Extracto
Antecedentes
La matriz extracelular (ECM) remodelación está predominantemente mediada por fibroblastos utilizando intracelulares y extracelulares vías. Aunque es bien conocido que la degradación extracelular de la ECM por proteasas derivadas de células de cáncer facilita la invasión celular, la degradación intracelular de los componentes de ECM por las células cancerosas no se ha aclarado. El objetivo de este estudio fue caracterizar la internalización de colágeno, que es el paso inicial de la vía de degradación intracelular en las células de cáncer de páncreas, a la luz de la transición epitelio-mesenquimal (EMT).
Metodología /Principales conclusiones
Se analizó la función de la internalización de colágeno en dos líneas celulares de cáncer de páncreas, células estrelladas pancreáticas (PSCs) SUIT-2 y KP-2, y el uso de Oregon Green 488-gelatina. PSCs tenía una fuerte capacidad para la absorción de colágeno, y las células de cáncer de páncreas también internaliza colágeno aunque menos eficiente. Las capacidades de internalización de colágeno de SUIT-2 y PK-2 células fueron promovidas por la EMT inducida por el factor de crecimiento transformante β1 recombinantes humanos (
P Hotel & lt; 0,05). Expresión de Endo180, un receptor de la absorción de colágeno, fue alto en las líneas celulares de cáncer de páncreas mesenquimales, tal como se determina por la expresión EMT marcador (
P
& lt; 0,01). RT-PCR cuantitativa y análisis de Western blot mostraron que la expresión Endo180 también fue aumentado por inducción EMT en SUIT-2 y PK-2 células. Endo180 desmontables de interferencia por ARN atenúa la absorción del colágeno (
P Hotel & lt; 0,01) y las capacidades invasivas (
P Hotel & lt; 0,05). Del SUIT-2 y PK-2 células
Conclusiones /Importancia
cáncer de páncreas células son capaces de internalización de colágeno, que se ve reforzada por la EMT. Este sistema de despacho ECM puede ser un nuevo mecanismo para la invasión celular y una posible diana terapéutica en el cáncer de páncreas
Visto:. Ikenaga N, Ohuchida K, K Mizumoto, Akagawa S, K Fujiwara, Eguchi D, et al. (2012) Las células de cáncer pancreático mejorar la capacidad de internalización de colágeno durante la transición epitelio-mesenquimal. PLoS ONE 7 (7): e40434. doi: 10.1371 /journal.pone.0040434
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de febrero de 2012; Aceptado: 6 Junio 2012; Publicado: 5 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Ikenaga et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio el apoyo de una beca del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, la Fundación Uehara Memorial y la Fundación para el sonido Fukuoka Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales, y su tasa de supervivencia a 5 años es sólo del 5% [1]. Se caracteriza por desmoplasia excesiva con abundante matriz extracelular (ECM), que desempeña un papel crucial en su comportamiento agresivo [2], [3]. El ECM dentro de los tumores pancreáticos se produce principalmente por el fenotipo activado de las células estrelladas pancreáticas (PSC), y la remodelación de ECM por PSC y células de cáncer de páncreas es uno de los pasos cruciales durante la progresión del cáncer [2], [4], [5]. Hasta la fecha, una serie de proteasas extracelulares derivados de las células cancerosas han sido identificados como contribuyentes a la invasión del cáncer y la progresión, incluyendo metaloproteinasas de la matriz (MMPs), una desintegrina y metaloproteinasas (Adams) y activador del plasminógeno uroquinasa [6].
los colágenos son los componentes de ECM más abundantes en el cuerpo y se someten a la síntesis y la degradación continua en condiciones fisiológicas y patológicas. los fibroblastos estromales, que son las células primarias para el mantenimiento de la homeostasis de ECM, degradar las fibrillas de colágeno intracelularmente además de la degradación extracelular mediada por múltiples proteasas [7], [8]. El paso inicial de la captación de colágeno es vinculante de colágeno para los receptores de membrana, tales como α
2β
1-integrina [7], [9] y Endo180 [10], seguido por endocitosis posterior, el transporte a los lisosomas y la degradación por catepsinas lisosomales cisteína [11]. Endo180 es un miembro de la manosa de los macrófagos sujeto familia de receptores de internalización constitutiva y reciclaje [12] y es esencial para la captación celular de colágeno en los fibroblastos [10]. Recientemente, Endo180 se encontró que se expresa no sólo en los fibroblastos, sino también un subconjunto de las neoplasias incluyendo glioblastomas [13] y los tumores de mama de tipo basal [14].
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un proceso de desarrollo en el que las células epiteliales polarizadas cambian a un fenotipo mesenquimal muy móviles para someterse a múltiples cambios bioquímicos [15]. En el cáncer epitelial, la inducción de la EMT es un proceso fundamental en la progresión del cáncer, y proporciona las células cancerosas con características invasivas y metastásicas. La reducción de expresión de E-cadherina, uno de los marcadores epiteliales, indica transición mesenquimales de las células cancerosas epiteliales, y está implicado en el mal pronóstico de cáncer de páncreas [16]. También se espera que las moléculas relacionadas con EMT-ser dianas terapéuticas.
Sobre la base de estas líneas de evidencia que los fibroblastos tienen una fuerte capacidad de degradar colágeno y que el fenotipo mesenquimal está asociada con la invasión del cáncer, la hipótesis de que las células de cáncer de páncreas también internalizar colágeno, similar a fibroblastos, y mejorar su capacidad invasora por sometidos a EMT. Hasta la fecha, la degradación extracelular regulada por proteasas extracelulares, incluyendo MMPs, derivadas de células de cáncer de páncreas ha sido bien establecida. Sin embargo, la degradación intracelular de colágeno por las células de cáncer de páncreas no se ha documentado. Hemos investigado si las células de cáncer de páncreas tienen la capacidad de internalizar colágeno en un
in vitro
estudio, y se evaluó el impacto de la internalización de colágeno sobre la invasión del cáncer pancreático a la luz de la EMT.
Resultados
No sólo PSC, sino también a las células de cáncer de páncreas tienen la capacidad de internalizar colágeno
Hemos establecido
in vitro
PSC de los cánceres de páncreas resecados para examinar si PSC tienen la función de absorción de colágeno, similar a los fibroblastos. La identidad de los PSC activadas fue confirmada por tinción inmunohistoquímica para vimentina y actina de músculo liso α-(α-SMA) como se describe anteriormente [17]. Oregon Green 488-gelatina (OG-gelatina), una forma desnaturalizada del colágeno, se visualizó en el citoplasma de PSCs después de la incubación durante 2 h (Figura 1A), y el flujo de los análisis de citometría demostró que más del 95% de PSC había internalizado colágeno ( Figura 1B). Las líneas celulares de cáncer pancreático SUIT-2 y KP-2 también fueron capaces de internalizar colágeno I nativo, aunque menos eficiente (Figura 1B). Los análisis de microscopía confocal confirmó la localización intracelular de OG-gelatina en las células de cáncer de páncreas (Figura 1C). En particular, las células cancerosas en forma de huso con una morfología mesenquimal parecían internalizar colágeno fuertemente. Las células incubadas con fluoresceína conjugado de albúmina de suero bovino (fluoresceína-BSA) como control no contenían señales tanto en la microfotografía de fluorescencia y citometría de flujo (datos no mostrados).
(A) microfotografía Representante de la tinción de inmunofluorescencia de α- SMA en el PSC. Los PSC tienen una morfología estrellada-como o en forma de huso, y expresan α-SMA (rojo). Los PSC han interiorizado muchas moléculas de colágeno (verde). Barra de escala: 100 micras. Aumento original: × 200. (B) La citometría de flujo análisis de PSC, las células Juego-2 y KP-2 células después de la incubación con OG-gelatina para 2 h. Cada muestra se analizó por triplicado, y los porcentajes de células de colágeno-internalizado se muestran como media ± desviación estándar en las figuras representativas. imágenes (C) de microscopía confocal de colágeno en el citoplasma de SUIT-2 y PK-2 células. Las células se incubaron con OG-gelatina (verde), fijadas y teñidas con Alexa Fluor 647 faloidina conjugada (rojo) para visualizar la célula contornos. Se muestran secciones ortogonales en los planos XY, XZ e YZ. Los ejes Y y Z ilustran la localización del colágeno internalizado más claramente (puntas de flecha). En particular, las células cancerosas en forma de huso con una morfología mesenquimal contienen muchas moléculas de colágeno (flechas). Barras de escala: 100 m. Aumento original:. × 400
EMT en células de cáncer de páncreas aumenta su internalización colágeno
Hemos investigado si la EMT en las células de cáncer de páncreas se asocia con la función de la internalización de colágeno, ya que PSC, que tienen un fenotipo mesenquimal, tienen una fuerte capacidad para la internalización de colágeno. Para la inducción de EMT en las células cancerosas, se utilizó factor de crecimiento transformante -β1 (TGF), que es un factor importante durante la EMT con muchos papeles contributivas [15]. células de cáncer pancreático tratados con TGF-β1 mostraron una morfología fibroblástica y la celda de dispersión en forma de huso en comparación con las células de cáncer no tratados (figura 2A). Los análisis de transferencia Western mostraron que la expresión de E-cadherina se redujo y la expresión de vimentina se incrementó en traje-2 y PK-2 células después del tratamiento con TGF-β1 (Figura 2B). Estos resultados indican que las células de cáncer pancreático alterados a un fenotipo mesenquimal, lo que significa que EMT fue inducida por TGF-β1. Las capacidades de internalización de las células de colágeno SUIT-2 y PK-2 fueron promovidas por la inducción de la EMT con el tratamiento con TGF-β1 durante 72 h (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 2C, 2D).
células SUIT-2 y PK-2 (a) se transforman en una morfología después del tratamiento en forma de huso con TGF-β1 durante 72 h. Barras de escala: 100 m. Aumento original: × 200. (B) Análisis de transferencia de Western que muestra que la expresión de E-cadherina se reduce y la expresión de vimentina se incrementa en traje-2 y PK-2 células por tratamiento de TGF-β1. Las veces las diferencias en las inmunotransferencias representativas cuantificadas por densitometría A continuación se muestran los respectivos carriles. unt: sin tratar. (C) células SUIT-2 y KP-2 se cultivaron con o sin TGF-β1 durante 72 h, seguido de incubación con OG-gelatina (verde) durante 2 h. Las células fueron fijadas y teñidas con Alexa Fluor 647 faloidina conjugada (rojo) para visualizar los contornos celulares. La microscopia de fluorescencia revela que el colágeno internalizada por SUIT-2 y PK-2 células se incrementa después del tratamiento con TGF-β1. Barras de escala: 100 m. Aumento original: × 400. (D) Los datos cuantitativos para la internalización de colágeno por SUIT-2 y KP-2 células determinada por citometría de flujo revela diferencias significativas en la capacidad de absorción de colágeno entre las células cancerosas tratadas TGF-β1 no tratada y. Cada línea celular se analizó por triplicado y los porcentajes de células de colágeno-interiorizado se expresan como medias ± SD. Las comparaciones entre las células no tratadas y TGF-beta 1-tratado se llevaron a cabo utilizando Estudiante de
t-test
. Todos los experimentos se llevaron a cabo más de tres veces y se muestran imágenes representativas.
Endo180 expresión se asocia con el fenotipo mesenquimal de las células de cáncer de páncreas
A continuación, se analizaron los niveles de expresión de la EMT marcadores, incluyendo e-cadherina y vimentina, el principal receptor de colágeno α2β1-integrina y el receptor de la captación de colágeno Endo180 en las líneas celulares de cáncer pancreático para aclarar la relación entre la EMT y la internalización de colágeno. Las líneas celulares de cáncer de páncreas expresan varios niveles de los marcadores de EMT, α2β1-integrina y Endo180 (Figura 3A). En primer lugar, se utilizó la relación de E-cadherina para vimentina para clasificar las células como epitelial o fenotipo mesenquimal, y después se compararon los niveles de α2-integrina, β1-integrina y expresión Endo180 entre las células clasificadas en los dos fenotipos. Endo180 fue más altamente expresado en las líneas celulares de cáncer pancreático mesenquimales que en las líneas celulares de cáncer de páncreas epiteliales, mientras que la expresión de β1-integrina y α2-integrina no se correlacionó con los fenotipos celulares (
P
& lt; 0,01 ; Figura 3B). La expresión de Endo180 mRNA en células SUIT-2 y PK-2 se reguló mediante la inducción de EMT con el tratamiento con TGF-β1, junto con el aumento de la expresión de la superficie celular de Endo180 del 9,3 ± 0,1% a 19,9 ± 2,4% en las células SUIT-2 y del 19,1 ± 1,0% a 24,8 ± 1,5% en las células PK-2 (
P Hotel & lt; 0,01, Figura 3C).
(a) los niveles de expresión de e-cadherina, vimentina , Endo180, β1-integrina y α2-integrina en 10 líneas celulares de cáncer de páncreas y cuatro culturas PSC. Los niveles de expresión de todos los genes se normalizaron por los correspondientes niveles de expresión de β-actina. Cada muestra se analizó por triplicado, y los datos se expresan como medias ± SD. Una quinta parte de los niveles adquiridos de E-cadherina y Endo180 se muestran en la gráfica para facilitar la consulta. (B) Las líneas celulares de cáncer de páncreas se dividieron en dos grupos que muestran un fenotipo epitelial (SW1990, Hs766T, BxPC-3, Capan-1 y AsPC-1) y un fenotipo mesenquimal (SUIT-2, CFPAC-1, MIA PaCa- 2, Panc-1 y KP-2) sobre la base de la relación de la expresión de e-cadherina para vimentina. Endo180 es más altamente expresado en las líneas de células con el fenotipo mesenquimal que en aquellos con el fenotipo epitelial, mientras que las expresiones de β1-integrina y α2-integrina no se correlacionan con los fenotipos celulares. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Mann-Whitney
T-test
. (C) SUIT-2 y KP-2 células se incubaron con o sin TGF-β1 durante 72 h, y los niveles de expresión de Endo180, β1-integrina y α2-integrina se determinó por RT-PCR cuantitativa (panel superior). Los niveles de expresión de todos los genes se normalizaron por los correspondientes niveles de expresión de 18S rRNA. Los cambios veces se calcularon como los niveles de mRNA en las células TGF-beta 1-tratados dividido por los niveles en las células no tratadas. Endo180 expresión de ARNm en SUIT-2 y PK-2 células es más altamente aumentó en la inducción de la EMT-β1 integrina y la expresión del ARNm α2-integrina. El aumento de expresión de la superficie celular de Endo180 en EMT inducida SUIT-2 y PK-2 células (líneas rojas) en comparación con SUIT-2 no tratada y 2 KP-células (líneas azules), respectivamente, se confirmó mediante citometría de flujo análisis (
P
& lt; 0,01 para cada uno; paneles inferiores). Cada muestra se analizó por triplicado, y las comparaciones entre las células tratadas y no tratadas TGF-beta 1-se realizaron utilizando de Student
t-test
.
Desmontables de Endo180 en las células de cáncer de páncreas atenúa su la captación de colágeno y capacidades invasivas
Para investigar si la expresión Endo180 se asocia con el consumo de colágeno por las células de cáncer de páncreas, derribaron Endo180 mRNA en SUIT-2 y PK-2 células utilizan la tecnología de interferencia de ARN. La transfección transitoria de siEndo180-1 y siEndo180-2 disminución de la expresión Endo180 tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Figura 4A). Las morfologías celulares de SUIT-2 y PK-2 células no cambiaron después de Endo180 caída. Las capacidades de internalización de colágeno de SUIT-2 y KP-2 células bajo tratamiento con TGF-β1 se atenuaron dramáticamente por la supresión de la expresión Endo180 (
P
& lt; 0,01; Figura 4B). Además, los ensayos de la matriz de colágeno 3D mostraron que las células de cáncer de EMT inducida muestran un fenotipo menos invasiva cuando Endo180 expresión fue suprimida con siRNA. TGF-β1 todavía mejorada invasión de células cancerosas en la presencia de control de siRNA (Figura 5A, 5B). Por otro lado, la expresión Endo180 no estuvo involucrado en la proliferación celular y la migración de SUIT-2 y 2-PK células (datos no mostrados).
Se transfectaron células SUIT-2 y PK-2 (A) con siEndo180-1 o siEndo180-2 y desmontables expresión Endo180 en comparación con las células transfectadas con siRNA-control fue confirmada por RT-PCR cuantitativa (panel superior) y análisis de Western Blot (panel inferior) durante al menos 3 días. (B) Después de la inducción de EMT con 10 ng /ml de TGF-β1, SUIT-2 y KP-2 células se incubaron con OG-gelatina para 2 h. Los porcentajes de células internalizadas-OG-gelatina se evaluaron por citometría de flujo. Los gráficos de puntos muestran un resultado representativo citometría de datos para SUIT-2 sin tratar y KP-2 células y las células transfectadas con siRNA control, siEndo180-1 o siEndo180-2 (paneles superiores). Las puntuaciones de internalización de colágeno representan las proporciones relativas de células de colágeno-internalizado entre las células transfectadas con ARNsi de control, siEndo180-1 o siEndo180-2 a los de las células no tratadas. Las capacidades mejoradas de internalización de colágeno en traje-2 y PK-2 células después del tratamiento con TGF-β se reducen drásticamente por la caída de expresión Endo180 (panel inferior). Cada muestra se analizó por triplicado, y las comparaciones entre las células TGF-beta 1-tratada transfectadas con siRNA control y otras células se realizaron con Estudiantes de
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,01; **
P
. & Lt; 0,001
SUIT-2 y PK-2 células (4 × 10
4 células /pocillo) seccionado con siRNAs fueron suspendidas en 50 g de tipo I 3D matriz de colágeno, y se sembraron en las cámaras superiores con o sin TGF-β1. Después de la formación del gel mediante incubación a 37 ° C durante 30 min, las cámaras superiores se colocaron en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos que contenía 750 l de 10% de FBS /DMEM. Las células que invadieron a la superficie inferior de cada membrana cámara superior a través de la matriz de colágeno I se fijaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se contaron. (A) microfotografías representativas de invadir SUIT-2 y KP-2 células transfectadas con siRNA control, siEndo180-1 o siEndo180-2. Las barras de escala, 100 m. Aumento original, × 200. (B) la capacidad invasora de SUIT-2 y PK-2 células se incrementan en la inducción de la EMT, pero atenuada por la caída de expresión Endo180. Cada muestra se analizó por triplicado, y las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante Estudiante de
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001. internalización puntuaciones (C) de colágeno en traje-2 y PK-2 células después del cocultivo con PSC durante 72 h. Las capacidades de internalización de colágeno están ligeramente mayor en las células SUIT-2 y PK-2 a través de interacciones con el cáncer del estroma. Los experimentos se realizaron por triplicado, y las comparaciones entre los mismos se realizaron mediante Estudiante de
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
PSC mejorar la internalización de colágeno por las células de cáncer de páncreas
Finalmente, se investigó si PSC tuvieron un impacto sobre la internalización de colágeno por las células de cáncer de páncreas, ya que se sabe PSCs para promover la progresión y EMT de cáncer de páncreas a través de interacciones con el cáncer del estroma [18], [19]. Las capacidades de internalización de colágeno de SUIT-2 y células PK-2 cocultured con PSC estaban ligeramente reforzada en comparación con los de las células cancerosas monocultivado (
P Hotel & lt; 0,05 y
P Hotel & lt; 0,01, respectivamente; Figura 5C). Estos hallazgos sugieren que las interacciones con el cáncer del estroma también promueven la absorción de colágeno por las células de cáncer de páncreas.
Discusión
La invasión de las células cancerosas, un paso crítico en la progresión del cáncer, consiste en la degradación de ECM y la posterior migración de las células cancerosas para recién formados espacios extracelulares. MMPs se han considerado como los principales proteasas capaces de degradar varios componentes de ECM para ayudar a la progresión del tumor, y se considera que son objetivos prometedores para la terapia del cáncer [20], [21]. Sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos de inhibidores de MMP han dado resultados decepcionantes con un éxito limitado [22], [23]. En este estudio, hemos demostrado que no sólo la degradación extracelular de la ECM, sino también la captación intracelular de los componentes de ECM pueden estar involucrados en la invasión celular. Un sistema de proteólisis que implica la degradación de colágenos internalizados por catepsinas lisosomales de cisteína también se ha observado en varios tumores malignos y se informó que estar relacionado con la invasión tumoral y la metástasis [24], [25], [26]. Quintanilla-Dieck et al. [27] mostró que la catepsina K en el melanoma regula la invasión de la mediación de la degradación intracelular de componentes de ECM. Análisis inmunohistoquímico de tejidos de cáncer de páncreas reveló que las expresiones de la catepsina B y catepsina L son indicadores de un mal pronóstico [28]. Estas líneas de evidencia sugieren que pueden para la invasión celular, es necesario para crear un espacio para migrar a mediante la internalización y la degradación de los componentes de ECM intracelularmente, además de su degradación pericellular. El sistema de compensación de componentes de ECM exhibidas por las células de cáncer es potencialmente un nuevo mecanismo para la invasión en el cáncer de páncreas.
EMT se considera que es un paso crucial en la progresión del cáncer, a pesar de su importancia y relevancia han seguido siendo un tema de debate [15]. La pérdida de la adhesión célula-célula, los cambios en la forma celular y el aumento de la motilidad de plomo a la invasión de las células cancerosas a través de la membrana basal en el tejido del estroma [15], [29]. células EMT inducida se ven típicamente en la parte delantera invasiva de los tumores primarios, y se desarrollan en etapas posteriores de la migración profundamente en el ECM, intravasación, el transporte a través de la circulación y la formación de micrometástasis [30]. En el cáncer colorrectal, pequeños agregados de células tumorales que se extienden desde la masa tumoral en el estroma adyacente se ha demostrado como evidencia morfológica de EMT en los frentes invasivos de cáncer humano [31]. Rhim et al. [32] demostraron que las células epiteliales malignos marcados invadieron en el estroma a través de EMT y entremezclados con células estromales utilizando un modelo genético de ratón con cáncer de páncreas espontánea. Hemos encontrado que las células de cáncer pancreático EMT inducida podrían promover su capacidad invasiva, no sólo por el aumento de la motilidad, sino también mejorar la internalización de colágeno. internalización de colágeno puede ser uno de los factores que contribuyen a la progresión del cáncer prestados por EMT, y estas poblaciones celulares capaces de captación de colágeno puede ser principales células de invasión. En fibroblastos, α
2β
1-integrina se considera que es importante para las interacciones celulares con colágeno y se ha propuesto para jugar un papel en el proceso de internalización [33]. Sin embargo, en nuestro estudio, α
2β expresión
1-integrina no estaba involucrado en los fenotipos de células de líneas celulares de cáncer de páncreas y no fue mayor en las células SUIT-2 y KP-2 inducida por la EMT. De acuerdo con experimentos usando un anticuerpo anti-β
1-integrina y fibroblastos Endo180 deficientes en [8], la adhesión mediada por Endo180 de los fibroblastos para las matrices de colágeno es un proceso β
1-integrina independiente. En conjunto, la invasión celular potenciada por EMT podría atribuirse a Endo180 solo y no a alfa
2β
1-integrina.
El desmoplasia en el cáncer de páncreas se manifiesta como bandas de estroma fibroso que rodea las células cancerosas, que resulta en un aumento de los colágenos fibrilares. Este estroma fibroso está compuesto principalmente por colágeno tipo I, que fue reportado para promover la proliferación, la migración y la quimio-resistencia en las células de cáncer de páncreas [2], [34]. Por otro lado, los ratones con el tumor en decúbito prono con fibroblastos Endo180 deficientes mostraron una mayor acumulación de colágeno dentro de los tumores [35], y los ratones implantados con células de cáncer de mama expresan un mutante Endo180 internalización-defectuoso habían aumentado fibrosis intratumoral [14]. Estos resultados se correlacionaron con una disminución en la internalización de colágeno y la rotación de colágeno reducida, resultando eventualmente en el crecimiento tumoral restringido. En nuestro estudio, PSC tenían una fuerte capacidad para la internalización de colágeno, y Endo180-suficientes células de cáncer de páncreas mostraron invasión más fuerte que las células deficientes en Endo180. Por lo tanto, la rotación de ECM mediada por Endo180 puede ser crucial para la expansión del tumor y la progresión del cáncer
.
En conclusión, no sólo mesenquimales PSC, sino también células de cáncer pancreático tienen la capacidad de internalizar colágeno. internalización de colágeno por las células cancerosas se mejoró en asociación con la EMT. Derribo del receptor de captación de colágeno Endo180 abrogó la internalización de colágeno por las células cancerosas y reducir sus capacidades invasivas. Este mecanismo invasivo anteriormente no apreciada de las células de cáncer de páncreas es necesario aclarar aún más para identificar nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Células y condiciones de cultivo
La siguiente se han usado 10 líneas celulares de cáncer de páncreas: AsPC-1, KP-2, Panc-1, SUIT-2, BxPC-3 (Dr. H. Iguchi, Centro Nacional del cáncer de Shikoku, Matsuyama, Japón), MIA Paca-2 (japonés Banco de recursos del cáncer), CAPAN-1, CFPAC-1, Hs766T y SW1990 (American Type Culture Collection). PSC humanos fueron aisladas de muestras quirúrgicas de cáncer de páncreas frescos utilizando el método de derivación como se describe anteriormente [36], [37]. Los cultivos primarios de PSC humanos derivan de cuatro pacientes con cáncer de páncreas se establecieron invasoras en nuestro laboratorio con el consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu y llevó a cabo de acuerdo con las directrices éticas para Genoma /Gen Humano promulgadas por el Gobierno japonés y la Declaración de Helsinki. La identidad de los PSCs fue confirmada por tinción de inmunofluorescencia para α-SMA (tasa positiva: casi 100%) y vimentina (tasa positiva: casi 100%) y la morfología (células estrelladas-como o en forma de huso) [17]. Todas las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), estreptomicina (100 mg /ml) y penicilina (100 mg /ml) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 10% de CO
2.
el colágeno ensayo de internalización
Las células fueron sembradas en placas de 90 mm a una densidad de 1 × 10
5 células /placa y se incubaron en 1% FBS /DMEM con o sin 10 ng /ml de TGF-β1 humano recombinante (amp I +; D Systems) durante 72 h. A continuación, las células se incubaron con 20 mg /ml OG-gelatina en 1% de FBS /DMEM durante 2 horas a 37 ° C. Por enfriamiento brusco de extracelular no internalizado OG-gelatina, las células se incubaron con 0,4% de azul de tripano (Sigma) en solución salina durante 5 min. Después de tres lavados con PBS frío, las células se separaron mediante tripsinización, y se sometieron a citometría de flujo para determinar la proporción de células que habían incorporado el colágeno. Como control, 20 mg /ml de fluoresceína-BSA (Molecular Probes) se evaluó utilizando el mismo protocolo. En la internalización de colágeno análisis para detectar células cancerosas transfectadas con siRNAs, SUIT-2 y PK-2 células fueron transfectadas con siRNA control, siEndo180-1 o siEndo180-2, sembraron en placas de 90 mm en 4 × 10
5 células /plato y se trató con 10 TGF-β1 ng /ml durante 48 h para inducir la EMT. Las células fueron incubadas con 20 mg /ml OG-gelatina o fluoresceína-BSA en 1% de FBS /DMEM durante 2 horas a 37 ° C, y no internalizado OG-gelatina o fluoresceína-BSA se inactivó mediante incubación con 0,4% de tripano azul. Después de lavar con PBS frío, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo. La puntuación internalización de colágeno se calculó como la proporción relativa de células de colágeno-internalizado entre las células transfectadas con ARNsi de control, siEndo180-1 o siEndo180-2 a los de las células no tratadas.
Laser-microscopía confocal de barrido para la tinción de inmunofluorescencia
Las células se sembraron en placas de 35 mm placas de fondo de vidrio (Matsunami) a una densidad de 2 × 10
4 células /placa y se incubaron en 1% de FBS /DMEM con o sin 10 ng /ml de TGF-β1 por 48 h. A continuación, las células se incubaron con 20 mg /ml OG-gelatina o fluoresceína-BSA en 1% de FBS /DMEM durante 2 horas a 37 ° C, seguido de la fijación con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente después del temple de fluoresceína extracelular con 0,4% de azul de tripano. células SUIT-2 y KP-2 fueron incubadas con Alexa Fluor faloidina 647 conjugado (Molecular Probes) para teñir la actina F para la visualización de la célula describe de acuerdo con las instrucciones del fabricante, mientras que PSC se incubaron con un anticuerpo de conejo anti-α- anticuerpo SMA (Epitomics; 1:100 dilución) durante 2 h, seguido de incubación con Alexa Fluor IgG anti-conejo conjugado con 647 (Molecular Probes) durante 1 h. El ADN nuclear se counterstained con 0,05 mg /ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol. se utilizó; (Nikon A1R) para microfotografía inmunofluorescencia A de escaneo láser confocal microscopio de fluorescencia. Las imágenes fueron administrados usando el software de NIS-Elements (Nikon).
El aislamiento de ARN
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando un kit de aislamiento de ARN High Pure (Roche Diagnostics) con DNasa I (Roche Diagnostics) tratamiento. El ARN extraído se cuantificó por la absorbancia a 260 nm, y su pureza se evaluó de la relación 260/280 de la absorbancia con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).
cadena cuantitativa con transcripción inversa de la polimerasa reacción (RT-PCR)
RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando un Kit QuantiTect SYBR Green transcripción inversa-PCR (Qiagen) y un sistema de detección de PCR en tiempo real Chromo4 (Bio-Rad Laboratories). Hemos diseñado cebadores específicos para E-cadherina y vimentina utilizando Primer 3 de software y BLAST búsquedas realizadas para asegurar la especificidad de los cebadores. Los cebadores para Endo180, β1-integrina, α2-integrina, β-actina y 18S rRNA se adquirieron de Takara Bio Inc. Las secuencias de los cebadores utilizados en el presente estudio se muestran en la Tabla 1. Cada mezcla de reacción se incubó primero a 50 ° C durante 30 min para permitir la transcripción inversa, en la que cDNA de primera cadena se sintetizó cebando el ARN total con un cebador específico de gen. PCR se inició mediante incubación a 95 ° C durante 15 min para activar la polimerasa, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s (para E-cadherina y vimentina) o 95 ° C durante 5 s, 60ºC durante 20 s y 72ºC durante 30 s (por Endo180, β1-integrina, α2-integrina, β-actina y 18S ARNr). Los niveles de expresión de los genes se calcularon sobre la base de las curvas de calibración construidas con ARN total de SUIT-2 células. Los niveles de expresión se normalizaron por la β-actina o la expresión 18S rRNA y se expresaron como la relación de la expresión del gen diana a la de la β-actina o 18S rRNA. Todas las muestras se realizaron por triplicado. No hay productos de PCR se amplificaron detectables sin transcripción inversa previa. La precisión y la integridad de los productos de la PCR se confirmaron con un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.).
La citometría de flujo
Las células cultivadas se recogieron por tratamiento con tripsina /EDTA durante 5 min a 37 ° C, y se lavaron en 10% de FBS /DMEM. Las células individuales obtenidos se suspendieron en solución enfriada con hielo 1% de FBS /PBS y se analizaron con un citómetro de flujo (EC800; SONY) equipado con un láser que proporciona una longitud de onda de excitación de 488 nm. Eclipse Software de análisis (SONY) se utilizó para cuantificar las señales fluorescentes y establecer los parámetros gating electrónicos lógicos.
ensayo de invasión en un colágeno I 3D Matrix y la migración de ensayo
La invasividad del cáncer de páncreas las células se evaluó con base en el número de células invasoras a través transwell cámaras (BD Biosciences) bajo condiciones de cultivo en 3D en una matriz de colágeno I. El gel de matriz de colágeno I se preparó por dilución de la cola de rata colágeno de tipo I (BD Biosciences) en 10% de FBS /DMEM (01:10), incluyendo NaOH 0,023 N (concentración final de colágeno: 0,38 g /l).