Extracto
Uno de los factores más importantes en la elección de una estrategia de tratamiento para el cáncer es la caracterización de biomarcadores en las células cancerosas. En particular, los recientes avances en anticuerpos monoclonales (MAB) como fármacos primarios específicos dirigidos a los receptores tumorales muestran que su eficacia depende en gran medida de la caracterización de biomarcadores tumorales. La evaluación de su estado en los pacientes individuales facilitaría la selección de una estrategia de tratamiento óptima, así como el seguimiento continuo de los biomarcadores y su proceso de unión a la terapia podría proporcionar un medio para la evaluación temprana de la eficacia de la intervención terapéutica. En este estudio hemos demostrado por primera vez en los animales vivos que la vida de la fluorescencia se puede utilizar para detectar la unión de sondas ópticas específicas para los receptores extracelulares sobre las células tumorales
in vivo
. La razón fue que vida de la fluorescencia de una sonda específica es sensible a medio ambiente local y /o de afinidad a otras moléculas. Nos adjunta en el infrarrojo cercano (NIR) sondas fluorescentes a Human Factor de Crecimiento Epidérmico 2 (HER2 /neu) moléculas Affibody específicos de y utilizamos nuestro sistema óptico resuelta en el tiempo para comparar la vida de la fluorescencia de las sondas ópticas que se han unido y no unido a las células tumorales en ratones vivos. Nuestros resultados muestran que los cambios de vida de fluorescencia en nuestro modelo de sistema delinean receptor HER2 unida de la sonda no unida
in vivo
. Por lo tanto, este método es útil como marcador específico del proceso de unión al receptor, que puede abrir un nuevo paradigma en la "imagen y tratar" concepto, en especial para la evaluación temprana de la eficacia de la terapia
Cita.: Ardeshirpour Y, Chernomordik V, Zielinski R, Capala J, Griffiths G, Vasalatiy O, et al. (2012)
En Vivo
fluorescencia Monitores vida útil de imágenes de unión de sondas específicas del cáncer Biomarcadores. PLoS ONE 7 (2): e31881. doi: 10.1371 /journal.pone.0031881
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 16 Junio, 2011; Aceptado: January 19, 2012; Publicado: 23 de febrero, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación es apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver y por el Instituto Nacional del Cáncer , Centro de Imagen sonda Desarrollo, Instituto Nacional del corazón, pulmón y sangre, Institutos nacionales de Salud. Como YA, RF, VC, JC, GG, OV, AS, JK, IL, AG y MH son empleados de los Institutos Nacionales de la Salud; esta fuente de financiación desempeñó un papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito. Las otras fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Uno de los factores más importantes en la elección de una estrategia de tratamiento adecuado para el cáncer es la caracterización de biomarcadores en las células cancerosas, y esto puede ser un gran reto. En particular, los recientes avances en los anticuerpos monoclonales (MAB) como medicamentos de primarios específicos, dirigidos a receptores de tumores, muestran que su eficacia depende en gran medida de la sobreexpresión de receptores específicos.
Además, uno de los factores importantes que con frecuencia no se encuentra en el tratamiento del cáncer (principalmente utilizando MAB) es continua monitorización de la respuesta de los receptores del tumor a la terapia, especialmente en las primeras etapas, para cuantificar el proceso de unión, que es fundamental para la evaluación de la eficacia del fármaco.
estándar de corriente
ex vivo
métodos, por ejemplo, inmunohistoquímica (IHC), la amplificación del gen fluorescente demostrado por
hibridación In Situ
(FISH), y ligado a enzimas (ELISA), son invasivas y requieren biopsias de los pacientes. Inherentemente, biopsias tienen un riesgo de perder la lesión maligna y, durante el ciclo terapéutico, el número de veces que la biopsia se puede hacer se [1] limitada. Los métodos alternativos actualmente en estudio se basan en la farmacocinética de las sondas de radionucleidos en PET después de la inyección en la circulación sanguínea [2].
In vivo
de fluorescencia de imágenes es una técnica de imagen no invasiva alternativa, que puede utilizarse por separado o en contigüidad con otras modalidades de supervisión oportuna del biomarcador durante el curso del tratamiento. Este método es simple y portátil.
Los recientes avances en las sondas fluorescentes, la orientación biomarcadores específicos de la enfermedad, han abierto una nueva era en la
in vivo
fluorescencia de imágenes in. Ellos hacen que sea una herramienta prometedora para el diagnóstico médico [3] - [8]. En particular, el desarrollo de infrarrojo cercano (NIR) sondas fluorescentes ha mejorado significativamente la capacidad de formación de imágenes
in vivo
fluorescencia, debido a la baja autofluorescencia de fondo y la profunda penetración de la luz NIR en el tejido [9].
imágenes de fluorescencia se puede realizar en la forma de medir las distribuciones de intensidad de fluorescencia y /o el tiempo de vida de fluorescencia [10] - [18]. formación de imágenes de vida de fluorescencia se basa en la evaluación del tiempo medio que fluoróforo excitado electrónicamente permanece en el estado excitado antes de su transición a un estado fundamental, acompañado de la emisión de fotones. vida de la fluorescencia se puede medir mediante técnicas de dominio de tiempo o dominio de frecuencia [19] - [22]. En este estudio, hemos utilizado el primer método más preciso y se midió la descomposición transitoria exponencial de la intensidad de fluorescencia con el tiempo después de considerar el efecto de la respuesta de impulso del sistema. Se ha demostrado que la vida de la fluorescencia es independiente de la concentración de los fluoróforos y la intensidad de la luz de excitación. vida de la fluorescencia puede permanecer constante, incluso dentro de la fluctuación de cinco veces en la intensidad de la luz de excitación [23]. Por otro lado, puede ser sensible a medio ambiente local bioquímica, por ejemplo, temperatura y pH o interacciones moleculares [24], [25]. Esta propiedad hace que el tiempo de vida de fluorescencia imágenes de un candidato prometedor para la detección y seguimiento de cáncer de receptores específicos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Otra aplicación importante de esta técnica es investigar la eficacia de la respuesta al tratamiento en fase temprana mediante la supervisión de la unión de moléculas de fármaco a las células tumorales.
En este estudio, nos centramos en el Human Factor de Crecimiento Epidérmico 2 (HER2 /neu) receptor, que es uno de los biomarcadores importantes en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama y cáncer de ovario [26]. La sobreexpresión de este receptor se correlaciona con mal pronóstico y la resistencia a quimioterapias específicas [27]. Para optimizar el procedimiento de tratamiento, es importante para evaluar la expresión del receptor HER2 en el proceso de diagnóstico y para su seguimiento
in vivo
en el transcurso del tratamiento. Para evaluar el estado de este receptor, se aplicó un tinte fluorescente-HER2 específica Affibody conjugado de infrarrojo cercano (NIR).
Aunque varios estudios recientes han mostrado una mejoría en relación señal /ruido de
in vivo
imágenes de fluorescencia encerrando a los colorantes fluoróforos utilizando polímerosomas [28], nanotubos [29] o el uso de nanopartículas [30] como una alternativa para una sola fluoróforos molécula, Affibody-DyLight750 conjugado, investigado en el manuscrito, parece ser una sonda más adecuada para nuestro objetivo, es decir, la caracterización de los receptores HER2 sobreexpresión en tumores
in vivo
Affibody moléculas [31] - [34]. proteínas son muy estables. Son relativamente pequeño (8,3 kDa), cerca de 20 veces más pequeños que los anticuerpos. Al igual que cualquier otras moléculas pequeñas, que pueden acumularse en el tumor a través de los vasculatures tumorales con fugas. Su principal ventaja de diagnóstico es que se pueden hacer altamente específico a receptores de células de cáncer en particular, por ejemplo, HER2. Después de la unión a estos receptores, las sondas no unidas se lavan y ligandos fluorescentes principalmente ligados contribuyen a la señal de la zona del tumor en tiempos posteriores. Esto mejora significativamente el contraste del tumor, en comparación con el fondo.
En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que los cambios dinámicos en los niveles de intensidad de fluorescencia de las proteínas Affibody-HER2 específico, conjugado con un colorante fluorescente, CAN ser usado para cuantificar la expresión de HER2 en células tumorales [35] - [37]. farmacocinética relativamente rápidas del conjugado Affibody-DyLight750 acelera la recogida de datos y simplifica su análisis. El método, presentado en el manuscrito actual, aunque menos cuantitativa en la etapa actual en comparación con la farmacocinética de análisis, permite evaluar el estado de HER2 del tumor desde una única medida de tiempo resuelto. No requiere la repetición de mediciones de la fluorescencia del tumor después de la inyección de la sonda que implica tiempos mucho más largos de observación. enfoque propuesto puede ser utilizado para una evaluación preliminar de la expresión de HER2 en el tumor. Es de cortesía a la caracterización cuantitativa de los receptores HER2, basados en la farmacocinética.
Por otro lado, se ha demostrado en nuestros estudios anteriores [35] que el HER2 Affibody se une a un epítopo diferente del receptor de HER2 de el epítopo, blanco de los anticuerpos monoclonales usados ampliamente como el trastuzumab o pertuzumab. Esto permite el control de la expresión de HER2 durante la terapia sin interferencia con el efecto potencial de estos fármacos [35].
En este estudio, hemos investigado en animales vivos si la unión de la sonda fluorescente Affibody conjugado al receptor HER2 puede influencia de fluorescencia vida útil de la sonda. Para este propósito, el tiempo de vida de fluorescencia se estudió en tres casos diferentes:-HER2 específica Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) de la sonda fluorescente en modelos de tumores humanos con alta expresión de HER2, sonda fluorescente Affibody HER2-específica en una modelo de tumor humano con ninguna expresión de HER2, y HER2-no específica Affibody (Su
6-Z
Taq: GS-Cys) de la sonda fluorescente en modelos de tumores humanos con alta expresión de HER2, todo en el modelo de ratón
in
vivo. Los resultados revelan diferencias significativas en los tiempos de vida de fluorescencia entre el área del tumor y el sitio contralateral, cuando y sólo cuando, la unión de la sonda óptica a los receptores tumorales podría ocurrir. Por el contrario, no se observó ningún cambio en la vida de la fluorescencia en los casos en los que las sondas ópticas tienen ninguna afinidad a los receptores HER2.
Materiales y Métodos
Agente de contraste
se utilizaron estos experimentos, dos moléculas diferentes Affibody® (Affibody, Estocolmo, Suecia): HER2-específica Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) y HER2-inespecífica Affibody (Su
6-Z
Taq: GS-Cys), ambos conjugados con la sonda fluorescente Dylight750 (Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, Massachusetts). Dylight750 es lo suficientemente brillante como para ser utilizado para
in vivo
estudios sin ninguna modificación y puede ser fácilmente conjuga con los aficuerpos HER2 /específicas no específicos. La relación de conjugación de Dylight750 a la proteína Affibody es 01:01.
Se midió el tiempo de vida de la sonda Affibody en tampones químicos (con una composición de ácido cítrico, ácido bórico y fosfato de mono-sodio que van desde un pH de 4,5 a 9. No se observó ningún cambio significativo en la vida de la fluorescencia en toda la gama de pH (Fig. 1A). solución salina esterilizada se utilizó por 3 veces de dilución de la sonda Affibody antes de la inyección.
también se midió la vida de la fluorescencia de la sonda en tampón Affibody química con pH de 6,86 mediante el aumento de su concentración de BSA de 0% a 5% (albúmina de suero bovino, Fracción V, mínimo 96%, Sigma Co.). la vida útil de la sonda Affibody demostrado ser sensible a la presencia de las proteínas de BSA (Fig. 1 B). no hemos observado una disminución en la vida de la fluorescencia relativa a la sonda Affibody, que se utiliza para la inyección.
cultivo celular
en estudios con animales, tres modelos de xenoinjertos de tumores humanos que expresan diferentes niveles de HER2 se utilizaron en este estudio. BT-474 y NCI-N87 son líneas celulares de tumores humanos con un alto nivel de HER2 (HER2 /neu) expresión: 243 ± 24 ng /mg y 395 ± 41 ng /mg de proteína, respectivamente, mientras que MDA-MB-468 es una línea celular tumoral humana sin expresión de HER2. Las tres líneas celulares se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Para el estudio in vitro en, hemos utilizado ninguna línea celular SK-BR-3 con alto nivel de expresión de HER2 o línea celular de cáncer humano HER2 negativo MDA-MB-468. SK-BR-3 ha sido elegido entre HER2 positivo líneas celulares debido a su mejor fijación de la placa. Las células se cultivaron en RPMI (BT-474, NCI-N87), DMEM-F12 (SK-BR-3, MDA-MB-468) medios de cultivo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y Pen /Strep (10 000 U de penicilina, 10 mg de estreptomicina) a 37 ° C en 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Solución de tripsina al 0,05% y 0,02% EDTA se utiliza para las células desprendimiento.
in vitro
estudio
HER2 positivo SK-BR-3 y HER2 negativo MDA-MB se colocaron -468 células en portaobjetos con cámaras confocal 8-y se incubaron durante la noche. Después de 24 horas de incubación, se añadió Affibody-DyLight488-conjugado a los medios de células en 0,5 mg /ml de concentración. Después de 30 min de incubación adicional a 37 ° C, se añadieron 2 g /ml de Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA) a las células y se incubaron durante 1 hora más para los núcleos de tinción. Luego, las células se lavaron tres veces y la imagen en PBS por Zeiss LSM 510 microscopio confocal (más detalles del experimento se presentan en otras partes [en preparación]). Hemos utilizado marcador similar a Affibody-DyLight750-conjugado (Affibody-DyLight488), porque Zeiss LSM 510 microscopio confocal no funciona en las longitudes de onda del infrarrojo cercano.
Además, para confirmar la consistencia de los resultados obtenidos con Affibody- DyLight750-conjugado y evaluar la vida útil de la sonda Affibody
in vitro
, microcopy Flim de los cultivos celulares se realizó por una especialmente adaptada Olympus FV1000 invertida de escaneo láser de dos fotones microscopio [38] para la formación de imágenes a través de la no vía la detección descanned en el modo de un solo fotón. A pesar de que, estas modificaciones reducen la resolución de profundidad microscopio significativamente en comparación con la microscopía confocal, se permitió demostrar la unión de HER2-Affibody-DyLight750-conjugado a la membrana externa de las células HER2 positivos SK-BR-3 claramente
.
en pocas palabras, para obtener imágenes, una Olympus Fluoview 1000 galvo-espejo microscopio de barrido láser equipado con un sintonizable de banda ancha "Mai Tai DeepSee" láser de Ti-zafiro (por Newport Spectra-Physics) se utilizó. El láser se fijó a una longitud de onda de excitación de un solo fotón de 717 nm (para minimizar la dispersión por el espejo dicroico). atenuación sustancial de láser con una combinación de polarizador ortogonal calcita y un filtro de densidad neutral metálico se utiliza para evitar la saturación del detector y photobleaching muestra. De la muestra se monta en una fase invertida en una placa de 8 pocillos y se ilumina con un pase largo espejo dicroico 740 a 830 nm (FF741-DI01 por Semrock) por medio de una inmersión en agua 0,8 NA LUMPlanFl N 40 × objetivo de Olympus. Dos Newport Oriel 51350 de color de vidrio 780 filtros de paso largo por nm apilados se utilizaron en frente de un módulo PMT-aumento rápido refrigerado por Peltier sensible al rojo (Becker & amp; Hickl modelo PMC-100-20) para eliminar la dispersión, segunda generación de armónicos y las células autofluorescencia . Dado que el detector se monta en un orificio lateral no descanned sin ningún filtrado especial, efectivamente Z-resolución se redujo significativamente a favor de la eficiencia de recolección. Un fotodiodo de respuesta rápida de silicio (Becker & amp; Hickl modelo PHD-400-N-12) se utilizó para la sincronización láser. Fotones pruebas puntuables fueron discriminados, registrados y asignados a ubicaciones de píxel por Becker Y Tablero Hickl SPC-830 PCI. El análisis de datos se realizó con SPCImage ver. 3.2 del software por Becker & amp; Hickl. tiempos de acumulación de fotones típica variaron de 60 a 300 s empleando el modo de exploración bidireccional rápida para reducir aún más photobleaching. Tasa media de recuento se mantuvo muy por debajo de 2 MHz para evitar impulsos cacharro.
La función de respuesta del instrumento, generada a partir de cristales de urea triturados en aceite, se detectó como generación de segundo armónico (láser sintonizado a 820 nm) a través de un conjunto adecuado de los filtros dicroicos /emisión y medido como ps FWHM ~190 (en nuestro caso fue determinado por el tiempo de tránsito PMT propagación).
Preparación de los animales
en estudios con animales, se implantaron las células cancerosas cultivadas en la extremidad anterior derecha de ratones desnudos femeninos de xenoinjertos. Se inyectaron cinco millones de células en 0,1 ml de 50% de Matrigel en la extremidad anterior derecha. El estudio fue aprobado por los Institutos Nacionales de la Salud Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ID aprobación: ROB117). Después de que los tumores crecieron con el tamaño de 0,5-1 cm, los ratones se transfirieron a nuestras instalaciones de formación de imágenes. Antes de proyección de imagen, el ratón se anestesió por inhalación de isoflurano. El ratón se coloca en una etapa de temperatura controlada y dos conjuntos de imágenes de la región del tumor y el sitio contralateral se capturaron antes de la inyección. A continuación, 10 g de la Affibody conjugado con sonda fluorescente se inyectó a través de la vena de la cola. Las imágenes fueron capturadas continuamente cada 30 min durante los primeros 5 horas. El tejido tumoral se extrajo de los animales 24 horas después de la inyección-DyLight750 HER2-Affibody, se fijaron en 10% de formalina neutra rebabas (NBF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los tumores fueron teñidas para la expresión de HER2 (Herceptest, Daco) y el patrón de distribución Affibody.
Debe tenerse en cuenta que los compuestos Affibody-DyLight no inducen efectos tóxicos sobre las células del cáncer de mama, como se demostró por
in vitro
experimentos con cultivos celulares (detalles experimentales se presentarán en otro lugar [en preparación]). A fin de validar la baja toxicidad de la sonda
in vivo
, mantuvimos varios ratones inyectados con las dosis de hasta 0,5 mg /kg vivo hasta 1 mes después de la inyección del compuesto Affibody-DyLight750 sin observar ningún tipo de toxicidad efectos en el ratón.
in vivo
sistema de imágenes por vida
el
in vivo
sistema de visualización de la vida consistía en un pulso láser sintonizable con una ancho de pulso de 100 fs y frecuencia de repetición de 80 MHz. El láser fue sintonizado a una longitud de onda de excitación de 750 nm. Los pulsos de luz escaneados del objetivo (tumor o sitio contralateral) de un animal en un patrón de trama a través de una cabeza de exploración con fibras de fuente y el detector en 2 mm de distancia. El animal se colocó dentro de una cámara oscura en una etapa de exploración de temperatura controlada. La señal de fluorescencia reflejada se filtró por un filtro de emisión de paso largo de 780 nm. Los fotones detectados fueron capturados por un tubo fotomultiplicador (PMT) y los fotones se contaron mediante un contador de fotón único correlacionado con el tiempo (TCSPC). Inicialización, la exploración y la adquisición fueron controlados por el software LabVIEW. Los detalles del sistema de imagen se pueden encontrar en [15]. El tiempo de vida de fluorescencia se estima a partir de una curva de ajuste de los datos a una sola función de decaimiento exponencial, optimizado por reconvolution iterativo de solo descomposición exponencial con la función de respuesta de impulso del sistema. Truncamos la cola de los datos de intensidad de tiempo de resolverse debido a su mayor susceptibilidad a fotón variaciones trayectoria de transporte. En nuestros estudios preclínicos, ya que el tumor se encuentra en ratón extremidad anterior por vía subcutánea, la profundidad del tumor no tiene un efecto significativo sobre el tiempo de vida, sin embargo, para aplicaciones que se ocupan de los tumores profundamente incrustadas, el efecto de la difusión de fotones en el observado intensidades de fluorescencia de resolución deben tenerse en cuenta.
resultados
En vivo
Estudio
Para investigar el efecto de obligar a la Affibody-HER2 específica sonda fluorescente al tumor positivo para el receptor HER2 en vida de fluorescencia, se consideraron tres casos diferentes. En el primer caso, el HER2-específica Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) sonda óptica se inyectó en ratones con altos carcinomas tumorales humanos HER2-expresión. En el segundo caso, un Affibody HER2-no específica (Su
6-Z
Taq: GS-Cys) de la sonda fluorescente se inyectó en ratones con los mismos carcinomas tumorales humanos HER2 expresar como en el primer caso, y, en el tercer caso, el Affibody específica HER2 (His6-Z
HER2: GS-Cys). sonda fluorescente se inyectó en ratones con tumores HER2 no expresan
en el primer experimento, HER2-específica fue Affibody inyectada en cuatro ratones con un alto nivel (3) HER2-expresión de carcinoma de tumor humano, BT-474. Higo. 2 muestra los resultados de
in vivo
mediciones de intensidad de fluorescencia y la vida útil en el área del tumor y el sitio contralateral. Higo. 2C muestra la diferencia entre la intensidad de fluorescencia en el tumor (Fig. 2A) y los sitios contralaterales (Fig. 2B) 1 hora después de la inyección, asignadas en la zona del tumor. Higo. 2D muestra la dinámica de la intensidad máxima de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral durante 6 horas después de la inyección. El píxel con intensidad máxima se utilizó para caracterizar el tumor. El mapeo de fluorescencia en el sitio contralateral fue en promedio más de 16 píxeles ya que no había ningún punto específico de diana en el sitio contralateral. Con un promedio de más de 16 píxeles se ha utilizado para la reducción de ruido. Para demostrar las variaciones de la vida útil y la intensidad de fluorescencia a lo largo del área escaneada presentamos mapas de intensidad de fluorescencia y la vida útil en las regiones contralaterales y tumorales. Los datos mostrados en la Fig. 2D y Fig. 2H son los valores medios de las mediciones de más de 4 ratones (marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar). Higo. 2G muestra la diferencia entre el tiempo de vida de fluorescencia en el tumor (Fig. 2E) y los sitios contralaterales (Fig. 2F) 1 hora después de la inyección, asignadas en la región del tumor. El tiempo de vida de fluorescencia en el área del tumor y el sitio contralateral durante más de 6 horas después de la inyección se muestra en la Fig. 2H. En las Figs. 2H, los datos, correspondientes al píxel con intensidad máxima se utilizaron para los cálculos de toda la vida, ya que tenía la señal más alta a ruido.
(A) Fluorescencia mapa de intensidad en la región del tumor. mapa de intensidad (B) de la fluorescencia en el sitio contralateral (C) La diferencia de intensidad de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral, asignada en la región del tumor. (D) Farmacocinética de la intensidad de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. La intensidad de fluorescencia se promedió más de 16 píxeles en el sitio contralateral. Los datos en las Figs. (D) y (H) son los datos promedio de cuatro ratones. Los marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar. (E) mapa de vida de fluorescencia en la región del tumor. mapas de por vida (F) de la fluorescencia en el sitio contralateral. (G) La diferencia de vida de la fluorescencia en el tumor y el sitio contralateral asignada en la región del tumor. (E) Farmacocinética de la vida útil fluorescente en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. Todos los mapas de toda la vida y de intensidad de fluorescencia en las cifras de 2,4-7 son a partir de mediciones en 1 hora después de la inyección de la sonda Affibody. En todas las mediciones, los fotones se contaron más de dos segundos el tiempo de integración,
t
0
. Para excluir efecto de saturación de la cámara de 16 bits, en los píxeles más brillantes, en los que se alcanzó el límite correspondiente de 65.536 conteos antes de la hora
t
0
, hemos renormalizado los datos multiplicando recuentos de fotones, medida por menor tiempo de integración
t
, por el factor
t
0 /t.
En todos los experimentos, los datos fueron capturados a partir de los sitios de tumor y contralateral en el mismo intervalo de tiempo que el primer experimento. Para los mapas de intensidad de fluorescencia y de por vida, elegimos los datos de medición a 1 hora después de la inyección, lo que corresponde a un caso, cuando estaban disponibles en ambos sitios y contralateral tumorales considerable cantidad de colorantes fluorescentes.
A modo de ejemplo, el curvas de ajuste obtenidos por software SPCImage, (ver 3.2, Becker & amp;. Hickl GmbH) se muestran en la Fig. 3 para las mediciones tanto en el tumor (Fig. 3A) y sitios contralateral (Fig. 3B). Estos datos son mediciones, realizado 1 hora después de la inyección del Affibody-HER2 específico, conjugado con DyLight750, en el ratón con xenoinjerto de carcinoma de tumor humano (BT-474). Esta línea celular se sabe que tiene una alta expresión de HER2. Azul y gráficos verdes muestran los datos de medición y la función de respuesta de impulso del sistema, respectivamente. El ajuste se basó en un solo modelo de decaimiento exponencial. A1 parámetro muestra la relación de la amplitud de la señal utilizada en el único modelo de decaimiento exponencial y t1 es el tiempo de vida (en picosegundos). El pequeño gráfico en la parte inferior es el error de ajuste y la línea roja se presenta la curva ajustada.
eje X es la amplitud y el eje y es el tiempo de medición (ns). Azul y gráficos verdes muestran los datos de medición y la función de respuesta de impulso del sistema, respectivamente. El ajuste se basó en un solo modelo de decaimiento exponencial. A1 parámetro muestra la relación de la amplitud en el único modelo de decaimiento exponencial y t1 es el tiempo de vida (en picosegundos). El pequeño gráfico en la parte inferior es el error de ajuste y la línea roja muestra la curva ajustada.
En el segundo experimento, hemos utilizado tres ratones con la misma carcinoma positivo HER2 (BT-474). Contrariamente al experimento anterior, un Affibody HER2-no específica (Su
6-Z
Taq: GS-Cys) de la sonda óptica se utiliza como un agente de contraste. Los resultados se muestran en la fig. 4. Debido a la falta de especificidad de Z
Taq Affibody a los receptores de HER2, no se observó unión de la sonda /acumulación en tumores HER2 positivos en este experimento.
(A) Fluorescencia mapa de intensidad en la región del tumor. mapa de intensidad (B) de la fluorescencia en el sitio contralateral (C) La diferencia de intensidad de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral, asignada en la región del tumor. (D) Farmacocinética de la intensidad de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. Los datos en las Figs. (D) y (H) son los datos promedio de tres ratones. Los marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar. (ERPAR; mapa de fluorescencia toda la vida en la región del tumor (F) mapa de fluorescencia de por vida en el sitio contralateral (G) La diferencia de tiempo de vida de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral asignada en la región del tumor (E) Farmacocinética de la... tiempo de vida de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo.
en el tercer experimento, se utilizaron tres ratones con el modelo HER2-negativo (MDA-MB-468) para el estudio. de nuevo la-HER2 específica Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) de la sonda óptica se utiliza como un agente de contraste fluorescente en este modelo específico de tumor humano, debido a la falta de los receptores de HER2 en el área del tumor, HER2 Affibody. no se unió a las células tumorales. la intensidad en ambos tumor y el sitio contralateral disminuyó significativamente en 2-3 horas después de la inyección (Fig. 5D). el tiempo de vida de fluorescencia se observó también que ser el mismo en los sitios tanto de tumores y contralateral (Fig. 5H).
mapa
(a) la intensidad de fluorescencia en la región del tumor. (B) fluorescencia mapa de intensidad en el sitio contralateral. (C) La diferencia de intensidad de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral, asignada en la región del tumor. (D) Farmacocinética de la intensidad de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. Los datos en las Figs. (D) y (H) son los datos promedio de tres ratones. Los marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar. (E) mapa de vida de fluorescencia en la región del tumor. mapas de por vida (F) de la fluorescencia en el sitio contralateral. (G) La diferencia de tiempo de vida fluorescente en el tumor y el sitio contralateral asignada en la región del tumor. (E) La farmacocinética del tiempo de vida de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo.
Las mismas pruebas se repiten para el modelo de tumor NCI-N87. También se sabe que las células NCI-N87 a tener un alto nivel de expresión de HER2 [26]. La intensidad de la fluorescencia y la vida útil se midieron
in vivo
después de la inyección de la sonda fluorescente, ya sea basada en HER2-específica Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) o HER2-inespecífica Affibody (His6-Z
Taq: GS-Cys). Los resultados se muestran en la fig. 6 y Fig. 7, respectivamente
(A) Fluorescencia mapa de intensidad en la región del tumor.. mapa de intensidad (B) de la fluorescencia en el sitio contralateral. (C) La diferencia de intensidad de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral, asignada en la región del tumor. (D) Farmacocinética de la intensidad de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. Los datos en las Figs. (D) y (H) son los datos promedio de tres ratones. Los marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar. (E) mapa de vida de fluorescencia en la región del tumor. mapas de por vida (F) de la fluorescencia en el sitio contralateral. (G) La diferencia de tiempo de vida fluorescente en el tumor y el sitio contralateral asignada en la región del tumor. (E) La farmacocinética del tiempo de vida de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo.
(A) Fluorescencia mapa de intensidad en la región del tumor. mapa de intensidad (B) de la fluorescencia en el sitio contralateral (C) La diferencia de intensidad de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral, asignada en la región del tumor. (D) Farmacocinética de la intensidad de fluorescencia en la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo. Los datos en las Figs. (D) y (H) son los datos promedio de tres ratones. Los marcadores muestran la media y las barras muestran la desviación estándar. (E) mapa de vida de fluorescencia en la región del tumor. mapas de por vida (F) de la fluorescencia en el sitio contralateral. (G) La diferencia de tiempo de vida fluorescente en el tumor y el sitio contralateral asignada en la región del tumor. (E) La farmacocinética del tiempo de vida de fluorescencia a la región del tumor y el sitio contralateral después de la inyección en el tiempo.
Antes de la inyección, el tiempo de vida de fluorescencia de Dylight750, conjugado con Affibody HER2-específica (His6-Z
HER2: GS-Cys), se midió como 0,71 ns. Sin embargo, la vida útil de Dylight750 conjugado con HER2-no específica Affibody (His6-Z
Taq: GS-Cys) se midió como 0,62 ns. Esta diferencia entre el tiempo de vida de HER2-específica y no específica fueron consistencia en nuestras mediciones in vivo en el sitio contralateral.
Para evaluar la contribución potencial de la autofluorescencia en las intensidades de fluorescencia medida, hemos medido la señal antes de la inyección de la sonda tanto en el tumor y los sitios contralaterales. Figs. 8A-8B mapa muestran la intensidad de los 16 píxeles a la región del tumor y el sitio contralateral antes de la inyección de la sonda Affibody.