Extracto
MAb 4C5 es un anticuerpo impermeable a las células, anti-HSP90 monoclonal murino, originalmente producido usando tecnología de hibridomas. Hemos demostrado previamente que el mAb 4C5 reconoce específicamente tanto la α- y en menor medida la β-isoforma de HSP90. Además,
in vitro
y
in vivo
estudios revelaron que al inhibir selectivamente la función de HSP90 de la superficie celular, mAb 4C5 entorpece seriamente la invasión de células del cáncer y la metástasis. Aquí se describe la reconstitución de mAb 4C5 en una quimera de ratón-humano. Más importante aún nos informan de que el mAb 4C5 y en consecuencia su contraparte quimérico están completamente desprovistas de cadena pesada y consisten sólo en un dímero de cadena ligera kappa funcional. El anticuerpo quimérico se muestra para retener las propiedades de especificidad y funcionales del anticuerpo original. Por lo tanto, es capaz de inhibir la función de la superficie de HSP90, lo que lleva a la invasión de células de cáncer reducido
in vitro
. Por último, se presentan
in vivo
evidencia que muestra que el 4C5 quimérico inhibe significativamente la formación de depósitos metastásica de las células MDA-MB-453 en los pulmones de los ratones SCID. Estos datos sugieren que un anticuerpo de cadena ligera kappa quimérico podría ser potencialmente utilizado como un agente anti-cáncer, introduciendo así un nuevo tipo de fragmento de anticuerpo, con una reducción de los posibles efectos adversos inmunogénicas, en la terapéutica del cáncer
Visto:. Sidera K, El Hamidieh a, Mamalaki a, Patsavoudi E (2011) El 4C5 celular impermeable anti-HSP90 anticuerpos con actividad anticancerígena, se compone de una sola cadena ligera dímero. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10.1371 /journal.pone.0023906
Editor: Paul C. Driscoll, Instituto Nacional de Investigación Médica MRC, Reino Unido
Recibido: 11 de mayo de 2011; Aceptado: 28 Julio 2011; Publicado: 1 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Sidera et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proteína de choque térmico 90 (HSP90) se considera una muy atractivo fármaco-diana para la terapia del cáncer, ya que la mayoría de sus proteínas cliente desempeñan un papel clave en la adquisición y /o el mantenimiento del fenotipo maligno [1] - [4]. Recientemente, nosotros y otros hemos identificado una piscina de HSP90 en la superficie celular [5] - [8], en la que se muestra a participar en la invasión de células de cáncer y la metástasis [9] - [11]. El aumento de la evidencia continúa reforzando la noción de un amplio fenómeno de ser acompañantes HSP90 extracelular, implicado en la progresión del cáncer y la diseminación metastásica [12] - [16] lo que contribuirá al desarrollo de inhibidores que se dirigen específicamente a la superficie celular HSP90. MAb 4C5 es un anticuerpo monoclonal murino impermeable a las células producido utilizando tecnología de hibridoma [17], que reconoce específicamente tanto la α y en menor medida la isoforma β de HSP90 [8]. MAb 4C5 se mostró inicialmente para inhibir los procesos de migración celular
in vitro
durante el desarrollo del sistema nervioso [18], [19] al afectar citoesqueleto de actina reorganización y formación de estructuras móviles tales como lamelipodia [8], [20]. Posteriormente se presentó la evidencia que demuestra que mediante la unión selectiva a la piscina superficie de HSP90, mAb 4C5 reduce significativamente la invasión de células de melanoma y metástasis [11]. Además mAb 4C5 ha demostrado inhibir la interacción extracelular entre HSP90 y el receptor de factor de crecimiento de ErbB-2 en MDA-MB-453 células de cáncer de mama, lo que lleva a la alteración de la señalización corriente abajo y la reducción de la motilidad celular y la invasión del cáncer [21]. Por último, mAb 4C5 ha demostrado inhibir una interacción funcional entre secretada HSP90 y las formas inactivas de las metaloproteinasas 2 y 9, necesarias para la activación de las enzimas que son esenciales para la invasión de las células cancerosas y la extravasación [14]. Estos datos combinados sugieren que la capacidad única de mAb 4C5 para inhibir específicamente la piscina extracelular de HSP90 sin afectar a la amplia gama de importantes funciones intracelulares de esta chaperona podría tener beneficios clínicos en el tratamiento de tumores malignos humanos. Sin embargo, mAbs murinos no constituyen agentes terapéuticos ideales, ya que su inmunogenicidad potencial representa una limitación para su uso clínico. La aplicación de mAbs de ratón a la terapia humana se ha vuelto factible por el advenimiento de las tecnologías de ADN recombinante que ha llevado al desarrollo de anticuerpos quiméricos y humanizados que exhiben una inmunogenicidad reducida [22] sin una pérdida significativa en la afinidad, especialmente en el caso de quimérico anticuerpos [23], [24].
En el presente trabajo se describe la clonación y secuenciación del mAb 4C5 genes de la línea celular de hibridoma de origen y la construcción exitosa de una quimera funcional del ratón-humano, que es se muestra para retener las propiedades del anticuerpo parental. Más importante aún nos informan de que el mAb 4C5 es completamente desprovisto de-cadena pesada (H) y consta sólo de un dímero de cadena ligera kappa de inmunoglobulina funcional y sus propiedades puede ser recapitulado en una proteína recombinante que contiene sólo esta luz (L)-cadena polipeptídica. Por último, demostrar la eficacia terapéutica potencial de este nuevo tipo de fragmento de anticuerpo.
Resultados
MAb 4C5 es un fragmento de anticuerpo completamente desprovisto de una cadena pesada
La movilidad electroforética de mAb 4C5 estudió en condiciones reductoras y no reductoras de SDS-PAGE reveló que no es una molécula de IgG convencional. Más específicamente, cuando purificada mAb 4C5 se sometió a SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-Fab, no se observó la típica 25 kDa y 50 kDa bandas correspondientes a la L- y H-cadena, respectivamente, de una convencional anticuerpo IgG, pero en lugar de una sola banda a aproximadamente 25 kDa (Fig. 1A). Curiosamente se obtuvo una banda idéntica 25 kDa después de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-kappa L-cadena (Fig. 1A). En consecuencia, después de no reductor inmunotransferencia electroforesis con ambos de estos estándar-anticuerpos, muestra mAb 4C5 a ser significativamente más pequeña que una molécula de IgG1 convencional ya que migró a aproximadamente 50 kDa. (Fig. 1A). Finalmente, no se detectó inmunorreactividad después de la electroforesis de mAb 4C5 tanto bajo condiciones reductoras y, seguido por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-Fc gamma (Fig. 1A) no reductor. Estos datos combinados indican que el mAb 4C5 puede carecer de ya sea una parte de su cadena H, o que es completamente desprovisto de H-cadena. Con el fin de explorar más a fondo estas posibilidades Seguidamente, realizó el análisis de transferencia Northern utilizando una sonda de cadena H IgG1. ARN derivado de células de hibridoma que producen una inmunoglobulina IgG1 intacta llamado 2D10 sirvió como control positivo. En contraste con el control positivo, no se detectó radiactividad después de la hibridación de los ARN derivados a partir del hibridoma mAb 4C5 y las células de mieloma NSO (control negativo) (Fig. 1B), lo que indica que mAb 4C5 puede carecer por completo de un gen de la cadena H. Esto fue confirmado por experimentos de amplificación de cadena H de PCR. Para la amplificación del ADNc de la cadena H de mAb 4C5, un panel de ocho cebadores universales de ratón y un cebador polyA + dirigidos respectivamente contra el 5 'y los extremos 3' del ARNm, se probaron en varias reacciones de PCR separadas. En todas las condiciones ensayadas no la amplificación de un producto específico de la cadena H se observó (datos no presentados). Estos datos combinados sugieren que el mAb 4C5 está desprovisto de cadena H y por lo tanto se procedió a la expresión recombinante del anticuerpo de cadena L solo con el fin de explorar sus propiedades.
A. El análisis electroforético de mAb 4C5, seguido por inmunotransferencia con una cadena kappa anti-ratón, un Fab anti-ratón y un anticuerpo anti-Fc gamma. inmunoglobulina IgG1 intacto producido por las células de hibridoma 2D10 sirve como control positivo. En la reducción de electroforesis seguida de Western blot con el anticuerpo anti-Fab, se observa una única banda de 25 kDa inmunorreactivas, en lugar de las 25 y las bandas de 50 kDa correspondientes a la L- y H-cadena, respectivamente, de una IgG1 intacta . Esta banda de 25 kDa es idéntica a la banda correspondiente a la kappa L-cadena, como se muestra mediante transferencia Western con el anticuerpo de cadena kappa anti-ratón. Bajo la no reducción de electroforesis seguida de Western blot con tanto el los anticuerpos anti-Fab anti-kappa y, mAb 4C5 se muestra a migrar a aproximadamente 50 kDa, y no a 150 kDa como se esperaba para una molécula de IgG1 intacto. No inmunorreactividad mAb 4C5 se detecta después de la electroforesis bajo condiciones reductoras y dos, seguido de transferencia Western con un anticuerpo anti-Fc gamma no reductor. En el caso de la inmunoglobulina IgG1 en las mismas condiciones se observa una 50 kDa y una banda de 150 kDa, respectivamente. B. No radiactividad se detecta después de un análisis de transferencia Northern de ARN 4C5 derivado de hibridoma con una sonda marcada radiactivamente cadena H. ARN derivado de las células de hibridoma 2D10-IgG1 producción y las células de mieloma NSO sirvió como control positivo y negativo, respectivamente.
Construcción del anticuerpo de cadena L- quimérico
La amplificación inicial del gen de la cadena kappa mAb 4C5 de la primera plantilla de cadena de ADNc se realizó utilizando cebadores de ratón de cadena L universales según Barbas [25]. El producto de PCR correspondiente a la longitud mab 4C5 L-cadena completa, fue luego subclonado en el vector pComb3H. Análisis de secuencias de la cadena L recombinante (rec-4C5) reveló que pertenece al subgrupo de la cadena kappa I [26] (Fig. 2).
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena L de mAb 4C5.
anticuerpo de cadena L quimérica (ch-4C5) se construyó reemplazando la región de codificación LCκ ratón con el correspondiente inserto LCκ humano. El análisis de la secuencia de varios clones recombinantes confirmó la construcción exitosa del anticuerpo quimérico de ratón-humano.
Tanto rec-4C5 y CH-4C5 se expresaron en el espacio periplásmico de bacterias y se purificó como se describe en Materiales y Métodos. Los motilidades electroforéticos de los anticuerpos purificados se ensayaron en condiciones reductoras y no reductoras y se encontró que eran similares a la motilidad correspondiente del anticuerpo original mAb 4C5 (Fig. 3A).
A.
Panel izquierdo:
SDS-PAGE de los anticuerpos purificados en condiciones reductoras seguido de Coomasie Brilliant Blue R-tinción reveló en todos los casos una banda de aproximadamente 25 kDa correspondientes a la cadena L.
Panel derecho:
En condiciones no reductoras los anticuerpos se muestran para migrar como un dímero de cadena L. B. blot occidental de MDA-MB-453 lisados celulares utilizando mAb 4C5, 4C5-rec, CH-4C5 y un anticuerpo anti-HSP90α comercial, que sirve como control positivo. En todos los casos se observa una única banda inmunorreactiva de 90 kDa correspondiente a HSP90. C. La inmunoprecipitación en lisados de células MDA-MB-453 con anti-HSP90α, seguido de inmunotransferencia con ya sea el murino o de los anticuerpos recombinantes. En todos los casos se observa una única banda inmunorreactiva. D. inversa experimentos de inmunoprecipitación en MDA-MB-453 lisados celulares utilizando mAb 4C5, 4C5 y rec-CH-4C5, seguido de transferencia Western con anti-HSP90α. En todos los casos se observó una única banda inmunorreactiva que indica que ambos anticuerpos recombinantes reconocen HSP90.
CH-4C5 reconoce específicamente HSP90
Con el fin de explorar la especificidad de los anticuerpos, western blot análisis se realizó en MDA-MB-453 lisados de células de cáncer de mama usando un anticuerpo policlonal comercial anti-HSP90α (Chemicon International, EE.UU.), mAb 4C5, 4C5 y rec-CH-4C5. En todos los casos se observó una única banda inmunorreactiva idénticos (Fig. 3B), lo que confirma que tanto rec-4C5 y 4C5-ch retienen la especificidad del mAb 4C5 paternal. Este resultado fue confirmado por los experimentos de inmunoprecipitación realizados en pre-aclarado lisados de células MDA-MB-453 utilizando anti-HSP90α, seguido de inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal 4C5, 4C5 o rec-ch-4C5. En todos los casos, se observó una única banda inmunorreactiva, indicando que el quimérico de cadena L reconocen específicamente HSP90 (Fig. 3C). Se obtuvo el mismo resultado cuando la inmunoprecipitación se realizó utilizando mAb 4C5, 4C5 y rec-CH-4C5 seguido por inmunotransferencia de tipo Western con el anticuerpo anti-HSP90α (Fig. 3D). En todos los experimentos se utilizó una IgG de ratón irrelevante como control negativo.
CH-4C5 es impermeable a las células y no afecta a la función de HSP90 intracelular
Con el fin de investigar si ch-4C5 se une a la superficie HSP90, las células no fijadas MDA-MB-453 se incubaron con rec-4C5 o CH-4C5, mientras que en cultivo. Por lo tanto, los anticuerpos tuvieron acceso sólo a la superficie externa de las células. Después de la incubación, las células se procesaron para inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. La inmunotinción punctuate típico observado confirmó el marcaje de la superficie celular (Fig. 4A). Se obtuvieron resultados similares cuando se utiliza anti-HSP90α y mAb 4C5 (Fig. 4A). Es de destacar que de manera similar a mAb 4C5, CH-4C5, así como rec-4C5 también reconocen la piscina intracelular de HSP90 como se demostró por inmunofluorescencia después de la fijación y permeabilización de las células MDA-MB-453 (Fig. 4B). Por último, la unión de anticuerpos a vivir MDA-MB-453 células se controló a diversos intervalos de tiempo. Como se muestra en la Fig. 4C, de manera similar a mAb 4C5, 4C5 y rec-ch-4C5 no se internaliza y se mantuvo vinculado en la superficie celular para un máximo de 24 h en cultivo.
A. etiquetado de inmunofluorescencia de las células MDA-MB-453 utilizando tanto el rec-4C5 y 4C5-ch. La inmunomarcación marcan indica la piscina superficie de HSP90. Los controles negativos se realizaron utilizando un anticuerpo contra la proteína intracelular β tubulina (datos no mostrados). Barra de escala: 20 micras de detección de B. Inmunofluorescencia de HSP90 intracelular en células MDA-MB-453 fijaron, permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. Del mismo modo que el anticuerpo murino, rec-4C5 y 4C5-ch reconocen la piscina intracelular de HSP90. Barra de escala: 20 micras C. Para la detección de la internalización de anticuerpos, células vivas se incubaron con los anticuerpos para diversos intervalos de tiempo, a continuación, fijaron, permeabilizaron y marcado con fluorescencia. No internalización de mAb4C5, rec-4C5 y CH-4C5 se observa incluso después de 24 h de incubación. En contraste, el anticuerpo anti-HSP90α se pudo detectar intracelularmente después de 24 h de incubación. Barra de escala: 20 micras D. MDA-MB-453 lisados de células, se trataron con mAb 4C5, 4C5-rec, CH-4C5 y anti-HSP90α se analizaron por Western blot utilizando anticuerpos contra ErbB2, Akt, cRaf y HSP90α. La actina sirvió como control de carga. La presencia de mAb 4C5, 4C5 y rec-CH-4C5 no afectó los niveles de las quinasas en comparación con los controles. En contraste, el anticuerpo anti-permeable HSP90α celular redujo significativamente los niveles de ErbB2, Akt y cRaf.
El significado de-4C5 ch celular impermeabilidad se investigó mediante el control de los niveles de un subconjunto de HSP90 intracelular proteínas cliente. Hasta la fecha, más de 100 proteínas cliente de HSP90 intracelulares han sido identificados. inhibidores de HSP90 celulares permeable inducen la degradación de estas proteínas, ya que su estabilidad depende de la función de HSP90 intracelular [3]. Dado que nuestros datos sugieren que el mAb 4C5 y posteriormente rec-4C5 y 4C5 son CH-impermeable a las células, se analizó su capacidad para afectar a la estabilidad de los tres bien caracterizado proteínas cliente de HSP90, Akt, CRAF y ErbB-2. Después de la incubación de células MDA-MB-453 células con diferentes concentraciones de mAb 4C5, 4C5 y rec-CH-4C5, los niveles de Akt, cRaf y ErbB2 se controlaron mediante transferencia de Western. Como se muestra en la Figura 4D estos anticuerpos no afectaron a los niveles de estado estacionario de cualquiera de las quinasas estudiadas. En contraste, cuando las células se incubaron con la célula permeable anti-HSP90α, niveles de expresión de estas quinasas se redujeron significativamente (Fig. 4D).
ch-4C5 inhibe la invasión de células de cáncer
Estudios anteriores han demostrado que el mAb 4C5 inhibe MDA-MB-453 de cáncer de mama y B16 F10 invasión de células de melanoma en un ensayo de cicatrización de la herida [11], [21]. Con el fin de confirmar que ch-4C5 exhibe la misma propiedad funcional, se realizó un
in vitro
heridas curativas ensayos utilizando células cancerosas B16 F10 MDA-MB-453 y. Los cultivos de control se hicieron crecer en medio de cultivo, ya sea solo, o en medio de cultivo que contiene 200 mg /ml del anticuerpo BM88 irrelevante. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos tipos de controles que se utilizan. El valor medio de los dos tipos de control se consideró como 100% de cierre de la herida. Como se muestra en la Fig. 5A, B la presencia de CH-4C5 en el medio de cultivo redujo significativamente la extensión de MDA-MB-453 invasión de células cancerosas dentro de la brecha de migración después de 24 h, en comparación con los cultivos control. Más específicamente, la presencia de CH-4C5 resultó en una inhibición de 46% de cierre de la herida, que era similar a la obtenida cuando el anti-HSP90α, así como mAb 4C5 y rec-4C5 se incluyeron en el medio de cultivo (Fig. 5A ,SEGUNDO). Las barras en la Fig. 5B representan la media de tres experimentos independientes ± SEM. Dentro de un único experimento, cada condición se ensayó por triplicado. Se obtuvieron resultados similares utilizando células de melanoma B16 F10 y concentraciones crecientes de CH-4C5 que produjo una inhibición dependiente de la dosis de la invasión de células (Fig. 5C, D). Es importante tener en cuenta que en el ensayo de la curación el efecto de ch-4C5 está dirigida hacia la invasión de células y no la proliferación celular como se juzga mediante un ensayo MTT independiente de la herida (datos no mostrados). Esto está de acuerdo con los datos publicados previamente que demuestran que la presencia de mAb 4C5 en el medio de cultivo de B16 F10 [11] y MDA-MB-453 [21], no afecta a la proliferación celular, ya que se observó baja incorporación BrdU sin aparente las diferencias en la ausencia o presencia del anticuerpo.
a. Heridas ensayo de curación. Las fotografías representan imágenes de contraste de fase obtenidos a tiempo cero (panel izquierdo) y a las 24 h (panel derecho) después de la formación de cero, que muestra la migración de células MDA-MB-453 o bien en los cultivos control o culturas, incluyendo anti-HSP90α, mAb 4C5, reco- 4C5 o CH-4C5. Barra de escala: 200 micras. B. efecto cuantitativo de anticuerpos sobre el cierre de la herida. La adición de 200 mg /ml de anti-HSP90α y mAb 4C5 en el medio de cultivo dio como resultado una reducción de 48% y 55% de cierre de la herida, respectivamente, en comparación con cultivos de control que fueron considerados como el resultado en el cierre de heridas 100%. La adición de 200 mg /ml rec-4C5 y CH-4C5 en el medio de cultivo dio como resultado una inhibición de 46% y 46% de cierre de la herida, respectivamente. La significación estadística de las diferencias se evaluó mediante la prueba de la t de Student. La presencia de anti-HSP90α, mAb 4C5, 4C5 o rec-CH-4C5 tenía un efecto estadísticamente significativo sobre el cierre de la herida (p & lt; 0,01 en cada caso). C. imágenes de contraste de fase obtenidos a tiempo cero (panel izquierdo) y a las 24 h después de la formación de cero (panel derecho), que muestran B16 F10 invasión de células de melanoma en una herida ensayo de curación en presencia de 200 mg /ml de CH-4C5. Barra de escala: 200 micras. D. efecto cuantitativo de concentraciones crecientes de CH-4C5 en el nivel de invasión de células de melanoma B16 F10. La presencia de 50 mg /ml CH-4C5 resultó en la inhibición de 15% de la invasión, mientras que la adición de 100 mg /ml y 200 mg /ml ch 4C5 resultó en 21% y 43% de inhibición de la migración, respectivamente, en comparación con cultivos de control que eran considerado como el resultado en el cierre de heridas 100%. E. La visualización de las células muertas utilizando colorante azul de tripano. En 4C5 ch-cultivos tratados, la incidencia de muerte celular es similar a la observada en los cultivos de control. En contraste, en los cultivos tratados con el anticuerpo anti-HSP90α, un número mucho mayor de células se tiñen con azul de tripano, lo que indica una mayor incidencia de barra de escala la muerte celular, 30 micras. F. Control y CH-4C5 tratados se fijaron las células se permeabilizaron y se tiñeron con faloidina marcada con fluorescencia. barra de 40 micras de ampliación G. Superior mostrando tinción phalloidin (F-actina) escala. Ch-4C5 bloquea eficazmente la difusión de lamelipodia. Barra de escala: 16 micras
En este punto hay que señalar que el efecto inhibidor del anticuerpo anti-HSP90α en la tasa de invasión MDA-MB-453 estaba en gran parte debido al aumento de la muerte celular. a juzgar por la tinción con azul de tripano, que colores selectivamente las células muertas (Fig. 5E). Por el contrario, cuando los cultivos fueron tratados con mAb 4C5 y CH-4C5, la incidencia de la muerte celular fue similar a la observada en los cultivos de control (Fig. 5E). Este resultado apoya además que ch-4C5, en contraste con el anticuerpo anti-HSP90α permeable a las células, es impermeable a las células y no afecta a la piscina intracelular de HSP90, que es importante para la supervivencia celular.
Finalmente estos cultivos fueron examinados con respecto a la dinámica de actina reorganización utilizando faloidina marcada con fluorescencia. MDA-MB-453 células expuestas a ch-4C5 fueron menos propagación comparación con las células en los cultivos de control, y su morfología era indicativo de células no móviles. Por otra parte, cuando se visualizan con un aumento más alto, la lamellipodia en cultivos tratados fueron menos desarrollados y menos extendido en comparación con lamellipodia en cultivos de control (Fig. 5 F, G). Estos resultados están de acuerdo con los datos publicados anteriormente sobre el efecto de mAb 4C5 sobre actina reorganización y desarrollo lamelipodia [21].
CH-4C5 reduce la deposición metastásico MDA-MB-453 en los pulmones de SCID ratones
a continuación trató de investigar el
in vivo
efecto de ch-4C5 sobre el comportamiento metastásico de las células cancerosas MDA-MB-453. Para este propósito, MDA-MB-453 células se pretrataron o no con 200 mg /ml CH-4C5 y luego marcado con el colorante fluorescente DiO y se inyectaron por vía intravenosa en ratones SCID a través de la vena de la cola. Doce horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y los depósitos metastásicos de células MDA-MB-453 fueron identificados y evaluados en los pulmones de tanto el control y los grupos tratados-4C5 ch. Como se muestra en la Fig. 6A, se detectó una disminución significativa en la deposición de las células MDA-MB-453 en el ch-4C5 ratones tratados en comparación con los animales de control. Más específicamente, la cuantificación de la formación de depósitos metastásica mostró una inhibición 38% en el ch-4C5 ratones tratados en comparación con los ratones de control (Fig. 6B).
Control o CH-4C5 trataron células MDA-MB-453 fueron marcadas con el colorante fluorescente DiO y se inyecta en ratones SCID como se describe en Materiales y Métodos. La evaluación de los depósitos metastásicos se llevó a cabo varias horas más tarde. A. cryosections representativos de los pulmones de control y CH-4C5 ratones tratados. Las flechas muestran MDA-MB-453 células teñidas con DiO presente en el tejido pulmonar. Se observó una disminución significativa en la deposición de las células de cáncer en los pulmones de ratones tratados ch-4C5. Barra de escala: 100 micras B. efecto cuantitativo de ch-4C5 en el depósito metastásico de células MDA-MB-453 células en los pulmones, mostró una inhibición del 38% en comparación con los animales control. Las barras representan la media de dos experimentos independientes ± SEM. La significación estadística de las diferencias se analizaron por la prueba t de Student (p & lt; 0,01).
Discusión
En este estudio, se describe la clonación y secuenciación de un anticuerpo monoclonal murino anti-HSP90 , llamado mAb 4C5. Más importante aún, hemos demostrado que el mAb 4C5 no es una molécula de IgG convencional, sino que es completamente desprovisto de una cadena H y sólo consiste en un dímero de cadena ligera kappa. Este hallazgo fue apoyado inicialmente por electroforesis en SDS-PAGE bajo condiciones desnaturalizantes y condiciones no desnaturalizantes, lo que demuestra que el mAb 4C5 migra poco convencional en aproximadamente 26- y 50-kDa, respectivamente. Además, cuando el ARN total aislado de la línea celular de hibridoma mAb 4C5 productoras se sometió a hibridación de transferencia de Northern usando un ADNc de cadena H de la sonda radiomarcada IgG1, no se pudo detectar la radiactividad. De acuerdo con los resultados anteriores, cuando se intentó amplificar el ADNc de cadena H usando cebadores universales de ratón de cadena H que no pudimos aislar un producto de cadena H en todas las condiciones ensayadas. Por último, la naturaleza inusual de mAb 4C5 fue confirmado más allá de cualquier duda, ya que el kappa recombinante cadena L expresada en bacterias se demostró que mantener todas las propiedades del anticuerpo paterno, incluyendo unión al antígeno y
in vitro la inhibición de la
la invasión de células de cáncer.
Este anticuerpo monoclonal fue producida originalmente por la inmunización de ratones con una fracción de membrana derivado del cerebro de los 15 embriones de rata de un día [17], y se demostró que reconocen específicamente y se inhibir la función de durante los procesos de migración celular HSP90 superficie [8]. Además, mAb 4C5 ha demostrado reducir significativamente la tasa de invasión y metástasis de las células cancerosas. Más específicamente, se demostró que este anticuerpo inhibe la invasión de células de melanoma y metástasis [11], así como la interacción de HSP90 superficie con el dominio extracelular de ErbB-2, lo que lleva a la alteración de la señalización aguas abajo y, posteriormente, reducción de la tasa de
in vitro
la invasión de células de cáncer de mama [21]. Incluso más recientemente, Stellas et al. [14] proporcionan
e in vitro
in vivo
evidencia que muestra que el mAb 4C5 inhibe indirectamente la activación de pro-gelatinasas MMP-2 y MMP-9, necesaria para la invasión de las células cancerosas, y extravasación metástasis. Estos datos combinados apoyaron aún más la idea de que mAb 4C5 podría ser útil como un cáncer terapéutico y orientado nuestros estudios hacia la determinación de la secuencia de aminoácidos y la expresión recombinante de este anticuerpo.
Es bien conocido que los anticuerpos murinos han limitado utilizar para la terapia in vivo
In en seres humanos debido a su inmunogenicidad. En varios casos, este problema se ha superado el uso de enfoques de ingeniería genética para producir anticuerpos de ratón-humano y completamente humanizados quiméricos. Teniendo en cuenta la naturaleza no convencional de mAb 4C5 en combinación con el hecho de que durante el proceso de humanización de la afinidad del anticuerpo se reduce con frecuencia, el próximo reconstituyó el mAb murino 4C5 en una versión quimérica de ratón-humano funcional que, al igual que el anticuerpo paternal, se une a superficie HSP90, es impermeable a las células e inhibe la invasión de células de cáncer. El anticuerpo quimérico que fue diseñado por sustitución de la región Cκ- del anticuerpo murino paterno con el Ck-región humano correspondiente fue mostrado para retener la especificidad y afinidad del anticuerpo de ratón paterno.
ha sido generalmente aceptada concepto de que la molécula de anticuerpo requiere tanto la H y cadenas L para su plena actividad [27]. Por otra parte, la cadena H se cree que es el contribuidor dominante a la energía libre de unión mientras que la contribución de la cadena L se supone antígeno estar limitada [28], [29]. La última idea se ve apoyada por el hecho de que camélidos posee una clase de anticuerpos completamente funcionales completamente carente de cadenas L y que consiste en dímeros de cadena H [30], [31]. En el contexto de estos hallazgos, cadenas H solo, se mostró a interactuar con una variedad de antígenos de una manera específica (aunque con menor afinidad que los anticuerpos intactos), lo que ha llevado a la aplicación de anticuerpos de dominio único derivadas de las cadenas H [32] en la investigación, la biotecnología, así como la terapéutica humana. En el pasado, ha habido informes esporádicos de unión al antígeno de las cadenas L. Los primeros ejemplos de cadenas ligeras libres en cuestión inmmunoglobulin las denominadas proteínas de Bence-Jones. Estos se informaron como dímeros de cadena L expresadas por células de mieloma múltiple, recogidos de la orina de pacientes humanos [33]. Además, se encontraron grandes cantidades de cadenas L a acumularse en los fluidos y tejidos de pacientes con extracelulares secretoras de cadena L tumores [34]. Un dímero de cadena ligera kappa con especificidad de antígeno CD4 derivada de una línea celular de hibridoma fue descrito en 1987 por Ledbetter et al. [35] y en 1994 Mei Sun et al [36] informaron de que un purificada L-cadena de un anticuerpo monoclonal contra el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) que se muestra la secuencia específica y la unión a VIP alta afinidad. En consecuencia, Nishimura et al. [37] informó de la producción de una cadena ligera λ recombinante que presenta una actividad significativamente más alta de unión al antígeno en comparación con el anticuerpo intacto. Además, estos autores presentaron pruebas de que esta cadena ligera recombinante podría servir como un vehículo potencialmente útil para el uso clínico como la radio-inmuno y radio-inmunoterapia de los cánceres de pulmón. También se ha informado de que los dímeros de anticuerpos de cadena L producidos por un hibridoma de ratón reaccionan con los tejidos de melanoma humano [38]. En 1998 Pereira et al. [39] mostró que una secuencia variable de cadena única L contiene todos los determinantes de unión necesarios para la cardiolipina, con una afinidad similar a la del anticuerpo intacto. Más recientemente, Dubnovitsky et al. [40] informaron de que el recombinante V
L-dominio de un anticuerpo monoclonal contra la ferritina conserva su función de unión al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo parental de longitud completa.
En el presente trabajo se han demostrado que la CH-4C5 está completamente desprovisto de una cadena pesada y consiste en un dímero de cadena L. ch-4C5 tiene una alta actividad específica como se demostró por inmunotransferencia y de inmunofluorescencia experimentos utilizando células de cáncer de mama. Por otra parte y de manera similar al anticuerpo paterno ch-4C5 exhibe la función de bloqueo de las propiedades, a juzgar por el
in vitro
la cicatrización de heridas ensayo. Por último, el uso de un
in vivo
ensayo hemos demostrado que la CH-4C5 reduce la deposición metastásico de-453 MDA-MB células de cáncer de mama en los pulmones de ratones SCID.
Estos resultados proporcionan una nueva perspectiva para la aplicación clínica de los anticuerpos de cadena L en la terapéutica del cáncer. anticuerpos de cadena L recombinantes tienen un número de ventajas sobre los anticuerpos intactos y
anticuerpos V H cuando se destine a la terapéutica humana, la producción es decir relativamente fácil y reproducible, los procedimientos de control de calidad, y una eliminación más rápida de la circulación. Finalmente, desde un punto de vista clínico, HSP90 superficie proporciona un nuevo y diana de fármaco extracelular muy prometedor para el tratamiento eficaz del cáncer metastásico. En este contexto, la capacidad de los ch-4C5 para inhibir selectivamente la función de la piscina de la superficie de la HSP90, como lo indica la
in vitro
y
in vivo
datos presentados en el presente trabajo, sin interferir con la función intracelular HSP90, hace que este fragmento de anticuerpo de un cáncer potencial terapéutico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con el nacional e internacional directrices y fueron aprobados específicamente por el Comité ético del Instituto Pasteur Helénica (Permiso No: K /533, Veterinaria Dirección Distrito de Ática). Los ratones SCID se adquirieron originalmente de Jackson Laboratory, criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en la Unidad de Experimentación Animal del Instituto Pasteur Helénica.