad. quinasa Akt se inmunoprecipitó a partir del extracto de células (300 g de proteína) usando un anticuerpo monoclonal de conejo conjugado con grano fosfo-Akt (Ser473) y se incubó con agitación suave durante la noche a 4 ° C. Los sedimentos se lavaron dos veces con un tampón de lisis celular y después se lavaron dos veces con 500 μ1 de tampón de quinasa. Los gránulos se suspendieron en 50 l de tampón de quinasa suplementado con 1 l de ATP 10 mM y una cantidad apropiada de sustrato de quinasa (proteína de fusión GSK-3) durante 30 min a 30 ° C. La reacción se terminó con 25 l de 3 × tampón de muestra SDS. La fosforilación de la proteína de fusión de GSK-3 se detectó por Western Blot con antiphospho-GSK-3α /β (Ser21 /9) anticuerpo monoclonal de conejo.
La proteína fosfatasa 2A (PP2A) Ensayo de actividad
PP2A la actividad se ensayó usando el kit de ensayo de fosfatasa Ser /Thr. Brevemente, las células se lisaron con el tampón de lisis como se sugiere por el protocolo incluido en el kit. Una parte alícuota correspondiente a 50 g de proteína se utilizó para evaluar la actividad de PP2A utilizando el protocolo del fabricante. La absorbancia de la solución de reacción se midió en placas de 96 pocillos a 405 nm en un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA).
análisis de transferencia de Western
Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en un tampón de extracción de proteínas de 10 min, y se centrifugó a 12.000 × g durante 10 min a 4 ° C para obtener las proteínas extraídas (sobrenadante). Las concentraciones de proteína se midieron con un reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad. Las proteínas celulares extraídos se hirvieron en tampón de carga, y una alícuota correspondiente a 50 a 100 g de proteína se separó en un gel de SDS-poliacrilamida al 12%. Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de transferencia de fluoruro de polivinilideno. Después de la transferencia, las membranas se incubaron con diferentes anticuerpos primarios durante la noche y se lavó después con solución PBST (0,05% de Tween 20 en PBS). Después del lavado, el anticuerpo secundario, que se marcó con peroxidasa de rábano picante, se añadió a la membrana durante 1 h y después se lavó con una solución de PBST (0,05% de Tween 20 en PBS). Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) con un analizador de quimioluminiscencia.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes y se analizaron utilizando
t de Student pruebas
. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo [20].
Resultados
caída GRP78 mejoró la muerte celular y la apoptosis inducida por el tratamiento epirubicina
Figura 1A muestra la expresión de GRP78 en las células de control revueltos DLD-1 y células DLD-1 desmontables GRP78. GRP78 desmontables células DLD-1 mostraron una menor expresión de GRP78 que las células DLD-1 de control revueltos. Además, evaluó la viabilidad celular y la apoptosis después de epirubicina en el tratamiento de la caída GRP78 y revueltos células DLD-1 de control. Figura 1B muestra que la viabilidad celular se redujo significativamente en las células GRP78 desmontables en comparación con las células de control codificados después de 48 h de 500 ng /ml tratamiento epirubicina. Además, el porcentaje de apoptosis de las células GRP78 desmontables (83.17%) fue mucho mayor que el porcentaje observado en las células de control revueltos (35,12%) 48 h después del tratamiento epirubicina (Figura 1C). Estos resultados sugieren que GRP78 es una proteína diana para la muerte celular inducida por la epirubicina y la apoptosis en DLD-1 de cáncer de colon.
(A) Análisis de la expresión GRP78 en la caída células revueltos y GRP78 DLD-1 por transferencia de western . Análisis de (B) la viabilidad celular y (C) la apoptosis después del tratamiento con vehículo (control) y epirubicina (epi). Revueltos control y células DLD-1 desmontables GRP78 fueron tratados con epirrubicina (500 ng /ml) durante 48 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Los porcentajes de células que estaban en la subG
1 fase (indicado por daño en el ADN) se determinaron como se describe en el
Materiales y Métodos
. Los valores se representan como la media ± desviación estándar (n = 5-8) de los experimentos individuales. diferencias significativas para el grupo control y el grupo de control revueltos son
P Hotel & lt; 0,05 (*) y
P Hotel & lt; 0,05 (#), respectivamente. Estos experimentos se realizaron al menos 3 veces, y se presenta un experimento representativo.
GRP78 desmontables reducida epirubicina inducida por ROS intracelular
Para evaluar el estrés oxidativo intracelular, ROS intracelular se evaluaron por tinción con DCFH-DA en las células control y las células revueltos GRP78 desmontables. La figura 2A muestra que las células exhiben GRP78 desmontables de 7 a 10 -fold mayor DCF fluorescencia de las células de control codificados después de 24-48 horas de cultivo, lo que indicaba que existía significativa el estrés oxidativo en las células GRP78 desmontables. El tratamiento de las células de control revueltos con epirubicina resultó en ROS aumenta de 1.3- y 1.5 veces a las 24 y 48 h en comparación con las células de control sin revueltos epirubicina (Figura 2B). Por el contrario, intracelular de ROS se redujeron por 0.65- y 0,81 veces en las células GRP78 desmontables epirrubicina tratados a las 24 y 48 h en comparación con las células desmontables GRP78 sin epirubicina (Figura 2B). La dosis de epirrubicina más de 500 ng /ml no aumentó el ROS en el GRP78 desmontables células DLD-1. La epirubicina inhibió la ROS en una forma dependiente de la dosis en las células DLD-1 desmontables GRP78 (Figura 2C). Estos resultados sugieren que la reducción de ROS intracelular puede potenciar la apoptosis en células de control revueltos epirrubicina-tratada. Cuando el PG antioxidantes y DTT, que se utilizan para disminuir intracelular de ROS, se añadieron a las células de control revueltos epirrubicina-tratada, la apoptosis se aumentó de 35,12% a 53,18% y 83,06%, respectivamente (Figura 2D). Curiosamente, ni tampoco la TDT PG por sí sola podría inducir la apoptosis en las células control revueltos.
células DLD-1 desmontables GRP78 control y revueltos fueron (A) se cultivaron durante 24 y 48 h o (B) tratados con epirubicina (500 ng /ml) durante 24 o 48 h. GRP78 desmontables células (C) DLD-1 fueron tratados con epirrubicina (500, 750, 1000 ng /ml) durante 48 h. ROS intracelular se evaluó mediante tinción DCFH-DA y citometría de flujo como se indica en el
Materiales y Métodos
. (D) codificado control de las células DLD-1 se trataron con 500 ng /ml epirubicina (epi) solo, 25 mM galato de propilo (PG) por sí sola, ditiotreitol 1 mM (DTT) solo o combinado con epirubicina PG o TDT para 48 h. Los porcentajes de células que estaban en la subG
1 fase (indicado por daño en el ADN) se determinaron como se describe en el
Materiales y Métodos
. Los valores se representan como la media ± desviación estándar (n = 5-8) de los experimentos individuales. Una diferencia significativa entre el grupo de control se fijó en
P
. & Lt; 0,05 (*) guía empresas
Nrf2 está implicada en el mecanismo de defensa de las células GRP78 desmontables
Nrf2 es un factor de transcripción que responde a la estimulación intracelular de ROS y se transloca al núcleo mediante la unión del elemento de respuesta antioxidante y la transcripción de enzimas de fase II. Estudiamos Nrf2 translocación nuclear en las células de control y las células revueltos GRP78 desmontables. La Figura 3A muestra que Nrf2 translocación nuclear aumentó aproximadamente 1,6 veces en las células GRP78 desmontables en comparación con las células de control revueltos. También se evaluó si la translocación nuclear de Nrf2 jugó un papel defensivo frente a la apoptosis inducida por epirubicina en las células GRP78 desmontables. Las células GRP78 desmontables se trataron con Nrf2 siRNA para 24 h para inhibir la expresión Nrf2 antes de la incubación con epirubicina durante 48 h. Después de la incubación la epirubicina, la apoptosis se evaluó por citometría de flujo. La Figura 3B muestra que, la expresión de Nrf2 fue marcadamente inhibida por Nrf2 siRNA en las células GRP78 desmontables, y la Figura 3C muestra que la apoptosis se incrementó significativamente por tratamiento Nrf2 siRNA en las células GRP78 desmontables epirrubicina-tratada, lo que indica que Nrf2 proporciona un importante mecanismo de defensa GRP78 cuando fue derribado en las células DLD-1.
(a) codificado control y GRP78 desmontables células DLD-1 se cultivaron durante 48 h, y la expresión nuclear de Nrf2 se evaluó mediante Western Blot. (B) El GRP78 desmontables células DLD-1 fueron pretratados con siRNA revueltos (sc) o Nrf2 siRNA durante 24 h, y la expresión Nrf2 nuclear se evaluó mediante Western Blot. (C) El GRP78 LDN-1 células fueron pretratadas desmontables con siRNA revueltos (scramble) o Nrf2 siRNA durante 24 h y se trataron con 500 ng /ml epirubicina (epi) durante otras 48 h. Después del tratamiento, se determinó el porcentaje de células que estaban en el subG
1 fase indicada por daño en el ADN como se indica en el
Materiales y Métodos
. Estos experimentos se realizaron al menos 3 veces, y se presenta un experimento representativo.
caída GRP78 aumentaron la inhibición mediada por epirubicina de la vía Akt
Cada vez hay más pruebas de que la Akt vía proporciona una conexión entre las señales de supervivencia extracelulares y los factores que inducen eventos apoptóticos en las células [21]. Para investigar si la vía de Akt está implicado en la apoptosis mediada por epirubicina, se analizó el estado de fosforilación de Akt en las células de control revueltos y la GRP78 desmontables células después de epirubicina tratamiento. Se prepararon lisados celulares, y el nivel de fosforilación de Akt se analizó por transferencia Western con el anticuerpo anti-fosfo-Akt (Thr308). la fosforilación de Akt se redujo a un mayor grado en las células GRP78 desmontables en comparación con las células de control codificados después de 24 y 48 h de tratamiento epirubicina (Figura 4A). También se investigaron los efectos de epirubicina sobre la actividad quinasa Akt mediante inmunoprecipitación y técnicas de Western Blot. La epirubicina inhibió el nivel de fosforilación de GSK-3α /3β, (como se ha visto con la actividad de la quinasa Akt) tanto en las células de control revueltos y las células GRP78 desmontables, y la disminución de la actividad de la quinasa Akt parecía estar reforzada en el knockdown GRP78 las células a las 48 h (Figura 4B). Debido a los hallazgos recientes han sugerido que la proteína GSK-3β, que es un jugador clave en la apoptosis de respuesta al estrés, es uno de los sustratos de proteínas aguas abajo para Akt quinasa [22], la supresión epirubicina inducida de la fosforilación de Akt puede inhibir Akt dependiente fosforilación de GSK-3β. Para probar esta posibilidad, los lisados de proteínas totales preparados a partir de células de control revueltos epirrubicina tratadas y células GRP78 desmontables se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo fosfo-GSK-3β que reconoce específicamente GSK-3β fosforilada en Ser-9. Revueltos células control y células GRP78 desmontables mostraron una disminución significativa de la fosforilación de GSK-3β, y el más alto nivel de inhibición se produjo en las células GRP78 desmontables incubadas con epirubicina durante 48 h (Figura 4C). Estos resultados sugieren que la inhibición de la cascada de señalización Akt fue reforzada por la caída GRP78 en las células tratadas con epirrubicina.
control mezclado y células DLD-1 desmontables GRP78 fueron tratados con epirrubicina (500 ng /ml) para la los tiempos indicados. La fosforilación de (A) Akt y (C) GSK 3β se evaluó mediante Western Blot. Se determinó (B) la actividad de Akt como se indica en el
Materiales y Métodos
. La proteína en la membrana PVDF teñida con azul brillante de Coomassie se muestra como un control interno. Estos experimentos se realizaron al menos 3 veces, y se presenta un experimento representativo.
caída GRP78 mejoraron la regulación a la baja epirubicina mediado de los objetivos de abajo de la vía de Akt
Hemos investigado si la inhibición de la vía de señalización Akt tuvo un efecto sobre objetivos de abajo en las células control y células revueltos GRP78 desmontables tratados con epirubicina. β-catenina es un objetivo GSK-3β que está implicada en la resistencia a la apoptosis y la supervivencia de señalización [23], y el aumento de la expresión de β-catenina se ha correlacionado con un aumento de la supervivencia en el cáncer [23]. Un examen de la expresión de β-catenina reveló que no se ha modificado de manera significativa en las células de control codificados después de 24 o 48 h de tratamiento epirubicina. Una reducción en la expresión de β-catenina, sin embargo, se observó después de 48 h de tratamiento epirubicina en las células GRP78 desmontables (Figura 5).
células DLD-1 desmontables GRP78 control y revueltos fueron tratados con epirrubicina (500 ng se evaluó /ml) durante los tiempos indicados, y la expresión de β-catenina por Western Blot. Estos experimentos se realizaron al menos 3 veces, y se presenta un experimento representativo.
GRP78 desmontables actividad fosfatasa 2A aumento de proteína con el tratamiento con epirubicina
Varios estudios han demostrado conexiones entre la vía de Akt y fosfatasas. Por ejemplo, PP2A ha demostrado ser una fosfatasa Akt clave que puede desfosforilar Akt en ambos los residuos de Thr 308 y Ser 493 y bloquear la vía Akt [21]. Además, examinó si la expresión y la actividad de PP2A estuvo involucrado en la apoptosis inducida por epirubicina en las células control revueltos y la GRP78 desmontables células. La Figura 6A muestra que la expresión de PP2A disminuyó en las células de control revueltos epirrubicina tratadas después de 48 h de tratamiento. Por el contrario, la expresión de PP2A se aumentó a 24 h y no disminuyó a las 48 h en las células GRP78 desmontables epirrubicina-tratada. La actividad de PP2A disminuyó ligeramente en 24 h y redujo significativamente a las 48 h en las células de control tratadas con epirrubicina revueltos. En contraste, la actividad de PP2A aumenta significativamente de aproximadamente 2 veces a las 24 h en las células GRP78 desmontables epirrubicina tratados (Figura 6B). actividad PP2A no disminuyó significativamente a las 48 h en las células GRP78 desmontables epirrubicina-tratada. Estos experimentos demostraron una clara relación entre el aumento de la actividad PP2A y la inducción de la apoptosis a través de la inhibición de la vía Akt en las células GRP78 desmontables durante epirubicina tratamiento. Esto pone de relieve la importancia de la GRP78 desmontables para la inhibición de las células DLD-1 proliferación.
células DLD-1 desmontables GRP78 control y revueltos fueron tratados con epirubicina (500 ng /ml) durante los tiempos indicados. (A) La expresión de PP2A se evaluó mediante Western Blot, y (B) la actividad de PP2A se determinó como se describe en el
Materiales y Métodos
. Estos experimentos se realizaron al menos 3 veces, y se presenta un experimento representativo.
Discusión
Una característica común de muchos tipos de cáncer es sus niveles aumentados de ROS. La fuente principal de estos ROS se incrementa la actividad metabólica [21]. los niveles de ROS altos y Nrf2 translocación nuclear en las células GRP78 desmontables indicaron que GRP78 juega un papel homeostático redox en las células DLD-1. En presencia de GRP78, solamente epirubicina inducida por un bajo nivel de ROS (& lt; 2 veces) en las células DLD-1, y un bajo nivel de ROS puede resultar en la activación de los sistemas antioxidantes específicos en las células de cáncer que pueden inducir resistencia a la quimioterapia. Curiosamente, los antioxidantes de TDT y PG tanto mejor será el efecto apoptótico de epirubicina en las células control revueltos. La reducción de ROS por epirubicina en las células GRP78 desmontables destacó la posibilidad de que el aumento de los niveles de ROS en las células DLD-1 puede tener un efecto directo sobre las vías de supervivencia celular.
GRP78 es una chaperona que existe en la sala de emergencias. En las células no estresadas, las proteínas transmembrana ER (PERK y IRE1) se mantienen en un estado inactivo por medio de la unión de GRP78 en sus dominios ER-luminal [24]. En general, los dominios luminales de las formas inactivas de PERK y IRE1 se componen de 1:1 complejos con GRP78 [25]. Una vez que se produce el estrés ER, desune GRP78 y se une con las proteínas no plegadas o plegadas incorrectamente, lo que permite la homo-oligomerización de PERK, IRE1 o ambos y los resultados en la autofosforilación de estas enzimas y la activación de sus sustratos [24]. Nrf2 es un sustrato directo de PERK y un efector de la supervivencia celular PERK dependiente de [26], lo que explica por qué la GRP78 desmontables DLD-1 células expresó una gran cantidad de Nrf2 nuclear.
Nrf2 actúa como un sensor para estrés oxidativo y regula la activación de genes defensivos, lo que conduce a la protección de las células contra los efectos adversos del estrés oxidativo y promueve la supervivencia celular [27]. En muchas células cancerosas, Nrf2 muestra características pro-tumorales que son similares a los de los genes citoprotectores idénticos que pueden aumentar la resistencia de células de cáncer a los fármacos quimioterapéuticos [8]. Por ejemplo, fluorouracilo estimula la vía Nrf2, que modula la quimiosensibilidad e induce genes citoprotectores en células HT-29 de cáncer de colon [9]. Nrf2 es un factor de transcripción crucial que controla una respuesta protectora contra los insultos tóxicos de un amplio espectro de sustancias químicas [25]. En los últimos años, los estudios han demostrado el papel de Nrf2 en la protección contra los nuevos y actuales fármacos quimioterapéuticos en los cánceres de sangre [8]. sobreexpresión Nrf2 también se ha observado en cáncer de páncreas [7]. Además, un estudio ha demostrado que la sobreexpresión estable de Nrf2 en células de cáncer induce un nivel mejorado de resistencia a los agentes quimioterapéuticos, incluyendo doxorrubicina, etopósido y cisplatino [25]. Otros informes han sugerido que la estrategia de utilización de inhibidores de Nrf2 para aumentar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos no se limita a medicamentos contra el cáncer o ciertos tipos de cáncer. De hecho, los inhibidores de Nrf2 pueden ser utilizados durante la quimioterapia para tratar muchos tipos de cáncer [25]. El presente estudio reveló que la apoptosis se ve reforzada por el tratamiento epirubicina en las células GRP78 desmontables siRNA tratada con Nrf2, lo que sugiere que Nrf2 juega un papel defensivo crítico en las células GRP78 desmontables.
Un estudio reciente reveló que el silenciamiento de Lin et al.