Extracto
resultante de la mutación, amplificación o translocación puede impulsar el crecimiento y la supervivencia en una subconjunto de cáncer humano.
FGFR2
se amplifica en la mama y el cáncer gástrico y Presentamos aquí la primera caracterización de
FGFR2
amplificación de genes en el cáncer colorrectal en la línea celular de cáncer colorrectal NCI-H716.
FGFR2
es altamente expresado y activado en las células NCI-H716, y los inhibidores de molécula pequeña de FGFR selectiva o FGFR2 shRNA inhibió fuertemente la viabilidad celular
in vitro
, lo que indica la "adicción" de las células NCI-H716 de FGFR2. crecimiento NCI-H716 en un modelo de xenoinjerto también fue inhibida por un inhibidor de molécula pequeña de FGFR. FGFR2 se requiere para la activación de múltiples proteínas de señalización corriente abajo AKT incluyendo, ERK, S6RP y NFKB. La inhibición de quinasas aguas abajo tales como AKT o ERK solo no tuvo efectos modestos sobre la proliferación, mientras que la inhibición combinada de AKT y ERK señalización resultó en una pérdida de la viabilidad similares a la inhibición FGFR2. Se identificaron los elevamos
FGFR2
expresión en un pequeño subconjunto de cáncer colorrectal primario, sin embargo
no se observó FGFR2
amplificación. Aunque
FGFR2
la amplificación no es común en el cáncer primario de colon o de los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas, otros subconjuntos de cáncer colorrectal, tales como ascitis, a partir del cual se derivó la línea celular NCI-H716, aún no se han probado. Estos resultados sugieren que la terapéutica del inhibidor de FGFR emergente puede tener eficacia en un subgrupo de cáncer de colon impulsado por
FGFR2
amplificación
Visto:. Mathur A, C Ware, Davis L, Gazdar A, Pan BS , Lutterbach B (2014)
FGFR2
se amplifica en la línea celular NCI-H716 de cáncer colorrectal y es necesario para el crecimiento y la supervivencia. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10.1371 /journal.pone.0098515
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Febrero, 2014; Aceptado: 2 de mayo de 2014; Publicado: 26 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Mathur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por Merck Research Labs. El donante prestado apoyo en forma de salarios para los autores (AM, CW, LD, BP, BL), pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores, excepto AG son empleados de Merck Research Labs. AM, CW, LD, BP y BL tienen intereses en competencia como los empleados de Merck, pero declaran que esta afiliación no altera su adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido. No hay restricciones sobre el intercambio de datos y /o materiales.
Introducción
Avanzado, el cáncer colorrectal etapa tardía se asocia con una mortalidad significativa y sigue siendo una necesidad médica insatisfecha. Los primeros resultados del diagnóstico en un pronóstico muy favorable, que las etapas 1 y 2 de la enfermedad, tales tienen una supervivencia del 80-90% de cinco años. Por el contrario etapa 3 y la enfermedad metastásica etapa 4 se asocian con cinco años las supervivencia de 60% y 8%, respectivamente [1]. Las aberraciones genéticas que surgen en la enfermedad en etapa temprana incluyen
APC
mutaciones, mientras que
KRAS, BRAF, p53
, y
PIK3CA
mutaciones se encuentran en etapas posteriores del desarrollo del tumor [2] - [4]. Sin embargo, estas mutaciones genéticas no han impactado en el tratamiento del cáncer colorrectal debido a que son mutaciones de pérdida de función (
APC, p53
) o no son sensibles a los inhibidores de MEK o PI3K (
BRAF, KRAS, PIK3CA
). Aunque la amplificación de la tirosina quinasa, la translocación, o mutaciones no son comunes en el cáncer colorrectal,
EGFR
amplificación se pueden encontrar en un subconjunto de cánceres colorrectales, [5], [6]. EGFR anticuerpos inhibidores tales como Cetuximab puede conducir a respuestas y beneficio en la supervivencia en
KRAS
cánceres de tipo salvaje, pero el papel de
EGFR
amplificación no está claro [7].
ErbB2 amplificación
También se ha informado [6], [8], y puede estar asociada con la respuesta a trastuzumab [9].
FGFR2
amplificación se ha descrito en 5% de los cánceres gástricos [10] y 1-4% de los cánceres de mama [11], [12], pero no se ha informado en el cáncer de colon. líneas celulares de mama y cáncer gástrico albergar
FGFR2
amplificación son muy sensibles a
FGFR2
inhibidores en modelos preclínicos [13] - [15], y la amplificación tanto en el cáncer de mama y gástrico se asocia fuertemente con , tumores mal diferenciados etapa tardía [11], [16]. En el cáncer gástrico
FGFR2
amplificación puede ocurrir en un tumor metastásico, pero no en el tumor primario asociado, también es consistente con un papel en el cáncer metastásico y última etapa [16], [17].
aquí definimos una novela
FGFR2
amplificación en la línea celular de cáncer colorrectal NCI-H716 que se derivó de la ascitis de un adenocarcinoma de colon pobremente diferenciado.
FGFR2
amplificación del gen FGFR2 resultados en la sobreexpresión y la activación constitutiva. Es importante destacar que, el crecimiento de células NCI-H716 y la supervivencia
in vitro
y en un modelo de xenoinjerto murino eran dependientes de FGFR2. La inmunohistoquímica reveló
FGFR2
sobreexpresión en un subconjunto de cáncer de colon primario, pero no se observó amplificación. Sin embargo, estas matrices no contenían muestras de ascitis derivados representante del origen de las células NCI-H716. Aunque
FGFR2
amplificación y sobreexpresión son poco frecuentes en el cáncer colorrectal, nuestro
in vitro Opiniones y en
in vivo y modelos sugieren que los inhibidores de FGFR emergentes podrían tener eficacia en un subgrupo de cáncer colorrectal que alberga esta amplificación.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
Las líneas celulares que eran de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en RPMI más 10% de ternera fetal suero y 100 ug /ml Pennicillin /estreptavidina (Sigma). PD173074 fue de Sigma (St. Louis, MO). MK2461 era de Merck [18].
análisis FISH
FISH de ADN se realizó en células NCI-H716 tratados con colcemid (0,02 g /ml para 3 horas) y en núcleos de tejido como se describe microarrays anteriormente [19], [20] el uso de clones de cromosomas artificiales de bacterias RP11-62L18 de
FGFR2
sondas. Esta sonda de pescado contiene la secuencia genómica de Chr10: 123,224,100-123,398,498, que abarca la totalidad del gen FGFR2 en Chr10: 123,237,844-123,353,481. Las sondas fueron marcadas directamente a través del espectro naranja dUTP y Spectrum Verde dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).
La inmunohistoquímica
anticuerpo H80 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) fue se usa a una dilución de 1:50 en NCI-H716 xenoinjerto y las secciones de cáncer gástrico Asterand y en una dilución 1:20 en núcleos de matriz de US Biomax Inc (Rockville, MD): CO802 (78 tumores primarios, 2 normal), CO702 ( 69 muestras-30 tumores primarios, 25 ganglios linfáticos, 8 metástasis hepáticas, 9 normal), CO992 (33 tumores primarios y 33 metástasis de ganglios linfáticos), BCO5115 (69 en total, 60 tumores primarios, 7 metástasis hepáticas), en estas matrices, 20 los pacientes eran menores de 35 años de edad. La tinción se realizó en una Ventana Descubrimiento XT utilizando Rabbit Ultra-HRP. La detección se realizó con el kit ChromoMap (Ventana Molecular Systems Descubrimiento, Tucson, AZ)
producción y la infección ShRNA
shRNA secuencias fueron los siguientes:.
F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC, España
F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC
F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC
F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC
luciferasa: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC
AAA. Revueltos: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG
GAGACAAAA Los oligonucleótidos fueron recocidos y 5'BbsI y 3 'SpeI utilizó para clonar en un plásmido ENTR propietaria seguido por conversión en pLenti6 /Bloque-iT-DEST (Invitrogen, Grand Island NY) con puerta de enlace ( Invitrogen, Grand Island NY). La producción de virus y la determinación del título fueron como se indica por Invitrogen. Para el análisis de crecimiento, las células se sembraron a 4000 células /pocillo en placas de 96 pocillos, mientras que para las células de análisis occidentales se sembraron a 40.000 células en placas de 12 pocillos. Se añadieron sobrenadantes virales durante 20 horas en presencia de 8 ug /ml de polibreno, en la que se eliminaron los sobrenadantes virales de punto y se sustituye con medio de crecimiento que contenía suero bovino fetal al 10%. Los lisados se prepararon para el análisis Western 48 horas más tarde.
ensayos de tratamiento con compuesto y de crecimiento
PD173074 (Sigma, St Louis MO) y MK2461 se diluyeron en DMSO para crear una serie de titulación tal como se describe anteriormente [ ,,,0],14]. Gleevec, lapatinib, PHS665753, y PD168393 eran de ChemieTek (Indianápolis IN) Anti IGF1R anticuerpo AF305 era de los sistemas R /D. Las células fueron tratadas en pocillos por triplicado, y después de 3 días el número de células se cuantificaron utilizando el reactivo Vialight (kit de ensayo Vialight, Cambrex, Rockland ME). La luminiscencia se cuantificó con un Topcount NXT HTS (Perkin Elmer, Waltham, MA) y las determinaciones de CI50 realizados mediante el uso de logística curva 4 parámetro de ajuste. Para la cuantificación de fosfotirosina en FGFR2 y manchas se escanearon y se cuantificaron utilizando el software ImageQuant. Los valores correspondientes a la banda de intensidad se representaron frente a la concentración del fármaco para establecer una IC50 de la inhibición de drogas. ScanMax perfiles de 442 quinasas estaba en Ambit Biosciences (San Diego, CA).
Factores
transferencia Western, inmunoprecipitación, anticuerpos y crecimiento
Los lisados se prepararon en 30 mmol /L Tris-HCL, pH 7,5, 50 mmol /L de NaCl, 5 mmol /L EDTA, 50 mmol /L NaF, 30 mmol /L Nappi, 1% de Triton, 0,5% de Igepal, 10% de glicerol, 1 mmol /L vanadato, 1 mmol /L bpPhen (Calbiochem), y inhibidor de la proteasa (Roche) y transferencia Western e inmunoprecipitación fueron como se describe [21], [22]. Los anticuerpos contra FGFR2 incluyen N-terminal MAB6841 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y H80 (Santa Cruz), C-terminal, C-20 (Santa Cruz) y Y653 /654 específico 3,471 ((Cell Signaling Technology, (CST) , Danvers MA.)). anticuerpos adicionales de CST fueron: pAKT S473 (4060), AKT (9272), Perk (4370), ERK (9102), pS6RP S235 /236 (2217), S6RP (2211), PARP escindida (9542), la beta actina (4967 ), p105 NFKB S933, NFKB p105, GAB1 Y672, FRS2 Y436, SHC Y317 CRKII Y221, PRAS40 T246, PDK1 S241, GSKIII S9, PKC S660, RSK S227 (sitio PDK1), RSK S359 /363 (sitio ERK), T172 AMPK (sitio LKB) y GAPDH. anticuerpo fosfotirosina 4G10 era de Upstate (Charlottesville VA). FGF2 recombinante era de I + amp;.; D Systems (Minneapolis MN) guía
La citometría de flujo
A Becton Dickinson FACS Calibur se utilizó para citometría de flujo en células NCI-H716. Las células se fijaron durante la noche en 1 ml de hielo frío de etanol al 70% y después se lavaron en PBS y se tiñeron con PI /RNasa (BD Pharmingen, San Diego) durante 3 horas. software ModFit se utilizó para determinar la distribución relativa en G1, S, G2 /M, y gating manual para determinar el contenido de subG1.
xenoinjerto
Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con IACUC (Institutional Animal Care y uso Comité) directrices y los experimentos fueron aprobados por el comité de revisión de Merck laboratorios de investigación ética. control y registro de bienestar de los ratones sistemática fue de acuerdo a las directrices para LLEGA aspecto, tamaño, estado del pelaje, la postura, la marcha, los niveles de actividad, la interacción con el medio ambiente y los signos clínicos. La eutanasia se coducted por exponer a los animales a CO
2 hasta que se observó el cese completo de la respiración durante un mínimo de 2 minutos (un total de aproximadamente 5 a 10 minutos). Los animales fueron inspeccionados visualmente para detectar la ausencia de movimiento y la respiración. La muerte también se aseguró mediante la eliminación del tejido del tumor o múltiples órganos.
5 × 10
6 células NCI-H716 se implantaron por vía subcutánea en ratones BALB /c ratones desnudos. Después de alcanzar 200 mm
3, los tumores se trataron con vehículo, 300 mg /kg o 800 mg /kg, una vez al día durante 24 días. 10 ratones en cada grupo, y el tamaño del tumor se determinó por medición del calibre. No hay animales experimentaron una pérdida de peso mayor que 5% durante los tratamientos. FGFR2, AKT y ERK inhibición
in vivo
se midió por dosificación de los animales y los tumores de recogida a las 4 y 24 horas después del tratamiento. Los tumores se colocaron en nitrógeno líquido y se procesan por la interrupción en 600 ul de tampón de lisis en un Lyzer tejido (Qiagen). Los lisados se cuantificaron y se procesaron para SDS-PAGE y transferencia Western como se describe para los lisados celulares.
Resultados
FGFR2
se amplifica, y se activa en las células NCI-H716
Debido a
FGFR2
amplificación puede impulsar el crecimiento de las células gástricas y cáncer de mama, se realizaron búsquedas de líneas celulares adicionales que albergan similares
FGFR2
copia de ganancia. microarrays de ADN confirmaron conocidos
FGFR2
amplificación en KATOIII y SNU16 líneas celulares de cáncer gástrico [23], [24] y se identificaron una novela de amplificación altamente focal en la línea celular de cáncer colorrectal NCI-H716 (Figura S1 A en S1 Archivo. la base de datos Oncomine [25] también reveló alta
FGFR2
la expresión del ARN Messager en células NCI-H716. la hibridación fluorescente in situ (FISH) reveló llamativo
FGFR2
copiar la ganancia y la duplicación de genes en regiones de tinción homogénea (Figura 1A). la sonda centrómero verde no puso de manifiesto el aumento de la copia, en consonancia con el amplicón muy focalizada en el
FGFR2
locus (Figura S1 a en S1 archivo). Una sonda de FISH para
Met
reveló ningún aumento de copia en NCI-H716 en este locus cromosoma 7, y la ganancia
FGFR2
sonda no mostraron amplificación en células de cáncer de colon DLD1 carece
FGFR2
copia (datos no mostrados). Nos a continuación, en comparación
FGFR2
expresión y activación de las células NCI-H716 con respecto a un panel de nueve líneas celulares de cáncer colorrectal sin
FGFR2
amplificación, y nos pareció golpear FGFR2 sobreexpresión y la fosforilación sólo en NCI-H716 células (Figura 1B). FGF2 no activó más FGFR2 en células NCI-H716, revelando que el receptor es máximamente fosforilado (datos no mostrados). El nivel de activación FGFR2 en células NCI-H716 fue similar a los niveles observados en el
FGFR2
amplifica SNU16 línea celular de cáncer gástrico (Figura S1 S2 en archivos). Llegamos a la conclusión de que en nuestro panel de líneas celulares de cáncer de colon que
FGFR2
está altamente sobreexpresado y se activa sólo en las células NCI-H716.
A. células NCI-H716 se trataron con colcemid (0,02 g /ml durante 3 horas), se fijaron con metanol /ácido acético, y se dejó caer en un portaobjetos de microscopio de acuerdo a los materiales y métodos. Bacteriana artificial RP11-62L18 copia cromosoma se marcó con Spectrum Naranja dUTP y una sonda de centrómero se marcó con Spectrum verde dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) y se hibridó a las células fijas. El color rojo indica
FGFR2
y verde indica centrómero. B. FGFR2 es sobreexpresada y contiene altos niveles de fosforilación de la tirosina en la línea celular NCI-H716. A, lisados celulares (preparados de acuerdo con Materiales y Métodos) de sin tratar o tratados (FGF2 30 ng /ml, 5 minutos) las células se lisaron y la concentración de proteína se determinó con el kit BCA (Pierce Rockford Ill Thermo Fisher). cantidades iguales de lisado (50 ug) se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot con anticuerpos FGFR2 hechas contra el N terminal (H80. MAB6841), C terminal (C20) y la activación Y653 fosforilación de bucle /654 (3471, p-FGFR2) y actina.
FGFR2 se requiere para el crecimiento de las células NCI-H716
FGFR2
la amplificación y la activación de las células NCI-H716 sugeridas esta quinasa puede ser necesario para la célula crecimiento. Se han tratado las células NCI-H716 con dos inhibidores de molécula pequeña de FGFR para probar un papel para FGFR2 en el crecimiento celular NCI-H716. En un gran panel de kinses, encontramos PD173074 ser un inhibidor altamente selectivo de FGFR-1, -2, -3 [14], y se confirmó aún más la selectividad notable aquí con un gran panel independiente de quinasas (Figura S3 en File S1). También se trataron las células con MK2461, un inhibidor de la quinasa Met pequeña molécula que inhibe también la fosforilación FGFR2 y el crecimiento de
FGFR2
líneas celulares de cáncer gástrico y de mama amplificados [13]. PD173074 y MK2461 fosforilación FGFR2 inhibió intensamente en las células NCI-H716 (Figura 2A) con una IC50 de 18 nM (PD173074) y 165 nM (MK2461, Figura S4A en File S1). Ambos compuestos inhibieron potentemente el crecimiento NCI-H716 con valores de CI50 de 25 nM para PD173074 y 130 nM para MK2461 (Figura 2B). Es importante destacar que la CI50 para la inhibición del crecimiento y la inhibición de la fosforilación FGFR2 fueron similares, y ambos valores también fueron similares a los valores obtenidos previamente para líneas celulares SNU16 y KATOIII [13], [14]. Habiendo observado una potente inhibición del crecimiento de células NCI-H716, próximo a prueba ambos compuestos para la inhibición en un panel de líneas celulares de cáncer de colon. Ambos compuestos inhibidores de FGFR muestran una selectividad sorprendente para la inhibición de las células NCI-H716, con más de 80 veces (MK2461) o 400 veces (PD173074) inferior IC50 relativa a la no
FGFR2
líneas celulares de colon amplificados ( Figura 2C). El inhibidor de FGFR AZD4547 también inhibe el crecimiento de forma selectiva en las células NCI-H716 (datos no mostrados). Finalmente, el crecimiento NCI-H716 no fue inhibida por el tratamiento con inhibidor de quinasa compuestos que carecen de la inhibición de FGFR, incluyendo Tarceva, Lapatinib, Gleevec, PHA665752 (un inhibidor de la Met) PD168393 (un inhibidor de EGFR irreversible) y un anticuerpo inhibidor IGF1R (Figura S4B en File S1 ).
A. PD173074 y MK2461 inhiben la fosforilación FGFR2. Las células se trataron durante 1 hora con una titulación de PD173074 como se describe en Materiales y Métodos. Los lisados se prepararon y proteína de 50 ug se sometieron a SDS-PAGE y Western Blot con fosfo Y653 /654 FGFR y MAB6841 anticuerpos totales FGFR2. B. PD173074 y MK2461 inhiben el crecimiento de células NCI-H716. Las líneas celulares se cultivaron en placas a 4000 células /pocillo y se incubaron durante la noche. células NCI-H716 se trataron con una titulación de PD173074 como se describe en Materiales y Métodos. El crecimiento celular se midió con el reactivo Vialight, y el crecimiento fue presentado en relación con las células no tratadas. C. PD173074 y MK2461 inhiben selectivamente el crecimiento de las células NCI-H716. líneas celulares de cáncer de colon que figuran en placas a 4000 células /pocillo y 24 horas más tarde fueron tratados con una titulación de compuestos. 4 días más tarde el crecimiento celular se midió con vialight y CI50 se calcularon a partir de la almohadilla de prisma gráfico. D.
FGFR2
shRNA disminuye la proteína FGFR2 en células NCI-H716.
FGFR2
shRNA se preparó y se infectaron las células NCI-H716 como se describe en los métodos. A la izquierda, la expresión FGFR2 se analizó con fosfo Y653 /654 y proteína total con MAB6841. E. El crecimiento se analizó después de la infección de 5 días con el reactivo Vialight.
Además, confirmó un papel crítico para FGFR2 en el crecimiento celular NCI-H716 utilizando
FGFR2
shRNA. Primero identificamos dos horquillas (F2 y F4, Figura 2D) con la eficiente
FGFR2
caída. Estas horquillas shRNA causaron la inhibición del crecimiento potente en células NCI-H716 (Figura 2E). Por el contrario, el control shRNA y shRNA que no disminuyeron los niveles de proteína FGFR2 (V y F1) no inhibieron el crecimiento de las células NCI-H716 (Figura 2D, E).
proteínas de señalización múltiples incluyendo AKT, ERK y NFKB son activados por FGFR2
ya se ha informado de que
FGFR2
activa AKT y ERK vías de señalización en FGFR2 amplificó líneas celulares de cáncer gástrico [14]. Por lo tanto, definimos la red de señalización FGFR2 en células NCI-H716 mediante el análisis de la fosforilación de varias proteínas adaptadoras y vías de señalización después de la inhibición FGFR2. Después de dos horas de tratamiento con una titulación de MK2461 y PD173074 se observó pérdida de fosforilación en las proteínas adaptadoras quinasa Gab1 /2, FRS1 /2, y SHC. También se observó pérdida de ERK y la fosforilación de AKT (Figura 3A). Curiosamente, objetivos de abajo de AKT y ERK como PRAS40 y S235 /236 en S6RP (y S9 en GSKIII, datos no mostrados) permanecieron fosforilada en este punto de tiempo 2 horas. A continuación anlayzed inhibición de Akt y ERK objetivos en puntos de tiempo posteriores después del tratamiento con 100 nM PD173074. También se examinaron varias otras vías para determinar si la cinética de inhibición retardados también se estaba produciendo. En contraste con el punto de tiempo 2 horas, tanto S6RP y la fosforilación PRAS40 se inhibieron fuertemente 12 horas después de la adición del compuesto (Figura 3B). También se encontró una inhibición del retraso similar de fosforilación de la serina-933 en p105 NFKB, lo que sugiere que la señalización de NFKB es parte de crecimiento NCI-H716 (Figura 3B). P50 NFKB y los niveles de proteína P105 se redujeron solamente en 72 horas. Mientras que la inhibición de 12 horas después del tratamiento puede resultar de un medio de vida extendida de las proteínas de señalización, la inhibición en puntos de tiempo posteriores tales como 72 horas puede ser secundario a la inhibición del crecimiento (y la muerte celular como se describe a continuación en la Figura 4). CRKII Y221, la AMPK T172, S241 y PDK1 fueron inhibidos solamente a las 48-72 horas post-tratamiento, una vez más lo que sugiere que la pérdida de estos sitios puede ser secundaria a la inhibición del crecimiento. CRKII, los niveles de proteína AMPK, y PDK no disminuyó durante el curso del tiempo (datos no presentados). Por último, otros sitios como GSKIII S9 (un sitio de fosforilación de AKT), PKC S660, S227 RSK (un sitio de fosforilación de PDK1) permanecieron fosforilada incluso después de 72 horas (Figura 3B). Este resultado revela que PDK1 permanece activa y capaz de fosforilar sitios diana a pesar de la inhibición del crecimiento celular. Aunque el sitio de fosforilación S227 PDK1 en RSK no fue inhibida, la ERK sitio de fosforilación de la serina-359 /363was inhibida dentro de 2 horas de tratamiento PD173074 (Figura S5 en Archivo S1). GSKSIII Serine-9 también se mantuvo fosforilada en puntos de tiempo posteriores, y puede ser posible que otras quinasas AKT, aparte de mantener la fosforilación en este sitio. Finalmente, debido a la inhibición de MEK impactado crecimiento NCI-H716, definimos aún más la red de señalización MEK usando 100 nM del inhibidor alostérico MEK PD0325901 [26]. Serina-933 en NFKB p105 y la serina-265 en FRA1 se describen como sitios de fosforilación de ERK y que confirmó la pérdida de estos sitios. Serina-235/236 en S6RP es también un objetivo de MEK en células NCI-H716 (Figura 3C). Llegamos a la conclusión de que la inhibición FGFR2 resultó en un patrón bifásico de la inhibición de la vía, con ERK y AKT inhibido en los puntos de tiempo tempranos, mientras que PRAS40, S6RP, y factores de transcripción tales como p105 NFKB mostró una inhibición retardada. Otras proteínas de señalización tales como PDK1 y PKC isoformas se mantuvieron fosforilada incluso en puntos de tiempo posteriores. Sin embargo es también posible que a pesar de la fosforilación de proteínas tales como las isoformas de PKC pueden estar inactivo debido a otros factores tales como mislocalization celular. En general, estos resultados advierten que el análisis de una red de señalización sólo a los primeros puntos de tiempo tras el tratamiento con inhibidor no puede definir completamente el rango de efectores de señalización.
A. Los lisados utiliza en la Fig. 2A se analizaron por transferencia de Western de las proteínas fosforiladas o totales después de un tratamiento de 2 horas con titulación compuesto indicado. "P" indica fosfoproteína, y los sitios de fosforilación se enumeran en los métodos. curso B. Tiempo de inhibición para múltiples proteínas de señalización. células NCI-H716 se trataron con 100 nM PD173074 durante los tiempos indicados y las vías de señalización se analizaron por SDS PAGE y Western Blot. 100 nM PD173074 fue seleccionado porque esta cantidad causada completa inhibición de pERK en el punto de tiempo de 2 horas. "P" indica fosfoproteína, y los sitios de fosforilación se enumeran en los métodos. Terminología en el lado derecho de los grupos de figuras proteínas de acuerdo con la hora a la que se produce la inhibición o la proteína pérdida. células NCI-H716 C. fueron tratadas con 100 nM PD0325901 durante el tiempo indicado. Los lisados se prepararon para SDS PAGE y Western Blot con los anticuerpos indicados. células NCI-H716 D. colocaron en placas a 4.000 células /pocillo se trataron 24 horas más tarde con 1 uM L-547 (Aktí), 100 nM PD0325901 (meki), 5 nM de rapamicina (rapamicina), 100 nM PD173074, o 1,5 uM MK2461, o las combinaciones indicada. Después de 5 días compuesto y los medios fueron retirados y reemplazados con el compuesto fresco y medios de comunicación. Después de un adicional de 5 días de crecimiento relativo de células (ensayo total 10 días) se determinó utilizando el reactivo Vialight.
A. Los lisados de la Figura 3B revelan aumentaron la escisión de PARP. Fosfo S6RP se incluye como referencia y GAPDH se utilizó como control de carga. B. perfil del ciclo celular de las células tratadas. 1 × 10exp6 células NCI-H716 se trataron con 100 nM PD173074, inhibidor de MEK (100 nM) o un inhibidor de MEK + AKT (L-547, 1 uM) o DMSO (sin tratar) fueron aislados en los puntos de tiempo indicados y se procesaron para yoduro de propidio tinción y el análisis FACS como se describe en Materiales y métodos. B. indica una representación tabular de los perfiles del ciclo celular como se determina por gating manual para G1, S, G2 /M y subG1 áreas. C es los perfiles del ciclo celular.
se requiere la inhibición combinada de AKT y ERK para inhibir completamente el crecimiento del NCI-H716
En las células NCI-H716 ERK, Akt y fosforilación S6RP requiere FGFR2 y a continuación utiliza inhibidores alostéricos selectivos de MEK, AKT, mTOR y definir el papel de estas vías en el crecimiento del NCI-H716. Aunque MEK PD0325901 inhibidor de disminución del crecimiento NCI-H716 con una IC50 de 60 +/- 14 nM, un curso de tiempo indica que las células NCI-H716 se mantuvieron en crecimiento progresivo (Figura 3D, línea turquesa). Se encontró que 1 uM inhibidor de AKT L-547 o 5 nM de rapamicina sola o en combinación sólo había menores efectos sobre el crecimiento a pesar de la fuerte inhibición de AKT y S6RP fosforilación (Figura S6 en Archivo S1). Por el contrario, una combinación de inhibidor de AKT y el inhibidor de MEK bloqueado crecimiento y causó una disminución del número de células similar a la inhibición de FGFR (Figura 3D). Por lo tanto, tanto AKT y ERK son efectores críticos de FGFR2 en células NCI-H716. Por el contrario, una combinación de la inhibición de MEK y rapamicina no fue superior a la inhibición de MEK solo. Esto es consistente con nuestros resultados bioquímicos (Figura 3C) que S6RP está aguas abajo de MEK en esta línea celular, por lo que la inhibición de ERK ya conduce a la inhibición de S6RP. Además, la falta de un fenotipo con rapamicina sugieren que múltiples efectores de ERK deben ser inhibidas en combinación para imitar la inhibición del crecimiento observada con el inhibidor de MEK.
La apoptosis es el mecanismo para la inhibición del crecimiento
el número de células de partida se reduce en las células tratadas con PD173074 y con la AKT y la combinación de inhibidor de MEK, lo que sugiere que estos inhibidores causado la muerte celular. PARP troceados, un marcador de la apoptosis, se indujo fuertemente después del tratamiento PD173074 (Figura 4A) y con MK2461 (no mostrado). La citometría de flujo y el contenido del ciclo celular reveló la detención del crecimiento después de 24 horas de tratamiento con inhibidores de FGFR o combinaciones de inhibidores de MEK /AKT como se ve en la pérdida de población de la fase S (Figura 4B, C) A las 48 horas y los puntos más tarde se siguió la detención del crecimiento por inducción destacada de una población subG1. De hecho, en 4 días post-tratamiento de la fracción subG1 representado media de la población celular. Por el contrario, la inhibición de MEK redujo células en la fase S a las 24 horas, pero ni las células de fase S eliminado en puntos de tiempo posteriores ni causó la muerte celular prominente similar (Figura 4B, C). Finalmente, las imágenes de las células NCI-H716 revela la fragmentación celular generalizada después de 72 horas de tratamiento con PD173074 o 1 uM MK2461, en consonancia con la muerte celular (Figura S7 en File S1). Estos resultados ponen de manifiesto que la supervivencia de las células NCI-H716 depende de FGFR2, y también apoyan la evidencia previa de que tanto la actividad de ERK AKT y son necesarios para la supervivencia.
FGFR2 se requiere para el crecimiento de xenoinjertos de tumores NCI-H716
potente sensibilidad NCI-H716 de FGFR inhibidores de
in vitro
sugieren que el crecimiento de xenoinjertos de tumores también podría ser inhibida
in vivo
. NCI-H716 se deriva de una ascitis, y en consonancia con la adaptación a este entorno, la línea celular prolifera sin ataduras en suspensión. Por lo tanto, hemos tratado de crear un modelo de ascitis usando luciferasa que expresan las células NCI-H716 se inyecta en la cavidad peritoneal. Sin embargo formación de imágenes de la luciferasa reveló una falta de expansión de las células tumorales (datos no mostrados). Por lo tanto, a prueba de inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto subcutáneo estándar. Debido PD173074 tiene pobres propiedades farmacocinéticas, que los ratones tratados con MK2461. Cuando los tumores alcanzaron 200 mm
3 de tamaño, MK2461 se dosificó una vez al día (QD) en cualquiera de 300 o 800 mg /kg. Durante el estudio de 21 días, el /tratamiento 800 mg kg causó inhibición completa del crecimiento del tumor, mientras que 300 mg /kg resultó en una inhibición parcial que no fue estadísticamente significativa (Figura 5A). Ni dosis resultó en la pérdida de peso corporal superior a 5% (datos no mostrados). Ambas dosis altas y bajas de MK2461 causados completa inhibición de FGFR2, ERK, y la fosforilación de AKT en los tumores de 2 horas después de la dosificación (Figura 5B). Sin embargo, a las 23 horas después de la dosificación, sólo la dosis de 800 mg /kg tuvo una inhibición significativa de FGFR2 y ERK fosforilación. La incapacidad de la dosis de 300 mg /kg para causar la inhibición de la señalización continua FGFR2 y ERK puede explicar la falta de eficacia asociado. Aunque 800 mg /kg causó la inhibición del crecimiento completo, no se observó PARP escindido
in vivo
, en contraste con
vitro
tratamiento con MK2461 (datos no mostrados). La falta de PARP escindido
in vivo
también es consistente con la ausencia de regresión en el modelo de xenoinjerto, y puede ser el resultado de una falta de una potente inhibición de la fosforilación de AKT. Por ejemplo, cuando sólo ERK se inhibió fuertemente
in vitro gratis (con MEK inhibidor PD0325901), hubo una disminución del crecimiento, pero no la muerte celular. Por lo tanto la falta de inhibición de AKT potente puede explicar por qué la regresión no se observó en el modelo de xenoinjerto. La razón de la falta de inhibición de AKT
in vivo
no está claro, pero potencialmente podría resultar de la activación de la vía compensatoria por factores de crecimiento endógenos murinos o citoquinas que no están presentes en los medios de cultivo de tejidos.
A. 5 × 10exp6 células NCI-H716 se implantaron por vía subcutánea en ratones Balb /c desnudos y tratados con MK2461 en cualquiera de 300 mg /kg o 800 mg /kg en un horario QD dosificación. crecimiento tumoral relativa se indica en el eje Y. B. ratones portadores de tumores se trataron con una dosis única de MK2461 en cualquiera de 300 mg /kg o 800 mg /kg. Los tumores fueron aislados a 4 o 24 horas después del tratamiento, y se colocan en nitrógeno líquido. Los tumores se procesaron utilizando el Lyzer tejido (Qiagen) como se describe en materiales y métodos y se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia Western con el fosfo indicado y anticuerpos totales.
sobreexpresión FGFR2, pero no se encuentra en la amplificación un subconjunto de cáncer de colon primario y metástasis en los ganglios linfáticos
Hemos definido la prevalencia de FGFR2 sobreexpresión y amplificación en el cáncer de colon primario mediante inmunohistoquímica (IHC) para la expresión FGFR2 y FISH para
FGFR2
amplificación. Debido a que hay precedente para selectivo
FGFR2
amplificación en una metástasis, pero no en el tumor primario también se analizaron las metástasis hepáticas 15 y 58 ganglios linfáticos junto con sus tumores primarios asociados. Debido a que los anticuerpos C-terminal anteriormente descritos no detectan las isoformas FGFR2 en células NCI-H716 por Western Blot o IHC (datos no mostrados), hemos optimizado tinción IHC con el anticuerpo H80 N-terminal. Se confirmó una fuerte reactividad IHC en el xenotrasplante de NCI-H716 y con un
FGFR2
tumor de cáncer gástrico amplificado (Figura 6).