Extracto
Aplicaciones
Para determinar si el interrogatorio nano-arquitectónico de la carcinogénesis de próstata campo se puede utilizar para predecir el pronóstico en pacientes con estadio temprano (Gleason 6) cáncer de próstata (CaP), que es en su mayoría indolente, pero con frecuencia tratados innecesariamente.
Materiales y Métodos
anteriormente desarrolló microscopía espectroscópico ondas parciales ( PWS) que permite la cuantificación de la arquitectura intracelular nanoescala (escala de longitud 20-200nm) con una precisión notable. Se adaptó esta técnica para evaluar la próstata biopsias por punción con aguja en un estudio de control de casos de hombres con enfermedad de Gleason 6 que, o bien progresaron (n = 20) o permanecieron inactivos (n = 18) durante un ~ 3 años de seguimiento. Se midió la fuerza trastorno parámetro (Ld) caracterizar la heterogeneidad espacial de la estructura celular nanoescala y la morfología nuclear de las células epiteliales ~ 150 histológicamente normales microscópicamente normales de la mucosa.
Resultados
Se ha producido una profunda aumentar en el trastorno de nano-arquitectónica entre progresores y no progresores. De hecho, la Ld de futuros progresores se incrementó drásticamente en comparación con futuros no progresores (1 ± 0.065 frente a 1,30 ± 0,0614, respectivamente, p = 0,002). El área bajo la curva característica operador receptor (AUC) fue de 0,79, proporcionando una sensibilidad del 88% y especificidad del 72% para discriminar entre progresores y no progresores. Esto no está confundida por factores demográficos (edad, el tabaquismo, la raza, la obesidad), apoyando así la solidez del enfoque.
Conclusiones
Se demuestra, por primera vez, que las nano alteraciones arquitectónicas se producen en la carcinogénesis de campo del cáncer de próstata y pueden ser explotadas para predecir el pronóstico de CaP etapa temprana. Este enfoque es muy prometedor para abordar el dilema clínico del disgusto de la gestión de Gleason 6 CaP y puede proporcionar un paradigma para hacer frente a la cuestión más amplia de sobrediagnóstico del cáncer
Visto:. Roy HK, Brendler CB, Subramanian H, Zhang D , Maneval C, Chandler J, et al. (2015) Nanocytological campo de detección de carcinogénesis para mitigar sobrediagnóstico de cáncer de próstata: estudio de prueba de concepto. PLoS ONE 10 (2): e0115999. doi: 10.1371 /journal.pone.0115999
Editor Académico: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: 7 de noviembre de 2014; Aceptado: 21 Noviembre 2014; Publicado: 23 Febrero 2015
Copyright: © 2015 Roy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. el trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud U01CA111257 HR, VB, http://nih.gov/; Institutos Nacionales de Salud R01CA156186, HR, VB, http://nih.gov/; Institutos Nacionales de Salud R01CA165309, HR, VB, http://nih.gov/; Institutos Nacionales de Salud R01CA128641, HR, VB, http://nih.gov/; Institutos Nacionales de Salud R01CA155284, HR, VB, http://nih.gov/; Institutos Nacionales de Salud R42CA168055, HR, VB, http://nih.gov/; y John y Carol Walter Centro de Urología de la Salud, CB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dres. Roy, Subramanian y Backman son co-fundadores de Nanocytomics LLC y gestionado por el conflicto de intereses de los comités de la Universidad de Boston y la Universidad de Northwestern. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El sobrediagnóstico es un elemento de disuasión emergente hacia la implementación de la población cribado del cáncer [1]. La detección de la enfermedad indolente /clínicamente insignificante con frecuencia desencadena un sinfín de daños de las intervenciones diagnósticas /terapéuticas innecesarias incluyendo los costos, molestias y complicaciones [2]. El cáncer de próstata (CaP) resume este dilema en que se traduce en ~ 30.000 muertes en los estadounidenses, pero ~ 60% de todos los hombres & gt; 80 años de edad por cierto albergan este tipo de cáncer [3]. El uso generalizado de antígeno prostático específico (PSA) para la detección de CaP ha acentuado la detección de los cánceres clínicamente indolentes. Dado que los daños del tratamiento de las primeras etapas (T1c /T2a), de bajo grado (6 Gleason) enfermedad (la presentación más común CaP) generalmente mayores que los beneficios, muchas sociedades clínicos ahora recomiendan la cirugía retrasar a favor de la vigilancia activa, lo que implica una estrecha monitoreo con biopsias de próstata en serie [4]. Desafortunadamente, dado los caprichos de la predicción del comportamiento del CP de un individuo (con la posible progresión a la enfermedad fatal), sólo aproximadamente el 10% de los hombres elegibles en realidad se someten a vigilancia activa [5]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente mejores herramientas de pronóstico para que esta estrategia sea más aceptable para los pacientes y sus médicos [6].
Un nuevo enfoque para la evaluación de riesgos es a través de la explotación de la carcinogénesis de campo. carcinogénesis Field (aka cancerización de campo, de efecto de campo etiológico, campo de la lesión, etc.) es un fenómeno bien establecido en la biología del cáncer que una lesión neoplásica focal se desarrolla en un ambiente mutacional permisiva de las interacciones entre sustrato genética y factores exógenos (dieta, la obesidad , tabaquismo, diabetes, etc.) [7-9]. Estos cambios pueden ocurrir en el epitelio y /o estroma [10]. Desde una perspectiva clínica, cancerización de campo con las lesiones sincrónicas /metacronos asociados es ampliamente utilizado para el tratamiento de la neoplasia de colon, pulmón, cabeza y cuello, etc. Aunque menos bien explorada en la próstata, existe evidencia convincente de la carcinogénesis de campo tales como multi focalidad y alteraciones de los marcadores moleculares (por ejemplo, la expresión de genes de metilación, microARN, el pescado, las alteraciones mitocondriales) observados en el epitelio microscópicamente normales en pacientes que tienen este tipo de cáncer. [11-15]
Nuestro grupo ha desarrollado una nueva tecnología de óptica, microscopía parcial espectroscópico de onda (PWS), o nanocytology, lo que permite la cuantificación de la estructura celular en las escalas de longitud nanométrica. [16] Se han utilizado los SMP nanocytology para la detección de las consecuencias nano-arquitectónica de las alteraciones genéticas difusas /epigenéticos que son el sello de la carcinogénesis de campo. Hemos demostrado previamente que el SPW interrogatorio de epitelio normal predijo con precisión el riesgo de cáncer de colon [17] de pulmón [18], el esófago [19], páncreas [20] y el cáncer de ovario [21]. Para adaptar este avance biofotónico de CaP, quisimos apuntar a la cuestión más inquietante, la gestión de la fase inicial (Gleason 6 enfermedad). Dado que este suele ser diagnosticada mediante biopsia con aguja, la hipótesis de que nanocytological interrogatorio del epitelio prostático microscópicamente normales podría predecir el pronóstico en los hombres con la suficiente antelación (Gleason 6) sometidos a vigilancia activa de la enfermedad.
Materiales y Métodos
los pacientes
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad NorthShore HealthSystem. Las muestras se obtuvieron a partir del ensayo de vigilancia activa Universidad NorthShore iniciada en noviembre de 2008. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes. Los criterios de inclusión para la cohorte de pacientes incluyen: 1) ≥60 años de edad; 2) ≤T2a estadio clínico; 3) la puntuación de Gleason (grado) & lt; 7; 4) ≤ 3/12 cilindros positivos en la biopsia inicial; y 5) & lt; 50% participación lineal de cualquier núcleo único. Los pacientes fueron sometidos a una primera biopsia en la vigilancia de 6-12 meses después de la inscripción. La progresión se define como cualquier cambio de criterio 3, 4 o 5. Treinta y ocho pacientes fueron seleccionados al azar de la base de datos de los pacientes adjudicadas como progresores y no progresores por el estudio principal urólogo (CBB).
Compras de la Muestra Preparación y
biopsias transrectal se obtuvieron en tres dimensiones (3-D) la guía del ultrasonido. Cuatro de estos núcleos fueron designados como la investigación basada y se fijaron en un fijador a base de alcohol y embebido en parafina. Cuatro secciones micrométricas se cortaron en portaobjetos de vidrio cargadas y deparaffinized de PWS. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) Las secciones fueron examinadas por el estudio forense (MP) para dirigir el análisis de los SMP hacia el tejido no maligno
Descripción general de los SMP
En resumen, como se ha descrito anteriormente,. PWS fuerza trastorno marcador (Ld) es proporcional a la media y la desviación estándar de las variaciones espaciales de la densidad macromolecular de los bloques de construcción fundamentales celulares (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos). Por lo tanto, Ld, coloquialmente, se puede describir como la medición de la "agrupamiento" de la estructura a nanoescala. Hemos demostrado que el SPW es sensible a las estructuras de 20-200 nm a través del análisis espectral de los espectros de interferencia de la luz reflejada por las variaciones del índice de refracción intracelulares dentro volumen de coherencia espacio-temporal microscópica, en contraposición con el típico microscopía de luz cuya resolución se limita 200- 500 nm, el límite de difracción de la luz. Por lo tanto, la histología es insensible a muchas estructuras se sabe están involucrados en la carcinogénesis temprana (complejos macromoleculares, ribosomas, mitocondrias, de orden superior de la cromatina, etc.) que pueden ser PWS detectable. Anteriormente, hemos demostrado que PWS fue capaz de predecir el riesgo de cáncer de colon, pulmón, esófago, páncreas y cáncer de ovario [22].
PWS Adquisición de Datos y Análisis
análisis
PWS se realizó como antes descrito. Las regiones de interés fueron identificados (ganglios histológicamente normales) por el patólogo y se calculan más de ~ 30 regiones por diapositiva pacientes examinados (~ píxeles 50K-75K o ~ 150 células). El operador no tiene información clínica para cualquiera de las 38 muestras. Sin embargo, la información clínica estaba disponible para los investigadores tecnológicos en los primeros 18 ( "cegado"), pero no los últimos 20 ( "ciego") las muestras se llevó a cabo en los primeros 18 pacientes, pero no el último 20.
Estadística métodos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS 9.3 (SAS Inc, Cary, NC). Demografía de los pacientes fueron comparados entre los progresores y no progresores utilizando la prueba t (para las variables continuas) y la prueba de Chi-cuadrado. Una cola de dos t-test estándar (suponiendo varianzas desiguales) y el análisis de covarianza (ANCOVA) se realizaron para comparar la LD entre progresores y no progresores con un valor de p ≤0.05 considerado estadísticamente significativo. El tamaño del efecto se calculó utilizando de Cohen
d
: donde
μ
1 y
μ
2 son los medios para progresores y no progresores y
σ
1 y
σ
2 son las desviaciones estándar correspondientes, respectivamente. El estudio estadístico (CHW) operador receptor también realizado curva característica (ROC) para evaluar la sensibilidad y especificidad de los SMP en la diferenciación de los progresores y no progresores de CaP en la vigilancia activa.
Resultados
Cohorte
se incluyó dos grupos de pacientes, una primera cohorte de 18 pacientes (8 no progresores y 10 progresores) donde el operador PWS desconocía la situación clínica, pero, seguidos de un grupo distinto de 20 pacientes (10 progresores y 10 no progresores) en el que nuestro análisis de SMP se llevó a cabo por los investigadores cegados al grupo. Los factores demográficos se enumeran en la Fig. 1. La mediana de seguimiento fue de 34,2 meses, la edad promedio fue de 66,5 ± 5,6 años y la media de IMC 28,1 ± 4,0. No hubo diferencias significativas en las características basales de los pacientes entre los progresores y no progresores.
Análisis PWS de secciones de tejido de la próstata
SPW se llevó a cabo en las glándulas normales histológicamente identificados por nuestro patólogo. Como puede observarse a partir de imágenes de campo claro, nos centramos principalmente el epitelio adyacente a las glándulas de la región de interés definida. Si bien no hubo una diferencia aparente en el campo claro, hubo un profundo aumento de Ld (más rojo en el mapa pseudocolor) en progresores frente a los no progresores (Fig. 2).
Las imágenes de campo claro de la no progresores (a) y progresores (b) son indistinguibles de las biopsias iniciales de vigilancia. Sin embargo, las imágenes de los SMP en los progresores muestran marcadamente superior Ld (por ejemplo, las zonas rojas) en comparación con los no progresores, lo que indica anomalías nano-arquitectura profundas en el epitelio de próstata patológicamente normal. La mediana de seguimiento fue de 34,2 meses.
Ld medio por paciente en comparación con los no progresores Progressors
Se calcularon la media Ld de la región de interés por paciente. Elevada Ld ha sido una característica de la transformación neoplásica en un número de órganos [20]. El tamaño del efecto d de Cohen de Ld celular media en este estudio de casos y controles fue de 110% (Fig. 3), con una diferencia significativa entre los progresores y no progresores (p = 0,002). Se analizó la mitad del conjunto de datos de una manera ciega y señaló que la AUC fue equivalente a muestras no ciegos (0,81 frente a 0,75, respectivamente), el apoyo a la robustez de la metodología. El conjunto de datos combinados produjo una sensibilidad de 88% y especificidad del 72%, (Fig. 4), mientras que el conjunto de datos cegado sola (n = 20) ad una sensibilidad del 100% y una especificidad del 70%. Estos diagnósticos fuertes representan las características de rendimiento mínimo, con las futuras mejoras (por ejemplo, el ensayo separado citoplasmática frente Ld nuclear y epiteliales del estroma frente Ld) con la promesa de mejorar la capacidad discriminatoria.
La mediana de seguimiento fue de 34,2 meses.
Esto se tradujo en una sensibilidad = 88% y una especificidad = 72% para discriminar entre progresores y no progresores.
posibles factores de confusión
Dado que los factores clínicos (por ejemplo, la edad, la raza [23,24], índice de masa corporal [25], y el tabaquismo [26]) puede modular la agresividad del CaP, se realizaron análisis de covarianza (ANCOVA) que comparan LD entre progresores y no progresores mientras que el control de estos factores de confusión potenciales. Algo sorprendente (basado en la literatura anterior) [27], el antígeno prostático específico en suero se observó a ser más elevada en progresores que no progresores, aunque el análisis estadístico demostró que esto no afecta a la capacidad diagnóstica de Ld.
Discusión
la necesidad clínica para diferenciar agresivo desde indolente CaP es clara, ya que se estima que 233.000 hombres estadounidenses son diagnosticados anualmente con CaP, pero sólo 29.480 se proyectan a morir (siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en los varones) [28] . Mientras que la prueba de PSA ha sido ampliamente practicado, los daños asociados con el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad clínicamente indolente han llevado a la fuerza preventiva de Tareas de Servicios de Estados Unidos para recomendar recientemente en contra de la prueba de PSA [29].
La cuestión de exceso de diagnóstico presenta ahora un impedimento importante para la detección del cáncer en otros tipos de cáncer, incluyendo la mamografía para el cáncer de mama y la exploración de dosis bajas de tomografía computarizada (DCT local) para el cáncer de pulmón [1]. En efecto, mientras que LDCT dio lugar a una reducción del 20% en las muertes por cáncer de pulmón en una población de alto riesgo, & gt; 95% de positivos eran falsos positivos [30]. Es importante destacar que la detección de campos carcinogénesis nanocytological ha demostrado ser útil en la detección de una variedad de cánceres que la carcinogénesis campo manifiesto (colon, pulmón, esófago, páncreas, ovario, etc.) [19-22,31]. Uno de los principales aspectos novedosos de este estudio es que es el primero en no simplemente evaluar la presencia /ausencia de tumor (screening), sino más bien el pronóstico. Esto ha sido fomentada por nuestra capacidad para superar las dificultades técnicas y de hecho realizar PWS nanocytology en secciones de tejido intacto (los estudios se informó anteriormente eran todos de cepillados citológicos). Por lo tanto, PWS nanocytology representa una plataforma tecnológica que es aplicable a la detección /el pronóstico de un gran número de tumores malignos.
Nuestro enfoque de explotación de la carcinogénesis de campo es particularmente propósito de CaP dada su naturaleza multifocal. De hecho, la puntuación de Gleason se calcula mediante la evaluación del grado del clon más común y al lado más común (o el más agresivo). Si bien la evaluación de clones individuales del tumor (por ejemplo 3-gen inmunohistoquímica firma) se puede correlacionar con la historia natural de algunos CaP [32], dada la heterogeneidad clonal de más PCa y la naturaleza semi-cuantitativa de estas pruebas, que pueden tener utilidad clínica limitada. Intuitivamente, la carcinogénesis de campo dentro de ensayar las muestras de próstata con o sin CaP es potencialmente más atractiva que se centra en las firmas genéticas obtenidas a partir de muestras que contienen sólo el CP, ya que actualmente ofrecido por pruebas como Oncotype Dx, Prolaris, Decipher etc [33]. Ha habido numerosos otros marcadores de efecto de campo (metilación, micro ARN, la expresión de genes) con capacidad de pronóstico putativo, si bien el rendimiento hasta la fecha ha sido modesto [13,33,34]. La evaluación de nano-arquitectura es particularmente poderoso, ya que refleja el denominador común final más allá de la convergencia de las vías moleculares dispares. Mientras que otras modalidades (microscopía electrónica de transmisión [35] o Cariometría [36] han observado anomalías, su utilización como herramientas clínicas no son factibles. La capacidad para destilar la información PWS en un solo biomarcador (Ld) tiene un atractivo considerable, tanto desde el punto de vista práctico y robustez . por otra parte, PWS cuantifica la nano-arquitectura de compartimentos específicos, así como en toda la célula
Nuestro trabajo previo sobre la carcinogénesis de campo nanocytological ha sido evaluar la presencia de neoplasia;. por lo tanto, este informe representa una importante nueva solicitud de este enfoque, es decir, el pronóstico. Intuitivamente, parece lógico pensar que los perfiles de campo de la carcinogénesis puede ser más prometedor que se centra en el tumor por sí solo debido a la multi-clonalidad que es el sello del cáncer de próstata. de hecho, la puntuación de Gleason se basa en el grado de los más comunes y, a continuación, ya sea la siguiente más común o más agresivo clon. Por lo tanto, sería claro que clonar para analizar o cómo sintetizar los datos de expresión de genes de una variedad de clones. Nuestro trabajo es paralelo a algunos de los datos con el cáncer de hígado (otra enfermedad multifocal con frecuencia) que los perfiles de los hepatocitos no involucrados en el hígado recurrencia después de la resección predichos. [37]
Biológicamente, el aumento de trastorno de nano-arquitectura celular está íntimamente relacionada con los eventos moleculares. Desde un punto de vista físico, un aumento del Ld implica "agrupamiento" en las escalas de longitud de 20-200 nm. Estas escalas de longitud abarcan estructuras que van desde complejos macromoleculares a pequeños orgánulos. En el núcleo, la fuerza trastorno (LD) es una medida de la organización de la cromatina de orden superior, lo que repercute sobre múltiples procesos que controlan la expresión génica. ,, En mantener esta presente, nos han demostrado que Ld nuclear se correlaciona con la actividad transcripcional [38]. En la carcinogénesis campo está bien establecido que la expresión de genes se altera [37,39]. Además, diversas alteraciones de genes han demostrado ser alterado en la carcinogénesis de próstata campo. Sin embargo, dada la heterogeneidad genética en los tumores, la búsqueda de la matriz gen exacto es difícil. Dado que parece que nano-arquitectura puede ser un "denominador común final" a la miríada de alteraciones genéticas /epigenético en la carcinogénesis temprana, que debería ser particularmente potente. [20] En el citoplasma, los determinantes son más variados, pero un tema general es la organización del citoesqueleto [40]. Numerosas proteínas del citoesqueleto (por ejemplo, el músculo liso actina gamma) se ha demostrado que están alteradas en el epitelio prostático, más el apoyo a la relevancia de CaP [41].
Hay muchos puntos fuertes de este estudio, incluyendo su carácter innovador y el pozo : caracterizada, seguido prospectivamente cohorte de hombres sometidos a vigilancia activa. La novedad clínica incluye el uso de la carcinogénesis de campo para predecir la historia natural de CaP etapa temprana. Desde un punto de vista biológico, esto proporciona pistas importantes sobre las anomalías nano-arquitectura en la carcinogénesis temprana. Tecnológicamente, este estudio no sólo se utiliza para evaluar el pronóstico de SMP, en lugar de sólo la presencia de tumor, sino que también superó el reto de llevar a cabo nanocytology en secciones de tejido enteros.
Las debilidades que deben ser reconocidos incluyen el tamaño modesto y cohorte Seguir. Por otra parte, este estudio representa el estándar de oro con las muestras recogidas de una manera como sondas, (muestras recogen de forma prospectiva y la última mitad del conjunto de datos cegado; dado que incluso en el conjunto de datos sin cegamiento del investigador responsable de la adquisición de datos no estaba al tanto de la clínica estado, no hay posibilidad de sesgo). Otro punto débil potencial de este estudio fue la falta de criterios de valoración clínicamente inequívocos, por ejemplo, metástasis o muerte por CaP. Ambos de estos criterios de valoración, sin embargo, requeriría por lo menos 10 años de seguimiento, y que resulte inviable. Por otra parte, nuestra definición de progresión (aumento de Gleason o aumentar el volumen de cáncer) está bien validada y ampliamente utilizado en la práctica clínica.
En conclusión, hemos demostrado que hay profundas alteraciones nano-arquitectura en la carcinogénesis de campo del cáncer de próstata. La evaluación de este a través de SMP nanocytology puede representar un potente biomarcador para predecir la progresión de los hombres con CaP etapa temprana. Este enfoque puede realizar cribado de la población CaP más viable mediante la mitigación de los daños asociados con la identificación de la enfermedad indolente. Por otra parte, este estudio de prueba de principio sugiere que los SMP nanocytology puede potencialmente tener un papel en el arsenal clínica contra el enigma de cribado diagnóstico excesivo para una serie de tumores malignos.
Reconocimientos
Los autores agradecen a la Sra Bet Parker por su excelente apoyo en la preparación manuscrito.